长期镉暴露对大鼠肾纤维化的影响及葛根素的保护效应

Effects of long-term cadmium exposure on renal fibrosis in rats and the protective effect of puerarin

摘要

目的 为探究长期镉暴露对大鼠肾纤维化的影响以及葛根素的保护效应。 方法 将24只雄性SD大鼠随机分为对照组（Cont group）、葛根素组（PU group）、镉组（Cd group）、镉与葛根素共处理组（Cd+PU group），其中50 mg/L醋酸镉用作自由饮水处理，200 mg/（kg·d）葛根素进行灌胃处理，持续24周。试验结束后，检测大鼠肾脏指数、肾脏镉含量、肾小管功能，肾脏病理组织学，肾脏抗氧化能力、肾纤维化相关因子表达水平等指标变化。 结果 镉暴露导致大鼠肾脏指数显著升高（P<0.05），肾脏镉含量极显著升高（P<0.01），尿液β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性极显著升高（P<0.01），肾组织丙二醛（MDA）含量极显著升高（P<0.01），肾组织超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化能力（T-AOC）水平显著降低（P<0.05），肾纤维化相关基因（TGH-β、α-SMA、Colla-gen1、MMP2）和蛋白（TGH-β、α-SMA、Colla-gen1）表达水平极显著升高（P<0.01）；镉与葛根素共处理组上述损伤明显减轻。 结论 长期镉暴露会造成大鼠肾脏纤维化损伤，葛根素可以通过提高肾脏抗氧化能力改善镉暴露引起的大鼠肾纤维化，从而在镉致肾毒性损伤中发挥保护效应。

Abstract

Objective To study the effects of long-term cadmium exposure on renal fibrosis in rats and the protective effect of puerarin. Method 24 male SD rats were randomly divided into control group，puerarin group，cadmium acetate group and cadmium and puerarin co-treatment groups. Cadmium acetate （50 mg/L） was treated for free drinking water and puerarin （200 mg/（kg·d）） was treated for intragastric administration. After 24 weeks of treatment，changes in renal index，renal cadmium content，renal tubule function，renal histopathology，renal antioxidant perforcapacity，and the expression levels of renal fibrosis related factors were determined. Result Cadmium exposure resulted in a significant increase in renal index （P<0.05），the tissue cadmium content and malondialdehyde （MDA） content，urinary β-n-acetylglucosa minidase （NAG） expression level were significantly increased（P<0.01）. Cadmium exposure significantly decreased the expression levels of superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity （T-AOC） （P<0.05），and promoted the transcriptions and expressions of renal fibrosis related genes.The above-mentioned apparently alleviated by co-treatment with puerarin. Conclusion This study indicates that long-term cadmium exposure leads to renal fibrotic damage in rats，puerarin can increase the antioxidant capacity of the kidney and then ameliorate cadmium exposure-induced renal fibrosis，thus exerting a protective effect in cadmium nephrotoxicity.

Graphical abstract

关键词

镉 / 大鼠肾脏 / 纤维化 / 葛根素 / 保护效应

Key words

cadmium / rat kidney / fibrosis / puerarin / protective effect

镉（cadmium，Cd）是一种严重危害人类和动物健康的环境污染物，在自然界中广泛分布^［1］。镉的主要人为来源包括有色金属生产、化石燃料燃烧、化肥制造和工业废物焚烧等，可通过吸入、食入和皮肤接触进入人体，造成多器官毒性作用^［2］。肾脏是镉中毒的主要靶器官^［3］，长期镉暴露可通过多种机制引起急性肾损伤（AKI）和慢性肾脏疾病（CKD），包括活性氧（ROS）的过量生成、细胞抗氧化防御系统的耗竭以及N⁺/K⁺ ATP酶等多种转运蛋白的降解^［4-7］。此外，研究发现长期镉暴露可以通过加速肾脏纤维化而导致肾衰竭^［8］。动物机体长期暴露于镉会改变纤维化介质的表达，导致肾脏的纤维化组织病理学改变^［9］。

肾纤维化的特征是细胞外基质（ECM）在间质过度沉积，最终导致瘢痕形成和慢性肾脏疾病^［10］。肾小管上皮细胞损伤引起部分上皮细胞向间充质转变，损害肾小管修复和再生功能，诱导细胞周期阻滞，并驱动间质成纤维细胞激活^［10］。前期研究发现镉会诱导大鼠肾小管上皮细胞损伤，通过氧化应激控制的复杂细胞内信号通路诱导肾毒性^［11-13］。因此，有效的抗氧化剂被认为是改善镉诱导肾毒性的潜在治疗策略。葛根素（Puerarin，PU）是一种从葛根中提取的植物异黄酮，可以在不同类型刺激引起的AKI或CKD中发挥积极作用^{［14，15］}。

本研究通过体内试验探究长期镉暴露对大鼠肾纤维化的影响及葛根素的保护作用，通过检测大鼠肾脏指数、肾脏镉含量、肾小管功能，肾脏病理组织学，肾脏抗氧化能力、肾纤维化相关因子表达水平等指标变化，探讨长期镉暴露是否会加速肾脏纤维化进程以及葛根素是否具有干预作用，为防控镉的毒性损伤提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组处理及样品采集

选取21日龄断奶雄性SD大鼠预饲喂7 d，体质量为150 g左右，由扬州大学实验室动物中心提供。随机分成4组，每组6只，每天分别做如下处理。对照组：自由饮用超纯水。葛根素组：每天灌胃葛根素200 mg/kg体质量^［16］。镉组：自由饮用含有50 mg/L醋酸镉的超纯水，镉浓度参考以往试验和文献^［16-17］。镉+葛根素组：每天灌胃葛根素200 mg/kg 体质量1个月，然后自试验第一天起自由饮用含有50 mg/L醋酸镉的超纯水。

在试验期间，所有动物均自由采食和饮水，连续镉暴露24周。试验结束后，所用动物采集尿液进行NAG、β2微球蛋白含量检测后，经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后处死并解剖。每只大鼠的右侧肾脏立即保存在-80 ℃；一部分通过qRT-PCR进行基因表达分析，另一部分用于氧化应激相关参数测定，包括丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化能力（T-AOC）。左侧肾脏一部分进行肾组织镉含量检测，另一部分浸泡于固定液中，进行HE染色、Masson染色和免疫组化。本研究经扬州大学动物护理与使用委员会批准，按照国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》进行，许可证编号为202207008。

1.2 主要试剂

葛根素、醋酸镉（Sigma）； NAG、β2微球蛋白含量、MDA、SOD、T-AOC检测试剂盒 （南京建成生物工程研究所）。其余试剂均为国产分析纯级。

1.3 肾脏系数的计算

试验结束后，供试动物均经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后脱颈处死后，摘取肾脏，剥离被膜后，称取双侧肾赃重量，计算肾脏系数。

肾脏系数=\frac{\mathrm{肾脏}\mathrm{质量}(\mathrm{g})}{\mathrm{体质}(\mathrm{g})}\times \mathrm{100}

1.4 qRT-PCR检测纤维化相关基因

根据制造商的说明和标准方法，使用TRIzol（Invitrogen）从肾脏组织中提取RNA，并使用反转录试剂盒（Vazyme）将其转化为cDNA。每个样品用3个重复样品进行分析，用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）制备20 μL的反应混合物。使用2^-∆∆Ct方法计算目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.5 肾组织镉含量测定

取肾组织样品约400 mg，80 ℃烘干48 h后加入3.0 mL浓硝酸。然后用微波消解仪进行样品消解，消解后将其置于150 ℃进行赶酸，直至消化液接近无色透明，冷却至室温，用超纯水定容至10 mL，采用原子吸收光谱法测定镉含量。

1.6 肾组织病理切片HE和Masson染色

肾脏样本用4%多聚甲醛固定，脱水后进行包埋、冷却、切片。采用苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色观察病理学变化。采用Masson染色观察组织纤维化情况。

1.7 免疫组织化学法检测纤维化相关蛋白水平

石蜡包埋大鼠肾切片（5 μm厚）烘箱加热1 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化10 min，浸入柠檬酸工作液（pH 6.0），微波20 min，然后冷却至室温。切片在室温下用牛血清白蛋白密封30 min，并在4 ℃下与α-SMA（#19245，CST）、collagen I（ab270993，abcam）和TGF-β（ab215715，abcam）的一抗1：200稀释孵育过夜。PBS洗涤后，将切片与二抗在37 ℃孵育30 min，用二氨基联苯胺溶液（ZSGB-BIO，北京，中国）染色显色，并用苏木精复染5 min。随后，将切片脱水并干燥用于光学显微镜观察。

1.8 数据统计与分析

统计结果以“\overline{x}±s”表示，应用SPSS 22.0 统计软件进行单因素方差（one-way ANOVA）分析和t检验进行组间比较。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 镉和葛根素对大鼠肾脏系数的影响

试验结束后，统计各组大鼠肾脏系数。结果见图1，对照组与葛根素组肾脏系数无明显变化（P>0.05）。与对照组相比镉组大鼠肾脏系数显著增加（P<0.05），提示肾脏可能发生水肿，增生或纤维化。与镉组相比，共处理组大鼠肾脏系数显著降低（P<0.05）。

2.2 镉和葛根素对大鼠肾组织中镉含量的影响

长期镉暴露情况下，肾脏是镉蓄积的主要靶器官。肾组织中镉含量见图2，与对照组相比，镉组大鼠肾组织中有明显的镉元素蓄积（P<0.01）。与镉组相比，共处理组大鼠肾组织中镉含量显著降低（P<0.05），说明预饲喂葛根素能减少镉元素在肾脏内的蓄积。

2.3 镉和葛根素对大鼠肾小管功能的影响

大鼠尿中β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）和β2微球蛋白含量见图3。结果显示，对照组和葛根素组之间的NAG和β2微球蛋白含量没有显著差异（P>0.05）。与对照组相比，镉组尿液中NAG含量显著升高（P<0.01），β2微球蛋白含量有上升趋势但无显著差异（P>0.05）。与镉组相比，共处理组大鼠尿液中NAG和β2微球蛋白含量显著降低（P<0.05）。提示葛根素能缓解长期镉暴露诱导的肾小管功能障碍。

2.4 镉和葛根素对大鼠肾组织病理的影响

病理组织学检查见图4，结果显示，对照组与葛根素组大鼠肾小球形态规则，肾小管排列整齐，间质正常，未见炎性细胞浸润。但镉组大鼠肾小管变性，管腔扩张或狭窄，肾间质有红细胞和炎性细胞浸润，肾小球形态不规则，球囊粘连（黑色箭头）。镉与葛根素共处理组，上述病变显著减轻。

Masson染色结果显示，对照组与葛根素组有少量胶原蛋白沉积（蓝色）。但镉组大鼠胶原沉积阳性面积增大。与镉组相比，镉与葛根素共处理组胶原沉积面积减少。

2.5 镉和葛根素对大鼠肾组织抗氧化性能的影响

研究表明镉的肾毒性与氧化应激密切相关。大鼠肾脏组织MDA、SOD和T-AOC含量见图5。结果显示，对照组和葛根素组之间的MDA、SOD和T-AOC含量没有显著差异（P>0.05）。但与对照组相比，镉组肾脏组织中MDA含量显著升高（P<0.01），SOD和T-AOC水平显著降低（P<0.01）。与镉组相比，共处理组大鼠肾脏组织中MDA含量显著降低（P<0.01），而SOD和T-AOC水平显著升高（P<0.05）。

2.6 镉和葛根素对大鼠肾组织纤维化相关基因表达的影响

肾组织纤维化相关基因TGF-β、α-SMA、Collagen I和MMP2表达水平如图6所示。与对照组相比，镉组TGF-β、α-SMA、Collagen I和MMP2基因表达水平显著升高（P <0.01），在热图上，纤维化相关基因的mRNA水平明显突出；共处理组与镉组相比，TGF-β、α-SMA、Collagen I和MMP2基因表达水平显著下降（P<0.01）。对照组和葛根素单独处理组相比，TGF-β、α-SMA、Collagen I和MMP2基因表达变化均不显著（P>0.05）。

2.7 镉和葛根素对大鼠肾组织维化相关蛋白表达的影响

肾组织纤维化相关蛋白TGF-β、α-SMA和Collagen I表达水平如图7所示。与对照组相比，镉组TGF-β、α-SMA和Collagen I蛋白阳性区域增加（Image J统计）；共处理组与镉组相比，TGF-β、α-SMA和Collagen I蛋白阳性区域减少。对照组和葛根素单独处理组相比，TGF-β、α-SMA和Collagen I蛋白阳性区域变化不显著。

3 讨论

镉是一种具有多组织多器官毒性的重金属污染物^［2］。肾脏是机体镉蓄积主要的靶器官，主要导致肾脏急性和慢性镉中毒^［18］。目前，很多研究报道了急性镉中毒对肾脏的损伤机制，然而长期镉暴露引起慢性镉的肾脏毒性机制尚未被完全阐明。肾纤维化是慢性肾脏疾病发展的最终表现。本研究以SD大鼠为研究模型，探讨长期镉暴露对大鼠肾毒性、抗氧化性能和纤维化的影响以及葛根素的保护作用。

多项研究报道了镉引起的肾损伤特征，在不同的处理时间下通过口服和腹腔、皮下或静脉注射的方式构建镉暴露模型，肾脏呈现不同的组织学损害，肾小球收缩、肾小管扩张和肾小管上皮肥大等^{［8，19，20］}。镉的肾毒性机制已被部分阐明，包括活性氧诱导的氧化性DNA损伤、p53引发的肾梗阻、抑制Na⁺依赖的葡萄糖转运蛋白和抑制Na⁺ K⁺-ATP酶^［8，19］。肾脏中的镉主要沉积在近端肾小管细胞中，急性镉暴露可以导致肾小管细胞凋亡或坏死，慢性镉暴露可能导致肾功能障碍，进而诱导肾纤维化和肾衰竭^［21-23］。前期研究发现葛根素治疗可以改善亚急性镉中毒导致的肾功能和结构损伤，改善肾近端肾小管上皮细胞凋亡和肾小球损伤^［16］。本研究发现长期镉暴露会导致肾脏指数升高，指示肾组织发生炎症和纤维化。镉暴露引起大鼠肾小管变性，管腔扩张或狭窄，大鼠尿液肾损伤标志物NAG显著升高，表明镉暴露引起大鼠肾组织毒性损伤。天然产物通过清除自由基和调节抗氧化防御系统对重金属介导的损伤发挥保护作用。葛根素可以显著减少镉在肾脏的蓄积，恢复肾脏的正常结构形态和功能，表明葛根素对长期镉诱导的肾毒性具有保护作用。

镉可以损害抗氧化防御系统进而引起氧化应激，这被认为是急性或慢性镉暴露最重要的肾脏损伤机制。抗氧化系统主要包括酶促（SOD、GSH-PX、CAT等）和非酶促（维生素、氨基酸、金属蛋白质等）两个体系，体系内各成分在受刺激时相互协同发挥作用。研究表明，在长期镉暴露过程中，酶促抗氧化剂表达量减少，脂质过氧化产物水平增加，引起机体氧化与抗氧化水平失衡。本研究通过检测T-AOC评价抗氧化体系，结合MDA与SOD含量的变化进行分析，结果发现长期镉暴露可以导致大鼠肾组织发生严重的氧化应激，而具有抗氧化作用的葛根素可以通过提高大鼠肾组织的抗氧化能力减轻镉对大鼠肾组织的氧化损伤。

慢性肾病是严峻的全球公共健康问题，终末期肾病是各种慢性肾脏疾病的终末阶段^［24］。以细胞外基质过度合成、积累和重塑为特征的肾纤维化是终末期肾病的常见病理特征，最终可以发展为肾衰竭^{［25，26］}。研究表明TGF-β1通过刺激肌成纤维细胞分化、细胞外基质沉积和肾脏上皮-间质转化（EMT）的进程，加速肾小球硬化和肾小管间质纤维化的发展^［27］。肌成纤维细胞标志物α-SMA上调是EMT的特征^［28］，经历EMT的细胞并不直接产生Collagen I，而是通过EMT相关分泌表型激活成纤维细胞来驱动Collagen I的产生，说明上皮细胞损伤是肾纤维化的主要驱动因素^{［29，30］}。多项研究发现镉暴露引起的肾小管上皮细胞损伤与肾纤维化之间存在紧密的联系^{［1，18，21］}。镉还可以过度激活EMT，损害肾过滤屏障^［1，31］。本研究发现长期镉暴露可以显著提升大鼠肾组织中TGF-β、α-SMA、Collagen I和MMP2基因表达和TGF-β、α-SMA和Collagen I蛋白表达水平，结合Masson染色结果，说明长期镉暴露可以加速大鼠肾组织纤维化进程。葛根素可以下调TGF-β、α-SMA、Collagen I和MMP2基因和TGF-β、α-SMA和Collagen I蛋白表达水平，说明其可以通过抗氧化作用在镉致肾纤维化过程中有一定保护效应。

4 结论

长期镉暴露会导致大鼠肾脏出现纤维化损伤，其毒性机制与镉引起的氧化损伤密切相关。葛根素通过提高抗氧化能力减轻肾脏氧化应激，进而对镉诱导的肾纤维化进程和肾功能障碍有较好的干预作用，该结果为葛根素用于预防和治疗镉致肾纤维化提供了新的依据。

参考文献

[1] Joardar S， Dewanjee S， Bhowmick S，et al.Rosmarinic acid attenuates cadmium-Induced nephrotoxicity via inhibition of oxidative stress，apoptosis，inflammation and fibrosis［J］.Int J Mol Sci，2019，20（8）：2027.

[2] Genchi G， Sinicropi M S， Lauria G，et al.The effects of cadmium toxicity［J］.Int J Environ Res Public Health，2020，17（11）：3782.

[3] Wu H， Liao Q， Chillrud S N，et al.Environmental exposure to cadmium：health risk assessment and its associations with hypertension and impaired kidney function［J］.Sci Rep，2016，6：29989.

[4] Lentini P， Zanoli L， Granata A，et al.Kidney and heavy metals-The role of environmental exposure （Review）［J］.Mol Med Rep，2017，15（5）：3413-3419.

[5] Satarug S， Ruangyuttikarn W， Nishijo M，et al.Urinary cadmium threshold to prevent kidney disease development［J］.Toxics，2018，6（2）：26.

[6] Wang S H， Shih Y L， Lee C C，et al.The role of endoplasmic reticulum in cadmium-induced mesangial cell apoptosis［J］.Chem Biol Interact，2009，181（1）：45-51.

[7] Ferraro P M， Costanzi S， Naticchia A，et al.Low level exposure to cadmium increases the risk of chronic kidney disease：analysis of the NHANES 1999-2006［J］.BMC Public Health，2010，10：304.

[8] Tsutsumi T， Ishihara A， Yamamoto A，et al.The potential protective role of lysophospholipid mediators in nephrotoxicity induced by chronically exposed cadmium［J］.Food Chem Toxicol，2014，65：52-62.

[9] Liang L， Huang K， Yuan W，et al.Dysregulations of miR-503-5p and Wnt/β-catenin pathway coordinate in mediating cadmium-induced kidney fibrosis［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2021，224：112667.

[10] Zhou D， Liu Y.Renal fibrosis in 2015：Understanding the mechanisms of kidney fibrosis［J］.Nat Rev Nephrol，2016，12（2）：68-70.

[11] Dong W， Liu G， Zhang K，et al.Cadmium exposure induces rat proximal tubular cells injury via p62-dependent Nrf2 nucleus translocation mediated activation of AMPK/AKT/mTOR pathway［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2021，214：112058.

[12] Dong W， Yan L， Tan Y，et al.Melatonin improves mitochondrial function by preventing mitochondrial fission in cadmium-induced rat proximal tubular cell injury via SIRT1-PGC-1α pathway activation［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2022，242：113879.

[13] Luo T， Yu Q， Dong W，et al.Effect of cell cycle synchronization on cadmium-induced apoptosis and necrosis in NRK-52E cells［J］.Cell Cycle，2020，19（23）：3386-3397.

[14] Zhu Q， Yang S， Wei C，et al.Puerarin attenuates diabetic kidney injury through interaction with Guanidine nucleotide-binding protein Gi subunit alpha-1 （Gnai1） subunit［J］.J Cell Mol Med，2022，26（14）：3816-3827.

[15] Liu C M， Ma J Q， Sun Y Z.Puerarin protects rat kidney from lead-induced apoptosis by modulating the PI3K/Akt/eNOS pathway［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2012，258（3）：330-342.

[16] 龙梦菲.葛根素对镉致大鼠肾脏损伤的保护效应［D］.扬州：扬州大学，2018．

[17] Dong W， Zhang K， Gong Z，et al.N-acetylcysteine delayed cadmium-induced chronic kidney injury by activating the sirtuin 1-P53 signaling pathway［J］.Chem Biol Interact，2023，369：110299.

[18] Yan L J， Allen D C.Cadmium-Induced Kidney Injury：Oxidative Damage as a Unifying Mechanism［J］.Biomolecules，2021，11（11）：1575.

[19] Jihen el H， Imed M， Fatima H，et al.Protective effects of selenium （Se） and zinc （Zn） on cadmium （Cd） toxicity in the liver and kidney of the rat：histology and Cd accumulation［J］.Food Chem Toxicol，2008，46（11）：3522-3527.

[20] Tripathi S， Srivastav A K.Cytoarchitectural alterations in kidney of Wistar rat after oral exposure to cadmium chloride［J］.Tissue Cell，2011、43（2）：131-136.

[21] Rani A， Kumar A， Lal A，et al.Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity：a review［J］.Int J Environ Health Res，2014、24（4）：378-399.

[22] Kim K S， Lim H J， Lim J S，et al.Curcumin ameliorates cadmium-induced nephrotoxicity in Sprague-Dawley rats［J］.Food Chem Toxicol，2018，114：34-40.

[23] Johri N， Jacquillet G， Unwin R.Heavy metal poisoning：the effects of cadmium on the kidney［J］.Biometals，2010，23（5）：783-792.

[24] Morizane R， Fujii S， Monkawa T，et al.miR-34c attenuates epithelial-mesenchymal transition and kidney fibrosis with ureteral obstruction［J］.Sci Rep，2014，4：4578.

[25] Piersma B， Bank R A， Boersema M.Signaling in Fibrosis：TGF-β，WNT，and YAP/TAZ Converge［J］.Front Med （Lausanne），2015，2：59.

[26] Wang Y， Liu N， Su X，et al.Epigallocatechin-3-gallate attenuates transforming growth factor-β1 induced epithelial-mesenchymal transition via Nrf2 regulation in renal tubular epithelial cells［J］.Biomed Pharmacother，2015，70：260-267.

[27] Chuang P Y，Menon M C，He J C.Molecular targets for treatment of kidney fibrosis［J］.J Mol Med （Berl），2013，91（5）：549-559.

[28] Zhao X，Lu Y，Nie Y，et al.MicroRNAs as critical regulators involved in regulating epithelial- mesenchymal transition［J］.Curr Cancer Drug Targets，2013，13（9）：935-944.

[29] Grgic I，Campanholle G，Bijol V，et al.Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis［J］.Kidney Int，2012、82（2）：172-183.

[30] Liu B C，Tang T T，Lv L L，et al.Renal tubule injury：a driving force toward chronic kidney disease［J］.Kidney Int，2018，93（3）：568-579.

[31] Chen J，Du L，Li J，et al.Epigallocatechin-3-gallate attenuates cadmium-induced chronic renal injury and fibrosis［J］.Food Chem Toxicol，2016，96：70-78.

基金资助

国家自然科学基金项目(31872533)