近年来,随着我国肉鸡养殖业发展规模不断壮大,发展速度不断加快,肉鸡产业已渐渐成为畜牧业产业中支柱产业。我国是鸡肉消费大国,年平均消费量略低于猪肉,但随着人们对饮食健康越来越注重,作为低脂肪高蛋白的鸡肉制品的消费量将呈现持续增长趋势,而抗生素禁用后对肉鸡养殖提出新的挑战,中草药作为潜在的抗生素替代品成为新的研究热点。中草药在种植过程中产生了大量的废弃物,如茎、叶和须根等,而这些废弃物中含有微量的营养物质和较高活性物质,对动物生产和免疫具有一定的益处。习南等
[1]研究发现在雏鸡日粮中添加黄芪茎叶超微粉可以提高雏鸡的免疫器官指数。何国耀等
[2]研究发现,将党参茎叶添加蛋鸡饲料中,可以提高蛋鸡生产性能,降低蛋黄中的胆固醇含量。武志勇等
[3]研究发现在鸡饲料中添加党参茎叶黄芪粉可以增强免疫功能。闫如霞等
[4]研究发现将板蓝根、大青叶、青黛配伍按不同的浓度加入肉鸡饲粮中可以提高肉鸡的生产性能。本试验在肉鸡基础饲粮中以单独和不同比例的配伍形式混合添加药理作用相似的黄芪、党参地上部分,研究其对生产性能、免疫性能、抗氧化性能及肠道健康的影响,为中草药在家禽健康养殖领域的应用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
肉仔鸡苗为科宝505白羽肉鸡,购自宝鸡华龙牧业集团有限公司种鸡场。黄芪和党参茎叶均采自甘肃省临夏市,经阴干后制成粉末,备用。
1.2 试验设计与管理
选取432只1日龄健康的科宝505白羽肉仔鸡,随机分为6个组,每个组设6个重复,每个重复12只鸡,试验期为42 d。各分组情况如
表1所示。肉鸡饲养试验在甘肃省武威市民勤县某养殖场进行。采用笼养方式进行饲养,每个组重复的安排考虑位置效应。试验前对1日龄肉仔鸡进行检查,并按照规定的程序进行免疫,消毒,称量体质量。在试验过程中,每日投喂2次,自由采食和饮水。
1.3 饲粮组成及营养水平
试验期饲粮配制参考我国《鸡饲养标准 NY/T 33-2004》,试验采用玉米-豆粕-杂粕型饲粮,其组成及营养水平见
表2。
1.4 测定指标及方法
1.4.1 血清抗氧化指标的测定
在试验第42天时,以组为单位选取体质量相近的6只鸡,分别翅下静脉采血5 mL,3 000 r/min低温离心10 min,将分离的血清分装于2 mL离心管中,-20 ℃保存。由北京华英生物技术研究所测定血清抗氧化指标:总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(SOD)、超氧化物歧化酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)。
1.4.2 血清生化指标的测定
于试验第42天时,以组为单位选取体质量相近的6只鸡,分别翅下静脉采血5 mL,3 000 r/min低温离心10 min,将分离的血清分装于2 mL离心管中,-20 ℃保存。由北京华英生物技术研究所测定血清抗氧化指标:总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、尿氮(UN)、谷草转氨酶(ASL)、谷丙转氨酶(ALT)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。
1.4.3 肠道健康的测定
1.4.3.1 肠道形态的测定
在试验第42天时,每组随机选取6只鸡,屠宰后将肠道分离,取十二指肠、空肠、回肠中段4 cm,用镊子夹住肠组织的一边,用生理盐水冲洗肠道内容物,冲洗干净后保存于装有4%的多聚甲醛溶液管中固定,将固定好的肠道组织送往成都里来医学实验中心进行HE染色。切片制作好后用光学显微镜观察,随机选择多个具有代表性的视野,在视野中测定肠道平均绒毛高度、隐窝深度,并计算绒毛高度与隐窝深度的比值。
1.4.3.2 肠道屏障功能相关基因mRNA表达量的测定
试验结束时,以组为单位选取接近平均体质量的6只鸡,每个重复选一只鸡,取空肠中段约5 cm长,装入冻存管,放入液氮中,在-80 ℃下保存。选用实时荧光定量PCR测定肉鸡空肠紧密连接蛋白(
ZO-1、
Occluding和
Claudin-1)的mRNA表达量。首先对样品中的总RNA进行抽提,再将浓度和纯度合适的RNA进行反转录,以β-actin为内参基因,引物由派森诺(上海)生物科技股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt方法计算基因的表达量。基因引物序列见
表3,PCR反应体系见
表41.4.3.3 肠道菌群的测定
根据本试验结果,对Ⅰ组和Ⅴ组肉鸡盲肠内容物样品进行送检,由上海派森诺生物科技股份有限公司对送检的样品进行16S rDNA测序,基于Illumina平台对群落DNA片段进行双端测序,对肉鸡盲肠内容物微生物菌群进行分析。
1.5 数据统计与分析
试验数据分析用Excel 2010进行整理,然后用SPSS 26.0 one-way ANOVA方法进行单因素方差分析,利用Duncan’s法进行多重比较检验,试验结果用表示,P<0.05表示差异显著。微生物有关数据采用QIIME2软件、R软件及LEfSe软件等进行分析。
2 结果与分析
2.1 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡血清抗氧化指标的影响
由
表5可知,Ⅳ组、Ⅴ组SOD活性显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅵ组(P<0.05),Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅵ组SOD活性显著高于Ⅱ组(
P<0.05);Ⅱ组、Ⅴ组、Ⅵ组T-AOC显著高于Ⅳ组(
P<0.05),各组的GSH-Px和MDA含量无显著性差异(
P>0.05)。
2.2 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡血清生化指标的影响
由
表6可知,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组血清中TC、TG含量显著低于Ⅰ组(
P<0.05),Ⅲ组、Ⅵ组血清中UN含量显著高于Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组(
P<0.05),各组的血清中的TP、ALB、GLU、AST、ALT、HDL、LDL含量无显著性差异(
P>0.05)。
2.3 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡肠道健康的影响
2.3.1 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡肠道形态结构的影响
由
表7可知,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组十二指肠的绒毛长度显著高于Ⅰ组(
P<0.05),Ⅳ组和Ⅴ组十二指肠的绒毛长度显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组(
P<0.05);Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组十二指肠的隐窝深度显著高于Ⅰ组(
P<0.05),Ⅳ组和Ⅵ组十二指肠的隐窝深度显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(
P<0.05);Ⅰ组十二指肠绒毛高度/隐窝深度值显著高于Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组(
P<0.05),Ⅴ组十二指肠绒毛高度/隐窝深度值显著高于Ⅲ组和Ⅵ组(
P<0.05);Ⅴ组空肠的绒毛长度显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅵ组(
P<0.05),Ⅳ组空肠的绒毛长度显著高于Ⅱ组和Ⅵ组(
P<0.05),Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅵ组空肠的绒毛长度显著高于Ⅱ组(
P<0.05);Ⅴ组空肠的隐窝深度显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅵ组(
P<0.05),Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅳ组空肠的隐窝深度显著高于Ⅱ组和Ⅳ组(
P<0.05),Ⅵ组空肠的隐窝深度显著高于Ⅱ组(
P<0.05);Ⅱ组、Ⅵ组空肠绒毛高度/隐窝深度值显著高于Ⅲ组、Ⅴ组(
P<0.05);Ⅳ组、Ⅴ组回肠的绒毛长度显著高于Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅵ组(
P<0.05);Ⅰ组、Ⅳ组、Ⅴ组回肠的隐窝深度显著高于Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅵ组(
P<0.05),Ⅱ组回肠的隐窝深度显著高于Ⅵ组(
P<0.05);Ⅵ组回肠绒毛高度/隐窝深度值显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组(
P<0.05),Ⅱ组回肠绒毛高度/隐窝深度值显著高于Ⅲ组(
P<0.05)。
2.3.2 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡肠道屏障相关基因mRNA表达量的影响
由
图1可知,Ⅴ组
Claudin mRNA的表达水平显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组(
P<0.05);由
图2可知,Ⅴ组
ZO-1 mRNA的表达水平显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组(
P<0.05);由
图3可知,各组的
Occludin mRNA的表达水平无显著性差异(
P>0.05)。
2.3.3 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡盲肠菌群的影响
饲粮中添加2%的黄芪和1%的党参茎叶粉对肉鸡盲肠微生物Alpha多样性如
表8所示,Ⅰ组和Ⅴ组的覆盖率均在0.99以上,说明每组数据能准确反映肉仔鸡盲肠菌群情况。与Ⅰ组相比,Ⅴ组Chao1指数显著高于Ⅰ组(
P<0.05),Ⅴ组实际存在的物种数比Ⅰ组多。
2.3.4 肉仔鸡盲肠微生物Beta多样性分析
Beta多样性指数是对样本中物种不同生存环境多样性的对比。由
图4可知,第一主成分的贡献率为24.2%,第二主成分的贡献率为14.1%,Ⅰ组和Ⅴ组间的样本距离较近,群落结构相似性差异较小。Ⅰ组各样本之间的距离较近,说明样本之间物种组成结构相似,群落组成的相似度高,Ⅴ组各样本之间的距离较近,说明饲粮添加2%的黄芪和1%党参茎叶粉各样本之间物种组成结构相似。
2.3.5 肉仔鸡盲肠微生物菌群物种组成分析
从门水平上对肉仔鸡盲肠微生物菌群物种组成进行分析,结果如
图5所示,在门水平上相对丰度前10的菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)、互养菌门(Synergistetes)、蓝藻(Cyanobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、迷踪菌门(Elusimicrobia)等。Ⅰ组和Ⅴ组的优势菌门是厚壁菌门(Firmicutes)(62.99%、54.22%)和拟杆菌门(Bacteroidetes)(16.87%、16.13%)厚壁菌门的相对丰度最高,约占一半,说明厚壁菌门(Firmicutes)在肉仔鸡盲肠微生物菌群发育中起到重要的作用。
在属水平上对肉仔鸡盲肠微生物菌群物种组成进行分析,结果如
图6所示,在属水平上相对丰度前10的菌门为阿克曼菌属(
Akkermansia)、考拉杆菌属(
Phascolarctobacterium)、瘤胃球菌属(
Ruminococcus)、颤螺菌属(
Oscillospira)、脱硫弧菌(
Desulfovibrio)、拟杆菌属(
Bacteroides)、巴恩斯氏菌(
Barnesiella)、普拉梭菌(
Faecalibacterium)、瘤胃球菌属(
Ruminococcus)、乳杆菌属(
Lactobacillus)等。Ⅰ组和Ⅴ组的优势菌门是阿克曼菌属(
Akkermansia,9.32%、17.45%)和考拉杆菌属(
Phascolarctobacterium)(5.54%、7.79%)。
2.3.6 肉仔鸡盲肠微生物物种差异分析
LEfSe分析可以找到各个分组之间的标志物种。由
图7可知,Ⅰ组和Ⅴ组相比,Ⅴ组有显著差异的物种是气单胞菌目(Aeromonadales)、拟杆菌门S24_7(
S24_7)、高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、高温放线菌属(
Thermoac⁃tinomyces)、颤螺菌属(
Oscillospira)、琥珀酸弧菌属(
Succinivibrio)、Ⅰ组有显著差异的物种是放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌目(Actinomycetales)、
AF12。
3 讨论
3.1 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡血清抗氧化指标的影响
SOD、GSH-Px都是动物体内存在的抗氧化剂,MDA是重要的脂质过氧化物,总抗氧化能力的高低体现了机体抗氧化能力的总水平
[5]。Wei等
[6]研究发现,犊牛日粮中添加黄芪提取物,犊牛血清中SOD含量升高;时菲菲等
[7]研究发现,党参中提取出来的党参多糖抗氧化活性强;李雅倩等
[8]研究发现黄芪黄酮作为一种天然的抗氧化剂,可以在机体内通过一定的作用机制发挥其抗氧化活性。本试验中,添加2%黄芪茎叶粉和1%党参茎叶粉和添加3%黄芪茎叶粉和1%党参茎叶粉,可以提高肉仔鸡血清中SOD含量、GSH-Px含量、T-AOC含量,降低MDA含量,说明黄芪茎叶和党参茎叶中含有的黄酮类、多糖类等物质具有一定的抗氧化活性。
3.2 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡血清生化指标的影响
血清生化参数的改变与动物的生理机能及健康状况有着密切的关系
[9]。血清中TP含量反映了蛋白质合成、吸收和代谢的情况,血清总蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成,白蛋白在运输代谢产物、维持渗透压等方面发挥着重要作用
[10-11];甘油三酯和总胆固醇含量反映动物机体脂质代谢状况
[12];李垚等
[13]研究发现沙棘黄酮降低了肉鸡血清中甘油三脂和总胆固醇的含量;有研究发现日粮中添加姬松茸多糖可显著降低肉仔鸡血清中甘油三酯含量,添加黄芪多糖、混合添加枸杞多糖和姬松茸多糖可显著降低肉仔鸡血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性
[14];邓必贤
[15]研究发现添加黄芪超微粉降低了血清中尿素氮的含量,有助于肉仔鸡对蛋白质和氨基酸的吸收和利用。以上研究结果与本试验基本相似,说明肉仔鸡饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对机体的脂质代谢有关,添加2%的黄芪和1%的党参茎叶粉可以改善肉仔鸡的肝脏功能,促进机体健康。
3.3 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡肠道形态的影响
肠道是动物消化吸收营养物质的关键部位,肠道对营养素的消化吸收产生的影响,主要表现在绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度值的大小上
[16-17]。史洪涛等
[18]研究发现在肉鸡饮水中加入发酵黄芪能明显提高肉鸡小肠绒毛高度、降低隐窝深度,使绒毛高度/隐窝深度值升高,改善了小肠的形态结构;有研究表明,在广西麻鸡饲粮中添加100 mg/kg和150 mg/kg辣木叶提取物能显著提高肉鸡空肠绒毛高度、十二指肠绒毛高度/隐窝深度值,可以改善广西麻鸡的肠道形态结构,辣木叶提取物主要含有黄酮、生物碱、皂苷、多糖等多种活性成分
[19];大量研究发现黄芪具有刺激肠道菌群进而改善肠道组织形态的作用
[20-22]。本研究结果显示,饲粮中添加2%黄芪和1%党参茎叶粉显著提高了肉仔鸡肠道的绒毛长度和隐窝深度,空肠和回肠的绒毛高度/隐窝深度值,说明饲粮中添加2%黄芪和1%党参茎叶粉可以促进肉仔鸡的肠道发育,黄芪茎叶和党参茎叶也含有一定量的黄酮、多糖等生物活性成分,两者通过不同比例配伍对肉仔鸡肠道发育有一定的影响,更深层次的作用机理仍不明确,有关黄芪、党参茎叶对肉仔鸡肠道结构的作用及其成因仍有待探讨,其改善作用与所含的活性物质有关。
3.4 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡肠道屏障功能相关基因mRNA表达量的影响
机械屏障是肠道屏障中的一种,又称为物理屏障,主要由肠道黏膜上皮细胞和紧密连接组成的一种结构,可以阻止有害物质进入,是一种重要的屏障
[23-24]。Claudin、ZO和Occludin是机械屏障中重要的紧密连接蛋白。雷新宇
[25]研究发现在种公鸡日粮中添加黄芪多糖增加了F1代肉仔鸡空肠Occludin的表达量;Wang等
[26]研究发现添加黄芪多糖使肠上皮细胞的ZO-1与Occludin基因的表达增加;谢红兵等
[27]发现添加多种植物多糖可以提高仔猪小肠绒毛高度,降低隐窝深度,改善仔猪的肠道形态,提高小肠黏膜Occludin、ZO-1和Claudin-1 mRNA的表达。以上研究结果与本试验结果相似,饲粮中添加2%黄芪和1%党参茎叶粉显著提高了肉仔鸡空肠Claudin、ZO-1 mRNA表达量,这可能与黄芪茎叶和党参茎叶所含的多糖含量有关,黄芪多糖能够改善消化系统的形态和结构,提高机体的消化能力,强化小肠对营养素的吸收,从而促进动物的生长发育
[28];党参多糖也可以促进消化功能,改善肠道吸收,促进肠道蠕动
[29],两者相互配伍使用可以提升肉仔鸡的肠道屏障功能。
3.5 饲粮中添加黄芪和党参茎叶粉对肉仔鸡盲肠菌群的影响
肠道菌群在代谢、免疫系统发育和宿主对病原体的防御中发挥着许多重要功能
[30]。健康的肠道菌群对鸡生长性能发挥着重要的作用,有害的菌群可能会促进肠道感染,导致生长性能下降,死亡率上升
[31]。本试验研究结果表明,肉仔鸡饲粮中添加2%黄芪和1%党参茎叶粉可以显著提高肉仔鸡盲肠微生物Alpha多样性中Chao1指数,说明肉仔鸡饲粮中添加2%的黄芪和1%的党参茎叶粉可以增加肉仔鸡盲肠微生物中存在的物种数。
本试验对肉仔鸡盲肠微生物在门水平上相对丰度前十的菌门分析发现,厚壁菌门和拟杆菌门是肉仔鸡盲肠微生物门水平上占主要优势的菌门,与前人研究结果一致
[32-35]。大量研究发现,厚壁菌门与体内的能量代谢和脂质沉积有关,拟杆菌门作为肠道内的一种有益菌,与物质代谢过程密切相关
[36]。赵文文
[37]研究表明在雏鸭日粮中添加黄芪多糖和丁酸梭菌,发现雏鸭盲肠微生物中厚壁菌门和拟杆菌门数量较多;孔祥杰等
[38]研究发现仔猪日粮中添加黄芪茎叶,仔猪盲肠微生物中厚壁菌门和拟杆菌门的含量均有不同程度的提高,且添加2.5%黄芪茎叶时,Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数高于对照组;以上均与本试验研究结果基本一致。
本试验对肉仔鸡盲肠微生物在门水平上相对丰度前十的菌属分析发现,阿克曼菌属和考拉杆菌属相对丰度较高。阿克曼菌属是一种革兰氏阴性厌氧菌,可以分解黏蛋白,减轻炎症,为肠道共生生物提供营养,并产生短链脂肪酸,与健康的黏膜有关,具有抗糖尿病的潜在作用
[39-41]。考拉杆菌属是一种专性厌氧和革兰氏阴性细菌,可以促进肠道健康,在肠道中和致病菌相互竞争营养物质,抑制致病菌在肠道中的产生
[42]。贺文祥等
[43]研究发现桑叶水提物含黄酮、多糖、多酚和生物碱等活性物质,添加到肉鸡饲粮中,使肉鸡盲肠微生物厚壁菌门相对丰度降低,变形菌门的含量有提高的趋势;王进宇等
[44]研究发现紫花苜蓿多糖能促进盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌数量的显著增加,改善肠道菌群结构;刘香凝等
[45]研究发现添加复合植物多糖后,肉鸡盲肠微生物中拟杆菌属、乳酸菌属、阿克曼菌属的相对丰度增加,可以改变肠道微生物菌群。黄酮和多糖类化合物广泛存在于水果、蔬菜、中草药中,与人们的生活息息相关,具有抗炎、抗氧化、抗菌等多种作用
[46]。本试验研究结果基本一致,本试验研究发现,肉仔鸡饲粮中添加2%黄芪和1%党参茎叶粉肉鸡盲肠微生物中阿克曼菌属、考拉杆菌属、乳杆菌属有增加的趋势,这可能与黄芪茎叶和党参茎叶所含的化学物质有关。
4 结论
本试验结果表明,在肉仔鸡饲粮中添加2%黄芪茎叶粉和1%党参茎叶粉可以提高肉仔鸡的抗氧化能力,改善肉仔鸡的肝脏功能,促进肉仔鸡肠道健康。