兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

Prokaryotic expression，purification，and polyclonal antibody preparation for Cysticercus pisiformis cysteine protease inhibitor stefin （Cpstefin）

摘要

目的 旨在克隆兔豆状囊尾蚴（Cysticercus pisiformis）半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cysteine protease inhibitor）Stefin基因（CpStefin），原核表达并纯化兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白，制备多克隆抗体并测定其效价。 方法 根据GenBank登录的猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因序列设计引物，以提取的兔豆状囊尾蚴总RNA为模板，运用RT-PCR方法克隆兔豆状囊尾蚴Stefin基因，构建克隆载体pMD-19T-CpStefin，分析Cpstefin蛋白氨基酸序列的二级结构、理化性质、结构域，并分析其与其它绦虫Stefin基因的亲缘关系，构建系统进化树。以克隆载体pMD-19T-CpStefin为模板扩增兔豆状囊尾蚴Stefin基因，回收纯化的扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-1，构建重组质粒pGEX-4T-CpStefin，双酶切、测序结果与预期结果一致。重组质粒pGEX-4T-CpStefin转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，IPTG 诱导表达获得重组蛋白。应用亲和层析法纯化可溶性CpStefin重组蛋白，进行SDS-PAGE 鉴定。重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，运用ELISA方法测定其效价。 结果 首次克隆兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因，基因大小约为290 bp，成功构建克隆载体pMD-19T-CpStefin；菌液PCR和双酶切鉴定结果表明重组质粒pGEX-4T-CpStefin构建正确，通过IPTG诱导表达获得分子质量大小约为35 kU的可溶性融合蛋白，亲和层析法纯化获得纯度较高的CpStefin重组蛋白，制备出的多克隆抗体效价达到1∶25 600。 结论 本研究首次克隆出豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因，运用原核表达系统可溶性表达豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白，纯化获得纯度较高的豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin重组蛋白，制备的多克隆抗体效价达到1∶25 600。

Abstract

Objective This study aimed to clone the cysteine protease inhibitor stefin gene from Cysticercus pisiformis （CpStefin） of Taenia pisiformis，purify the recombinant proteins using a prokaryotic expression system，and generate polyclonal antibodies with subsequent titer detection. Method A pair of primers was designed based on the gene sequence of the cysteine protease inhibitor stefin gene from Taenia solium.The stefin gene from C.pisiformis was amplified via RT-PCR using C.pisiformis RNA as a template.Subsequently，the plasmid pMD-19T-CpStefin was constructed，and secondary structure analysis，physicochemical property assessment，domain identification of the Cpstefin protein amino acid sequence，and construction of a phylogenetic tree comparing Cpstefin gene with other tapeworm stefin genes were conducted.The CpStefin gene was then ligated into a prokaryotic vector to obtain the recombinant plasmid pGEX-4T-CpStefin，which was confirmed by sequencing and double enzyme.The sequencing results matched the expected outcomes.The recombinant plasmid pGEX-4T-CpStefin was transformed into BL21（DE3） E.coli，and the recombinant fusion protein was induced by IPTG and purified using affinity chromatography.The purified CpStefin recombinant protein was used to immunize New Zealand white rabbits to produce polyclonal antibodies against soluble CpStefin，and the antibody titers were determined via ELISA assay. Result The CpStefin gene was successfully cloned with a size of 290 bp，and the plasmid pMD-19T-CpStefin was successfully constructed.The recombinant plasmid pGEX-4T-CpStefin was also successfully generated based on PCR and enzyme digestion results.The CpStefin protein was expressed as a soluble 35 kU fusion protein，and the CpStefin protein was purified.Rabbit antiserum was prepared using the purified soluble CpStefin recombinant expression protein as an antigen.The titers of polyclonal antibodies against CpStefin reached 1∶25 600 as detected by ELISA. Conclusions The CpStefin gene of Cysticercus pisiformis was successfully cloned and recombinant plasmid pGEX-4T-CpStefin was successfully constructed.The recombinant CpStefin protein was obtained by prokaryotic expression system， and the recombinant CpStefin protein was successfully purified with high-purity.The polyclonal antibodies with titer of 1∶25 600 against the recombinant protein CpStefin of Cysticercosis pisiformis was successfully prepared.

Graphical abstract

关键词

豆状囊尾蚴 / 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 / 原核表达 / 纯化 / 多克隆抗体

Key words

Cysticercus pisiformis / cysteine protease inhibitor / prokaryotic expression / purification / polyclonal antibodies

兔豆状囊尾蚴病是由豆状带绦虫（Taeniapisiformis）的中绦期幼虫（豆状囊尾蚴，Cysticercus pisiformis）寄生于家兔的肝脏、肠系膜、大网膜和腹腔等部位引起的一种绦虫蚴病^［1］。家兔是该病的中间宿主，犬、猫、狐狸等肉食动物是其主要的终末宿主。国内外相关的研究报道表明，该病在欧洲、亚洲、非洲、南美洲诸多国家皆有发生^［2］。近几年，随着我国家兔养殖业迅速发展，兔豆状囊尾蚴病的发病率也逐渐增高，在我国甘肃、青海、山西、陕西、福建、新疆、重庆、浙江、山东、河南、河北、湖北、湖南、广西等省（区） 直辖市均有该病的报道^［4］。因此，对于该病的研究日益重要。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cysteine protease inhibitor，CPI）是半胱氨酸蛋白酶可逆性抑制剂。自发现以来，半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族不断发展壮大，已然成为一个超家族基因^［2］，主要分为4个主要的家族：家族1（stefins家族）、家族2（cystatins家族）、家族3（kininogens家族）、家族4（fetuin家族）^［5］。其中，家族1为胞内性单链蛋白质，约含有100个氨基酸残基，不含有二硫键和寡糖链^［6］；家族2为外泌性蛋白，约含有115个氨基酸残基，且在多肽链的N端有1个信号肽序列和2个二硫键^［7-8］；家族3为多结构域蛋白，多肽链中有多个信号肽序列和二硫键^［9-10］；家族4同样是外泌性蛋白，于1988年被Elzanowski等发现，但在该家族中只有部分成员有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的活性^［11］。近几年的研究发现，从寄生虫的体内分泌出来的一些排泄物，对于宿主的免疫系统有着重要的调节作用，尤其是对于免疫细胞的形态结构与功能^［5-12］。CPI是大多寄生虫分泌排泄物的主要成分之一，同时，CPI可以抑制抗原呈递细胞（如树突状细胞，巨噬细胞等）的抗原呈递和T细胞的增殖，并可通过与免疫受体结合，促进免疫细胞合成某些免疫抑制细胞因子，使得抗原递呈反应受到影响^［13］。因此，寄生虫的CPI对宿主的免疫反应具有抑制作用。

目前，有关豆状带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究尚未见报道。本研究提取兔豆状囊尾蚴总 RNA，设计特异引物，通过 RT-PCR技术，首次克隆半胱氨酸蛋白酶抑制剂 Stefin（CpStefin）基因，构建原核系统表达载体pGEX-4T-CpStefin，诱导表达可溶性兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂 Stefin蛋白，表达产物进行检测与纯化，制备多克隆抗体，为豆状囊尾蚴病诊断抗原和免疫调节剂的发现以及豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂 Stefin生物学功能进一步的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫体、菌株、载体及试验动物

本试验所用的豆状囊尾蚴取自甘肃省兰州市榆中县某兔场自然感染豆状囊尾蚴家兔；E.coli DH5α与E.coli BL21（DE3）感受态细胞购自浙江博而金科技股份有限公司；克隆载体pMD19-T购自大连宝生物生物工程有限公司；原核表达载体 pGEX-4T-1由甘肃农业大学动物医学院预防兽医系实验室保存；健康状况良好的新西兰大白兔购于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂与仪器设备

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；质粒小量提取试剂盒购自甘肃鹏程生物科技发展有限公司；DNA Marker、蛋白Marker、GoldView I型核酸染色剂购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒、MiniBEST Universal RNA Extraction KIT、IPTG、氨苄青霉素、BamH I、Xho I均购自宝生物工程（大连）有限公司。本试验所用仪器主要包括：PCR仪（艾本德中国有限公司）、SC型水平电泳槽（北京凯元信瑞仪器有限公司）、切胶仪（杭州米欧仪器有限公司）、超低温冰箱（DW-86L388J，青岛海尔特种电器有限公司）、超净工作台（HCB-1300V，青岛海尔特种电器有限公司）、高压立式灭菌锅（LDZH-100L，上海申安医疗器械厂）、生化培养箱（HPX-II-80，上海跃进医疗器械有限公司）、恒温培养摇床（THZ-300，上海一恒科学仪器有限公司）、凝胶成像系统（时代联想生物科技有限公司）。

1.3 兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂stefin基因的扩增

1.3.1 引物设计

根据GenBank中公布的带科绦虫猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因序列，应用Oligo设计1对特异性引物，上游引物CpStefin-F：5′-CGCGGATCCATGCCGATGTGTGGTG GTTTG-3′，下游引物CpStefin-R：5′-CGC CTC GAGTTAAAAGTATGTCAGAGGGTCTCC-3′；上下游引物分别引入下划线所示BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2 总RNA提取及反转录

取保存于液氮的兔豆状囊尾蚴，研钵充分研磨后，提取兔豆状囊尾蚴总RNA，按照反转录试剂盒操作步骤，以其为模板反转录为cDNA。

1.3.3 兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂 stefin基因的扩增

以反转录所得cDNA为模板，经PCR克隆CpStefin基因。PCR反应体系（25 µL）：2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix 12.5 µL，CpStefin-F 1 µL，CpStefin-R 1 µL，cDNA 5 µL，Nuclease-free Water 5 µL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃，1 min。反应结束后，取4 µL的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。根据DNA回收试剂盒说明书，回收纯化与目的基因片段大小一致的PCR产物，与pMD19-T载体连接，构建克隆载体pMD-19T-CpStefin，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃过夜培养，挑取单菌落接种到氨苄霉素的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min过夜培养。菌液PCR筛选阳性克隆，阳性克隆对应菌液送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.3.4 兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂 stefin基因生物学信息分析

用Mega软件对Stefin基因进行序列比对并绘制系统进化树；用在线软件预测stefin蛋白质的二级结构（predictprotein.org）、三级结构（www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/）、3D结构（swissmodel.expasy.org）、结构域Conserved Domains（www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；用在线软件分析stefin蛋白质的理化性质（www.expasy.org/resources/protparam）、亲水性和疏水性（www.expasy.org/resources/protscale）、信号肽序列（services.healthtech.dtu.dk/services/signalP-5.0/）、磷酸化位点（services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）。

1.4 原核表达载体pGEX-4T-CpStefin 的构建

分别对测序正确的pMD-19T-CpStefin 阳性质粒与pGEX-4T-1空载体进行BamH I和Xho I双酶切，酶切体系（30 µL）：CpStefin基因或pGEX-4T-1载体质粒，12 µL；Xho I（10 U/µL），1 µL；BamH Ⅰ（10 U/µL），1 µL；10×H Buffer，2 µL； dd H₂O，14 µL。反应条件：混匀置于37 ℃水浴锅中酶切 4 h。酶切产物琼脂糖核酸电泳检测鉴定后胶回收，运用T₄ DNA连接酶将纯化回收后的Stefin目的基因与pGEX-4T-1空载体片段16 ℃过夜连接，连接体系：pGEX-4T-1载体片段，1 µL；Stefin基因7 µL，T₄ DNA Ligase 1 µL，10x T4 DNA Ligase Buffer 1 µL。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，根据质粒小提试剂盒说明书提取阳性克隆质粒，进行双酶切鉴定，并测序鉴定，构建重组质粒pGEX-4T-CpStefin，鉴定正确的阳性克隆菌液置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 重组蛋白的纯化

扩大培养重组质粒pGEX-4T-CpStefin菌液，10 000 r/min离心10 min，弃去上清收集菌体，加入PBS震荡混匀，置于冰上进行超声破碎。超声裂解后，10 000 r/min离心30 min，收集上清后运用GST•Bind™树脂纯化重组蛋白，轻柔、充分翻转摇匀树脂混悬液后，用移液器吸头吸取3 mL的树脂，等待树脂沉降后，加入5倍体积1×GST Bind/Wash Buffer平衡树脂，待GST Bind/Wash Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白上清。将流速控制在每小时10倍柱体积为宜。再用10倍体积的1×GST Bind/Wash Buffer洗柱并收集洗液置于冰上。最后用现配的3倍体积1×GST Elution Buffer洗脱目的蛋白并收集置于冰上，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE 鉴定。

1.6 多克隆抗体的制备及效价检测

初次免疫取500 µL重组蛋白CpStefin和500 µL弗氏完全佐剂，加入EP管中，EP管用封口膜封住，使用乳化机2 min左右，接种新西兰大白兔，每只约500 µL，背部剃毛消毒后皮下多点注射。7 d后，取重组蛋白350 µL和350 µL弗氏不完全佐剂，加入EP管中封口后乳化2 min，每只兔子接种约300 µg。在初次免疫的第14天和第28天以同样的方法进行三免和四免。四免4 d后，兔耳缘静脉采血，用间接ELISA检测抗体效价。7 d后对兔子心脏采血并分离血清，间接ELISA检测抗体效价，存于-80 ℃冰箱。

2 结果与分析

2.1 兔豆状囊尾蚴CpStefin基因的RT-PCR扩增

以提取的兔豆状囊尾蚴总RNA为模板，经反转录和PCR扩增，PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，约290 bp处发现特异性条带，与预期的兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因片段大小相符合（图1）。

2.2 克隆载体pMD-19T-CpStefin的构建

将纯化后的产物连接到pMD-19T，转化到E.coli DH5α感受态细胞，在适宜的条件下培养一段时间，挑取菌落培养，菌液PCR及测序筛选阳性克隆（图2）。

2.3 stefin基因生物学信息分析

2.3.1 二级结构分析

二级结构预测结果显示：CpStefin蛋白二级结构中，α螺旋结构占比为17.35%，β折叠结构占比为31.63%。其余为不规则结构，占比为51.02%，见图3~4。SignalP预测显示，含有信号肽的概率为1.2‰。因此认为CpStefin蛋白不含有信号肽序列（图4）。

2.3.2 三级结构分析

通过Swiss model进行同源建模，以GMQE（global model quality estimate）和序列一致性（Identity）为原则选择最优模板建模。CpStefin以华支睾吸虫CsStefin-1（PDB ID：5CZ1）为模板建模（图5）。

2.3.3 序列对比及系统进化分析

利用Mega软件进行多序列对比发现，CpStefin有CPI超家族结构域和高度保守基序GG和QxVxG（图6）。红色方框表示CPI超家族结构域。蓝色方框为保守序列。利用Mega软件中的Construct/Test Neighbor-Joining Tree方法对CpStefin构建系统进化树，结果显示CpStefin与泡尾带状绦虫（Hydatigcra tacniacformis）、猪带绦虫（Taenia solium）、牛带绦虫（Taenia asiatica）亲缘关系最近（图7）。

2.3.4 理化信息分析

CpStefin蛋白由98个氨基酸组成，分子质量为10 904.43。共20种氨基酸。其中Val最多（10.2%），Trp最少（1%）。分子式为C481H756N138O142S5，理论等电点（pI）为6.27。带正电荷的残基（Arg+Lys）为10%，带负电荷的残基（Asp+Glu）为12%。蛋白不稳定系数45.86，大于40说明是不稳定蛋白。脂溶系数82.45。亲水性系数最大为1.289，最小为-3.144（图8）。综上所述CpStefin蛋白是一个分子量为10 904.43，不稳定的亲水性蛋白 。

2.3.5 结构域分析

NCBI-Conserved Domains预测结果显示，CpStefin蛋白具有典型的半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族结构域特征（4~60位点），证明该蛋白属于CPI家族。NetPhos-3.1预测结构显示CpStefin具有6个特异性磷酸化位点，包括2个丝氨酸磷酸化位点、2个苏氨酸磷酸化位点和2个络氨酸磷酸化位点。

2.4 重组表达质粒 pGEX-4T-CpStefin鉴定

根据测序结果显示，重组质粒pGEX-4T-CpStefin，用 Xho I和 BamH I进行双酶验证（图9），无碱基突变，重组质粒构建成功。

2.5 多克隆抗体的制备及效价检测

2.5.1 重组蛋白的纯化及鉴定结果

超声破碎后的重组蛋白经 GST•Bind™树脂层析纯化后，产物经SDS-PAGE电泳检测，大约在36 kU处出现较为单一的条带，表明已得到纯化且具有良好免疫原性的CpStefin重组蛋白，与预期结果一致（图10）。

2.5.2 多克隆抗体效价测定

以P/N>2.1为判定标准，抗体效价可以达到1∶25 600（图11）。

3 讨论

近年来，兔豆状囊尾蚴病的发病率越来越高^［14］。但由于无明显的临床症状，缺乏快速高效的诊断方法，导致该病的治疗效果欠佳，严重影响了我国养兔产业的发展^［15］。因此迫切需要研发新的诊断方法以及研制疫苗来消除该病对养兔产业的影响。半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族，包含大量对木瓜蛋白酶家族有活性的同源蛋白。是20世纪60年代末被称之为的蛋清胱抑素这一群体的原型。今天，半胱氨酸蛋白酶抑制剂从原生动物到哺乳动物都有代表性。人类已经发现了12种功能性半胱氨酸抑制剂。它们根据不同的结构细节分为三大类型，同时也反映了它们在身体中的分布和生理作用^［16］。Stefins家族约有100个氨基酸残基的多肽，既不具有二硫键，也不具有碳水化合物侧链。它们主要在细胞内发现，但也可以在体液中以显著浓度出现。半胱氨酸蛋白酶抑制剂对于寄生虫的寄生生活有着非常重要的作用，目前研究得比较深入的方面是线虫Cystatin调控宿主的免疫反应^［17］。此外，重组旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以在体外诱导骨髓源性巨噬细胞转化为抗炎性M2巨噬细胞，同时抑制M1巨噬细胞的活化^［18］。线虫寄生虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂能够调节小鼠骨髓来源树突状细胞的分化和激活阶段。它还干扰抗原和MHC-II分子加工和Toll样受体信号通路，导致功能缺陷的树突状细胞再次诱导刺激免疫反应^［19］。日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种新的寄生虫衍生免疫抑制因子，促进T细胞产生IL-4和TGF-β^［20］。马来丝虫与华支睾吸虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂能够促进IL-10的释放，同时活化巨噬细胞，增强肠道黏膜的固有免疫，修复宿主先天免疫，从而起到改善结肠炎的功能^［21-23］。该酶目前在许多吸虫、线虫等寄生虫中均己成功克隆、表达，这就为绦虫的功能和作用机制的研究奠定了基础。目前，李君君等人对猪带绦虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂TsStefin和TsCystatin重组蛋白进行了可溶性原核表达和纯化，且对其三级结构进行了预测分析 ^［24］。吴茂迪等人从细粒棘球绦虫中扩增出Cystatin，发现Eg-Cystatin有信号肽^［25］。

本研究根据GenBank中公布的带科绦虫猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因序列，设计特异性引物。利用RT-PCR技术成功克隆了CpStefin基因，并进行序列特征分析，以获取CpStefin蛋白的生物学信息。预测结果表明，CpStefin作为分泌性蛋白，不含有信号肽，但具有6个特异性的磷酸化位点，其中2个磷酸化位点为丝氨酸磷酸化位点，2个为苏氨酸磷酸化位点。丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点被磷酸激酶磷酸化，可以激活蛋白活性，这与Cpstefin发挥酶活性抑制作用有关。在与CpStefin同源的其他物种序列对比发现，CpStefin与其他物种的Stefin一样具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族结构域（为4~60位点）。Mega构建的系统进化树结果表明：CpStefin和泡尾带状绦虫（Hydatigcra tacniacformis）位于同一分支，遗传距离为91，所以二者的亲缘关系最近。其次CpStefin与猪带绦虫（Taenia solium）、牛带绦虫（Taenia asiatica）亲缘关系较近。CpStefin是否与带状泡尾绦虫、猪带绦虫、牛带绦虫的Stefin具有相似的生理生化功能，需要进一步的深入研究。从吸虫、线虫、原虫中陆续发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员不但具有独特的酶抑制活性，而且还具有免疫调节特性，如调节MHC-Ⅱ限制的抗原递呈，调节细胞因子分泌和T淋巴细胞生长分化和巨噬细胞功能，这也提示寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂参与寄生虫与宿主的共进化^［26-27］。本研究克隆和表达豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂stefin基因，并制备其多克隆抗体，既为进一步研究兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin家族酶抑制活性提供准备，也有助于阐明豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂stefin家族免疫调节特性及豆状囊尾蚴与宿主的共进化规律。此外，一些寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在抗寄生虫感染和寄生虫病预防和诊断方面具备潜在的应用价值^［25-27］，本研究制备的兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin多克隆抗体效价达到1：25 600，不但为深入研究豆状带绦虫不同发育时期半胱氨酸蛋白酶抑制剂stefin蛋白的分布和表达提供材料准备，也为阐明豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin蛋白在豆状囊尾蚴病抗体诊断方面是否具备应用价值奠定基础，继而为发掘豆状囊尾蚴病新的诊断靶标和疫苗候选分子以及豆状囊尾蚴病的诊断和防治提供帮助。

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基金资助

甘肃省自然科学基金项目(21JR7RA823)

国家自然科学基金地区科学基金项目(32160843)

甘肃农业大学国家级大学生创新创业训练计划项目(202010733011)