PRNP过表达MAC-T细胞的构建及其对细胞黏附侵袭的影响

Construction of PRNP lentiviral overexpression vector and its effect on MAC-T cell adhesion invasion

摘要

目的 研究PRNP过表达对牛乳腺上皮细胞系（MAC-T）黏附、侵袭的影响。 方法 利用慢病毒载体技术构建PRNP慢病毒过表达载体并建立稳定PRNP过表达MAC-T细胞系；应用实时荧光定量 PCR 和Western Blot对过表达MAC-T细胞系进行验证；随后用MRSA感染MAC-T细胞和PRNP过表达MAC-T细胞系，比较PRNP过表达 MAC-T 细胞和野生型MAC-T细胞在黏附侵袭生理特性的差异。 结果 成功构建pLVML-PRNP慢病毒表达载体和稳定的PRNP⁺-MAC-T细胞系；黏附侵袭结果表明MRSA对过表达PRNP的MAC-T细胞黏附侵袭能力显著低于对照组，值得注意的是，MRSA在感染PRNP⁺-MAC-T细胞后的6 h内，未发生明显的侵袭现象，直至感染6 h后其侵袭率才明显上升，8 h达到峰值，但是仍显著低于MRSA对MAC-T细胞的侵袭率。 结论 PRNP过表达能够降低MRSA对细胞的黏附侵袭能力。

Abstract

Objective To study the effect of PRNP overexpression on the adhesion and invasion of a bovine mammary epithelial cell line （MAC-T）. Method PRNP lentiviral overexpression vectors were constructed and stable PRNP overexpressing MAC-T cell lines were established using lentiviral vector technology；Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot were used to validate the overexpressing MAC-T cell lines；subsequently，MRSA-infected MAC-T cells and PRNP-overexpressing MAC-T cells were used to compare the differences between PRNP-overexpressing MAC-T cells and wild-type MAC-T cells in the physiological characteristics of adhesion invasion. Result The pLVML-PRNP lentiviral expression vector and a stable PRNP⁺-MAC-T cell line were successfully constructed. The adhesion-invasion results showed that the adhesion-invasion ability of MRSA to MAC-T cells overexpressing PRNP was significantly lower than that of the control group. Notably，MRSA infection with PRNP⁺-MAC-T cells did not show significant invasion within 6 h，its invasion rate increased significantly only after 6 h of infection，peaking at 8 h，but was still significantly lower than that of MRSA-infected MAC-T cells. Conclusion Overexpression of PRNP reduces the ability of MRSA to adhere to and invade cells，and the results provide new data to investigate the involvement of PRNP in bacterial infections.

Graphical abstract

关键词

慢病毒载体 / PRNP / MAC-T细胞 / MRSA

Key words

lentiviral vector / PRNP / MAC-T cells / MRSA

细胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrP^C）是由朊蛋白基因（PRNP）所编码的一种蛋白。PRNP通常被认为是由糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚连接到膜上的一种细胞表面分子，但是，缺少GPI锚点的常见PRNP亚型也分布于细胞内，包括细胞核及细胞外环境^［1］。生物体内细胞型朊蛋白发生错构后导致正常朊蛋白错误折叠而引起海绵状脑病^［2-3］。据报道，PrP^C可以调节巨噬细胞的吞噬功能和促进中性粒细胞的募集^［4］，并且PrP^C在神经组织中的表达水平最高，在淋巴系统中的表达也很容易检测到^［5-6］。朊病毒蛋白具有抗菌活性，并有助于建立与细胞内病原体的感染^［7-8］；在朊蛋白（prion protein，PrP）的深入研究中发现其不仅存在于真核生物中，同样也存在于细菌中^［9］，研究发现在布鲁氏菌感染巨噬细胞后，PrP^C参与了其信号转导过程^［7］。建立PrP敲除小鼠和野生型小鼠链球菌败血症模型，PrP敲除小鼠血液中免疫相关细胞因子明显减少^［10］。此外，人的朊蛋白N末端肽也表现出抗菌活性^［8］。本实验室之前的研究表明朊蛋白在细菌感染中可能发挥作用，但具体功能，我们仍然不清楚^［11-12］。

过表达慢病毒载体是将目的基因与具有强启动子的慢病毒载体进行重组^［13］。慢病毒最大的优势是将外源基因整合到动物基因组中并稳定表达，此外，慢病毒载体还具有转染效率高并且有着持续、高效的表达特点^［14-15］。近年来，慢病毒已被广泛地应用，在畜牧兽医领域报道较多^［14］。沈逵等^［16］成功构建禽白血病病毒衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体，为禽源细胞深入研究p15蛋白的生物学功能提供良好的生物材料。张琰芳等^［17］构建的 pLV-miR-183 慢病毒载体使miR-183在猪肾细胞（PK15）细胞中有较高的表达活性。

本研究拟通过构建pLVML-PRNP慢病毒表达载体质粒，检测 PRNP蛋白在牛乳腺上皮细胞（MAC-T）细胞中的表达和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）对PRNP过表达 MAC-T 细胞的黏附侵袭能力，阐明PRNP参与细菌的感染，以期为PRNP的生物学功能的研究提供良好的材料。

1 材料与方法

1.1 材料

过表达慢病毒载体pLVML-3×HA-MCS-IRES-Puro、慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G、慢病毒包装人胚肾细胞（HEK 293T）细胞和MAC-T细胞为甘肃农业大学动物医学院微生物与免疫实验室保存。MRSA菌株由兰州畜牧兽医研究所杨峰馈赠^［18-19］。

1.2 主要试剂

限制性内切酶、dNTP、Taq酶（TaKaRa，USA）；Lipo293™转染试剂（碧云天C0521，China）。胎牛血清（FBS）培养基，培养基（DMEM，海克隆，China）； T₄ 连接酶（Promega）；RIPA 细胞裂解液（索莱宝，China）；兔源抗PRNP多克隆抗体（Abcam，USA）； 辣根过氧化物酶 （ HRP） 标记的山羊抗兔 IgG抗体、β-actin（博奥森，China）；15 kb DNA Maker、预染蛋白质 Marker、 BCA 蛋白定量试剂盒、ECL 化学发光显色液、高保真PCR试剂盒、SYBR Green real-time PCR mixture、细胞DNA提取试剂盒（南京诺唯赞，China）；其他常用试剂均为国产分析纯产品。引物合成及测序由兰州天启公司完成。

1.3 方法

1.3.1 PRNP引物设计合成及PRNP的克隆

用DNA提取试剂盒提取MAC-T细胞的DNA，根据 NCBI 中PRNP基因序列 （GenBank：EU557972.1）和过表达慢病毒载体pLVML酶切位点，使用 Prime 5.0 设计引物（表1），克隆出PRNP全长序列。

1.3.2 PRNP慢病毒过表达质粒的构建

将上述获得的PRNP基因和过表达慢病毒载体pLVML用Spe Ⅰ 和Not Ⅰ 进行双酶切，反应体系为：10×Green Buffer 2 μL，Spe Ⅰ 1 μL，Not Ⅰ 1 μL，质粒 2 μL，目的基因 2 μL，ddH₂O 12 μL，共 20 μL 体系。条件：55 ℃酶切45 min。酶切后胶回收产物进行连接，连接体系为：10×T₄ DNA Ligase Buffer 2 μL，T₄ DNA Ligase 1 μL，回收pLVML产物 3 μL，回收PRNP产物 5 μL，ddH₂O 9 μL，4 ℃过夜连接。将连接产物转化至 Top10 感受态细胞中，37 ℃培养24 h，挑取单个菌落，抽提质粒，进行SpeⅠ 和Not Ⅰ双酶切验证。将验证成功的质粒送至兰州天启基因生物科技有限公司测序，测序正确的质粒用于后续试验，并命名为pLVML-PRNP。

1.3.3 慢病毒的包装

提前准备HEK 293T细胞，当293T细胞汇合度50%~60%，细胞分布均匀，状态良好时进行慢病毒包装。慢病毒包装前1~2 h细胞培养液更换为无血清的DMEM培养基。向1.5 mL离心管中依次加入DMEM 500 μL，pMD2.G 1.5 μg，psPax2 3 μg，慢病毒目的载体质粒：5 μg，混合均匀（管1）；向另一个1.5 mL离心管中依次加入DMEM 500 μL，Lipo293™转染试剂10 μL，轻轻吹打混合均匀（管2）；将含有核酸的混合液加入转染试剂管中（管1加入管2），轻轻吹打混匀后室温静置20~30 min。将上述静置后的混合液滴加到提前准备好的HEK293T细胞中，加入后水平十字混匀。将细胞置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养。转染6 h后更换含血清的完全培养基继续培养。48 h后收集培养基上清，用0.45 μm滤器过滤分装后-80 ℃保存^［20］。

1.3.4 慢病毒滴度测定

将20%的蔗糖溶液加至病毒悬液底部，4 ℃，25 000 g离心2 h，弃掉上清，室温晾干至离心管底可见沉淀，用无血清的OPTI-MEM 4 ℃溶解2 h，碎干冰速冻后储存于-80℃。取24孔板接种 293T细胞。待细胞融合率为40%~60%，确定感染前实际细胞数目，记为N。病毒10倍稀释（10¹）感染293T细胞48 h。利用DNA抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA，利用Real-Time PCR扩增PRNP，扩增引物见表1。反应程序为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，57 ℃ 30s，35个循环；最后阶段为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每个独立样本做3次重复。检测结果采用2^-△△CT方法进行计算，测得293T细胞每基因组载入的慢病毒拷贝数，进一步计算病毒滴度。病毒滴度（integration unitsper mL，IU/mL）的计算公式如下：IU/mL=（C×N×D×1 000）/V，（C=平均每基因组整合的病毒拷贝数；N=感染时细胞的数目；D=病毒载体的稀释倍数；V=加入的稀释病毒的体积数）^［21-22］。

1.3.5 PRNP过表达MAC-T细胞系的建立

将 2×10⁴个MAC-T 细胞接种于 6孔板中，置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养24 h，当MAC-T细胞汇合度达到50%~60%时用上述病毒液感染细胞。加入病毒上清继续培养24 h后，更换含血清的完全培养液培养48 h。随后加入嘌呤霉素进行筛选，筛选浓度2 μg/mL。

1.3.6 PRNP相对表达量验证

用Trizol法提取细胞总RNA，然后逆转录成cDNA，通过实时定量PCR检测PRNP的相对表达量，扩增引物见表1，β-actin做内参基因。反应体系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，cDNA 4 μL，Forward Primer 和 Primer （10 μmol/L） 各 0.6 μL，添 加 RNase free H₂O至总体积20 μL；反应程序为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，35个循环；最后阶段为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每个独立样本做3次重复。

1.3.7 Western-blot 检测 PRNP 蛋白的表达

使用RIPA 细胞高效裂解液提取转染后MAC-T细胞的总蛋白。经 BCA 试剂盒定量后，各取300 μg进行SDS-PAGE，电泳结束后进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，随后加入兔抗PRNP多克隆抗体（1∶1 500），4 ℃过夜孵育。次日，TBST洗涤PVDF膜5次，每次15 min，加入HRP偶联山羊抗兔抗体（1∶5 000），室温孵育2 h，TBST洗涤5次，每次15 min，ECL显影。同时以β-actin作为内参蛋白。

1.3.8 细胞生长曲线绘制

将 2×10⁴个MAC-T 细胞接种于 6孔板中，置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养24 h，用0.25% 胰蛋白酶消化，吸取 10 μL 细胞悬液于血球计数板上，盖上盖玻片。使用倒置显微镜观察并计数，以10 000/孔的标准稀释细胞悬液。每隔 24 h 观察计数1次，记录 6 d内野生型MAC-T细胞和过表达PRNP的MAC-T细胞的生长状况。

1.3.9 MRSA对细胞黏附与侵袭测定

融合单层的 MAC-T细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，将大约2.0 ×10⁵ 个细胞接种至 12 孔细胞培养板，在37 ℃，5% CO₂的条件下培养24 h。然后，每孔加入1 mL浓度为5.0×10⁷ CFU/mL的MRSA菌悬液。细菌悬浮液与融合的单层 MAC-T 细胞以100∶1的感染复数（MOI）在37 ℃，5% CO₂的条件下共培养2、4、6、8、12 h。不同时间段MRSA感染的细胞用 PBS（pH 7.4）洗涤3次，用0.25%胰蛋白酶处理并用终浓度0.25%的Triton X-100进行裂解。侵袭试验是在黏附试验的基础上，在指定孔中加入1 mL 终浓度50 μg/mL庆大霉素的侵袭培养基，继续孵育 2 h消除细胞外的细菌。最后，通过标准平板稀释计数法确定相关细菌数量^［23］。

1.4 数据的统计学分析

每个试验样本做 3 次独立重复，所有数据使用Graph Pad Prism 8 软件进行统计并检测统计学差异。

2 结果与分析

2.1 pLVML-PRNP慢病毒表达质粒的构建与鉴定

使用上述引物扩增出大小约为795 bp的目的条带，与预期的大小片段一致。将构建的重组质粒pLVML-PRNP转入Top10感受态细胞，提取质粒后使用Spe Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切验证。结果显示，酶切后目的基因片段和pLVML载体片段与预期大小一致（图1-A），将双酶切验证正确的质粒进行测序，测序结果中插入片段序列与PRNP基因序列一致，说明pLVML-PRNP重组慢病毒表达质粒构建正确（图1-B）。

2.2 慢病毒的包装

分别将pLVML-PRNP慢病毒表达载体和pLVML空载体与包装质粒pMD2.G、psPax2和Lipo293™共转染293T细胞，收集病毒液后分别感染MAC-T细胞，48 h后更换含10% FBS的完全培养基。待细胞长成融合的单层后加入2 μg/mL的嘌呤霉素，嘌呤霉素能够杀死阴性293T细胞，转入质粒pLVML-PRNP的阳性细胞则会存活，长成细胞簇，以此筛选单克隆细胞株（图2）。

2.3 慢病毒滴度测定

利用超速离心沉淀法对重组慢病毒液浓缩纯化，纯化后的病毒进行梯度稀释并感染293T细胞48 h后，提取DNA进行Real-Time PCR计算病毒拷贝数；将293T细胞基因组整合的pLVML-PRNP病毒拷贝数、感染时的细胞总数、病毒载体稀释倍数以及稀释病毒的体积数分别代入病毒滴度计算公式，最终计算得到pLVML-PRNP慢病毒平均滴度为5.2×10⁹ IU/mL（表2）。

2.4 PRNP过表达MAC-T细胞系的建立

分别提取感染pLVML-PRNP慢病毒表达载体和pLVML空载体的单克隆细胞株的总RNA。进行实时荧光定量PCR，结果表明与转染pLVML空载体和野生型MAC-T细胞相比较，转染pLVML-PRNP慢病毒表达载体后的细胞的PRNP表达水平增加了5~40倍（图3-A）。说明所构建的载体在MAC-T细胞中表达。筛选实时荧光定量PCR中PRNP相对表达量高的单克隆细胞株进行Western-blot验证，与对照组相比，pLVML-PRNP组细胞的PRNP蛋白表达水平明显升高（图3-B），通过IMJ灰度分析pLVML-PRNP组细胞的PRNP蛋白表达水平是野生型MAC-T细胞的2-3倍（图3-C）。以上结果表明，成功建立了稳定过表达PRNP的MAC-T细胞系，命名为PRNP⁺-MAC-T。

2.5 细胞生长曲线

将2×10⁴个MAC-T 细胞和PRNP⁺-MAC-T细胞接种至6孔板，置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养。每隔 24 h观察细胞形态及生长状况并利用血球计数板记录2种细胞的细胞数，并且根据统计的细胞数绘制细胞生长曲线。结果表明，2种细胞形态均似鹅卵石状且生长良好。使用Graph Pad对2种细胞生长曲线进行t检验，PRNP⁺-MAC-T细胞的生长曲线与MAC-T细胞生长曲线之间无显著差异，说明PRNP慢病毒过表达重组载体不会影响MAC-T细胞的正常生长（图4）。

2.6 MRSA对细胞黏附与侵袭的测定

通过MRSA对细胞黏附与侵袭的测定，MRSA能够不同程度的黏附侵袭 MAC-T细胞和PRNP⁺-MAC-T细胞，但是MRSA对PRNP⁺-MAC-T细胞的黏附侵袭能力显著低于MAC-T细胞（图5-A~B）。在感染后的12 h内，MRSA对PRNP⁺-MAC-T细胞和MAC-T细胞的黏附率均随感染时间的延长逐渐上升，8 h达到最高（分别为13.75%、19%），随后开始下降，12 h时黏附率分别下降至1.7%与9.5%（图5-A）；而感染后，MRSA对PRNP⁺-MAC-T细胞和MAC-T细胞的侵袭过程截然不同。MRSA对PRNP⁺-MAC-T在感染后2~6 h内未发生显著侵袭现象，6 h后侵袭率逐渐上升，8 h达到峰值（0.85%），12 h降至0.73%；MRSA对MAC-T细胞的侵袭率在感染后2 h后逐渐上升，8 h达到峰值（3.8%），12 h降至2.85%。12 h黏附率与侵袭率普遍降低是由于MRSA长时间感染导致细胞凋亡；且在整个感染过程中MRSA对PRNP⁺-MAC-T细胞的侵袭率远远低于其对MAC-T细胞的侵袭率（图5-B）。综上所述，PRNP的过表达能够降低MRSA对细胞的黏附侵袭能力。

3 讨论

细细胞型朊蛋白（PrP^C）具有多种生物学功能，可参与细胞通路和信号传导等过程^［24-26］。本实验室前期研究发现鸡朊蛋白参与神经突触生成、神经内稳态、细胞信号转导、细胞黏附和抗应激的保护性作用^［27-30］。朊蛋白在细菌感染的过程中也发挥着一定的作用，具有抗菌活性，有助于建立对细胞内病原体的抗感染过程，它的缺乏能够降低布鲁氏菌的内化和在细胞内的复制^［7-8］。有研究表明幽门螺旋杆菌感染导致胃黏膜PrP^C的表达显著上调，保护胃黏膜免受损伤^［31］。PRNP在抗细胞凋亡等过程也发挥作用^［32-33］；在牛分枝杆菌感染BV2小胶质细胞的研究中发现感染后PRNP 表达水平会逐渐上升，并且PRNP对内源性凋亡途径的调控作用优于其对外源性途径的调控作用^［34］。有研究发现PrP^C对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌具有明显的抑菌活性^［35］。本研究分别用金黄色葡萄球菌和粪肠球菌感染小鼠后发现其肾脏中 PRNP 的 mRNA 表达水平随着感染时间的变化而变化，这预示着朊蛋白直接或间接参与机体抗感染^［11-12］。

金黄色葡萄球菌作为奶牛乳房炎的主要病原菌之一，它可以引起奶牛乳房组织发炎，导致产奶量下降，影响奶的品质。近年来由于抗生素的滥用，耐药菌株频繁出现，而MRSA已是奶牛乳房炎中最常见的耐药菌株^［36-39］。在MRSA感染导致奶牛乳房炎的过程中PRNP发挥的作用报道很少。因此，本研究通过构建PRNP慢病毒过表达载体，建立PRNP过表达稳定MAC-T细胞系，实时荧光定量PCR和Western-blot检测结果均证实了PRNP基因能够在MAC-T细胞中稳定表达；生长曲线分析结果表明慢病毒介导的PRNP的过表达并未影响MAC-T细胞的生长性状；说明已成功构建PRNP过表达稳定MAC-T细胞系。由于黏附和侵袭是细菌感染细胞以及诱导细胞凋亡的关键步骤^［40］，所以通过黏附侵袭试验来探索PRNP在MRSA感染细胞的过程中发挥的作用。结果表明MRSA 对过表达PRNP的MAC-T细胞黏附侵袭能力显著下降，PRNP编码的朊蛋白PrP^C降低了细菌黏附侵袭的能力。考虑到PrP^C是一种膜蛋白，而金黄色葡萄球菌表面黏附素是其粘附侵袭过程中不可或缺的要素^［36］，那么PRNP在细菌感染过程中的功能可能与抗细菌表面粘附素有关。本研究结果暗示，PRNP在MRSA感染细胞过程中发挥的重要作用，并且为进一步研究PRNP在细菌感染过程中的生物学作用提供了新的材料。

4 结论

本研究成功构建了PRNP慢病毒过表达载体；pLVML-PRNP重组载体导入的PRNP⁺-MAC-T细胞与野生型MAC-T相比生物学特性无显著差异；MRSA 对MAC-T细胞和PRNP⁺-MAC-T细胞具有不同的黏附侵袭能力，MRSA对过表达PRNP的MAC-T细胞黏附侵袭能力显著下降。说明细胞表达的PRNP与细菌的黏附与侵袭有密切关系。这将为研究细菌感染过程中PRNP所发挥的生物学功能提供新的数据。

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基金资助

甘肃农业大学动物医学院学科建设基金项目(GSAU-XKJS-2018-074)