北红葡萄组织培养生根期愈伤组织的转录组分析

Transcriptome analysis of callus at rooting stage in Beihong grape tissue culture

摘要

目的 探究北红葡萄生根的分子机理，为北红葡萄繁育中生根提供理论和实践指导。 方法 将北红葡萄组织培养至生根期，筛选出较为适合生根的培养基类型后，正交试验设计以不同质量浓度IBA（0.1、0.3和0.5 mg/L）、NAA（0.1、0.3和0.5 mg/L）和蔗糖（15、25和35 g/L）进行处理，统计处理20 d后各处理的生根情况，并对基部生根愈伤组织进行转录组测序分析。 结果 1/2B₅培养基较为适合北红葡萄生根。转录组测序的6个样本共获得的高质量序列共254.80 Gb，样品有88.13%~89.94% 的序列可以比对到参考基因组上，DEGs以上调表达为主。对植物激素信号转导通路进行分析，有7个DEGs可能对其生根有重要作用，生长素途径中的14个DEGs上调表达。进行qRT-PCR验证，转录组数据可信，相关系数为0.89。 结论 转录组分析得到了在北红葡萄生根期中重要的通路和关键基因，为北红葡萄生根提供理论和实践指导。

Abstract

Objective The study aimed to explore molecular mechanism of rooting of Beihong grape，providing theoretical and practical guidance for the rooting process of 'Beihong' grape breeding. Method Beihong grape tissue was cultured until at the rooting stage.After screening the type of medium suitable for rooting，the orthogonal test was designed to treat the callus at the rooting stage with different concentrations of IBA （0.1，0.3 and 0.5 mg/L），NAA （0.1，0.3 and 0.5 mg/L） and sucrose （15，25 and 35 g/L）.The rooting rate of each treatment were counted 20 days after treatment，and the callus rooted at the base of tissue culture seedlings was analyzed by transcriptome sequencing. Result The medium of 1/2 B5 was more suitable for rooting of Beihong grape.A total of 254.80 Gb high-quality sequences were obtained from 6 samples sequenced by transcriptome.The sequences of 88.13%~89.94% from the samples could be compared to the reference genome，and DEGs expression was mainly up-regulated.According to the analysis of plant hormone signal transduction pathway，7 DEGs might play an important role in rooting process，and 14 DEGs are up-regulated in auxin pathway.The qRT-PCR showed that the transcriptome data were reliable，with the correlation coefficient of 0.89. Conclusion The important pathways and key genes in the rooting process of Beihong grape were obtained by transcriptome analysis，which laid theoretical and practical basis for Beihong grape rooting.

Graphical abstract

关键词

北红葡萄 / 愈伤组织 / 生根 / 转录组测序

Key words

Bbeihong grape / callus / rooting / transcriptome sequencing

北红 （V.vinifera⁃V.amurensis L.Beihong）葡萄是中国科学院植物研究所于1954 年选育出的山欧品种，具有良好的抗病抗冻能力，果实品质优良，在我国大部分葡萄酒产区可免埋土越冬，适宜酿制葡萄酒^［1］。但是生产中发现北红葡萄扦插生根能力较差，故常规繁殖方式为嫁接，但嫁接苗在盐碱地易出现缺素和嫁接口愈合不好造成劈裂等现象，影响葡萄产量和品质。研究北红葡萄的生根机理对于其生产意义重大。

葡萄繁殖方式一般为压条、扦插、嫁接等无性繁殖，不仅受到季节的约束，还会造成苗木积累病毒^［2］。通过葡萄组织培养进行繁殖，不受季节的约束，且繁殖速度较快^［3］。生根培养是组织培养的关键之一，影响组培苗生根的主要因素有培养基类型、激素配比和碳源浓度，对葡萄生根起主导作用的激素为生长素，常用的为IBA和NAA^［4］，本研究将这两种激素混合配比进行处理。

转录组是研究某一生物在特定条件下所转录出的所有RNA集合^［5］。转录组测序技术能够获得研究对象在特定状态下的基因表达情况，可以深入研究特定生物学过程的分子机制^［6-7］。窦飞飞等^［8］基于转录组测序得出北红和新郁葡萄叶片Hsp和Hsf基因在响应高温胁迫中起重要作用。孟凡来等^［9］基于转录组测序得出IbCHS、IbDFR、IbCYP83B1等基因可能为紫甘薯叶片响应UV-B辐射增强的关键基因。曹丹等^［10］对高温胁迫下不同玉米材料间的基因差异表达分析中得到了12个与玉米耐高温胁迫相关的差异表达基因。目前，对于葡萄生根的分子机理和愈伤组织的转录组测序相关研究较少，本研究对北红葡萄进行组织培养至生根阶段，筛选出较为合适的培养基类型后，通过正交设计以不同浓度的蔗糖、NAA和IBA进行处理，分析生根期愈伤组织的转录组测序结果，进而探究北红葡萄生根的分子机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

北红葡萄组织培养试验所用外植体为其带芽茎段，2021年7月于宁夏银川平吉堡宁夏现代农业综合开发工程技术研究酿酒葡萄试验园内获取。试材为7年生“厂”形北红葡萄，株行距为0.8 m×3.0 m，南北走向。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒

带芽茎段取回后，立即选取较为健康的外植体，流水充分冲洗10 min。在超净工作台中使用70%的乙醇溶液消毒45 s，取出后使用无菌水冲洗3次，之后使用15%的H₂O₂溶液消毒6 min，再次使用无菌水冲洗4次。

1.2.2 启动培养

启动培养接种时，将已消毒的带芽茎段斜角约45°切去两端约5 mm，形态学下端接入培养基。启动培养的培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L琼脂。培养温度为25 ℃，光照时间为16 h，光照强度为2 500 lx。

1.2.3 生根培养基的筛选

待初代培养的带芽茎段芽萌发且长至5 cm左右，在超净工作台中切取长势较为均一的萌发枝条转接至生根培养基中，每瓶接1个无根苗。以0.3 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂，对1/2 MS、1/2 B₅、B₅、1/2 WPM、WPM和N₆培养基进行筛选，培养温度为25 ℃，光照时间为12 h，光照强度为2 500 lx，一个培养基类型10个样本，15 d后统计各培养基类型中组培苗的生根率及根数目，计算平均根数时，未生根的组培苗不计入统计。

1.2.4 生根培养

筛选出培养基后，以不同质量浓度IBA（0.1、0.3和0.5 mg/L）、NAA（0.1、0.3和0.5 mg/L）和蔗糖（15、25和35 g/L）进行处理。设计正交试验如表1所示，培养基琼脂质量浓度均为7.5 g/L，培养温度为25 ℃，光照时间为12 h，光照强度为2 500 lx，每组设置10个样本。观察其生根状况，待组培苗茎基部愈伤组织生出较小的根系，于根系数目增长较快时，即生根处理10 d后，取下基部愈伤组织切去周围较小根系，迅速液氮冷冻，并保存于-80 ℃冰箱中用于转录组测序及qRT-PCR验证试验。

1.2.5 RNA提取、文库构建及转录组测序

利用植物RNA提取试剂盒（美吉逾华）提取愈伤组织的总RNA，每组3个生物学重复，使用Nanodrop 2000（IMPLEN，CA，美国）检测RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳（电压5 V/cm，时间15 min）检测RNA完整性，Agilent 2100（Agilent Technologies，CA，美国）测定RIN值。利用Oligo （dT）磁珠法纯化总RNA的mRNA，并将mRNA打成片段，构建cDNA文库并进行质检，加入End Repair Mix将双链cDNA的粘性末端补成平末端。利用合成cDNA文库，由上海美吉生物医药科技有限公司基于Illumina Novaseq 6000 测序平台完成测序。

1.2.6 测序数据分析

对原始测序数据（Raw data）进行过滤，得到高质量的测序数据（Clean data）。将Clean reads用Hisat2 软件与参考基因组进行比对（参考基因来源：Vitis_vinifera； 参考基因组版本：12X； 参考基因组来源：http：//plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Info/Index），并评估比对结果。将组装获得的基因和转录本与6个数据库（NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG）进行比对，获得基因和转录本的功能信息并进行统计。以表达差异倍数|log2FoldChange|>1和校正过的P值（P-adjust＜0.05）作为筛选标准进行基因差异表达分析，筛选不同样品差异表达基因（DEGs），进行GO和KEGG富集分析。

1.2.7 qRT-PCR验证

为了验证北红葡萄生根期基部生根愈伤组织转录组测序数据的可靠性，随机选取6个DEGs进行qRT-PCR验证。使用RNAprep Pure Plant Plus Kit（TIANGEN）试剂盒提取总RNA；使用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKara）试剂盒反转录为cDNA；使用UltraSYBR Mixture（CWBIO）试剂盒，运用实时荧光定量PCR仪（Jena）进行qRT-PCR试验，选用VvEF基因（登录号：AF176496）作为内参基因，各反应进行3次重复。优化后的条件为预变性95 ℃10 min，变性95 ℃ 15 s，退火58 ℃ 30 s，40个循环，延伸72℃ 32 s。利用2^-△△CT算法计算相对表达量。特异性引物信息如表2。

2 结果与分析

2.1 生根培养基类型的筛选及转录组测序样品的选择

如表3所示，1/2 B₅培养基组中生根率达到了100%，且平均根数达到了5.6条，其次1/2 WPM组中生根率可达80%，B₅中平均根数可达6.3条，1/2 MS、B₅、1/2 WPM、1/2 WPM和 N₆生根率分别为40%、70%、80%、60%和50%，1/2 MS、1/2 B₅、1/2 WPM、1/2 WPM和 N₆平均根数分别为3.1、5.6、4.5、4.75和4.4，故选取1/2 B₅培养基为生根培养基。由图1所示，生根处理20 d，H₆主根数显著高于H₁、H₅、H₇和H₉，且H₁最少；H₂、H₃、H₄、H₅和H₆生根率都达到100%，H₁和H₉生根率为80%。H₁的主根数最少且生根率最低，H₆的主根数最多且生根率为100%，H₆主根数显著高于H₁，因此选择H₁和H₆进行转录组测序。如图2所示为各组北红葡萄生根情况。

2.2 总RNA质量特征

各样品的D_260/280在2.05~2.19，D_260/230在1.02~2.26，质量浓度在173.80~679.20 ng/μL，RIN值均为10，各指标检测合格，符合上机要求。

2.3 样本间相关性分析以及转录组测序与unigene功能统计

北红葡萄生根期愈伤组织转录组样本间相关性分析如图3所示，H₆ 3个样本间相关性较高，相关系数均在0.95以上；H_1-2和H_1-3之间相关系数为0.95，H_1-2与H_1-3相关系数为0.73，H_1-1与H_1-2相关系数为0.69。北红葡萄生根期愈伤组织H₁和H₆的转录组测序下机数据如表4所示，各样品Clean reads数在38.27~44.11 Mb，错误率均低于0.03%，Q20均大于97.19%，Q30均大于91.86%，6个cDNA文库中的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）核苷酸的GC含量变化范围在45.99%~46.64%。88.13%~89.94%的Clean Reads 比对到参考基因组上，2.78%~3.56%的Reads比对于多个位置，85.06%以上比对于唯一位置，明确数据可以用于后续分析。

将28 742条unigene在6个数据库（NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG）中进行功能注释（表5），其中有27 839条unigene 得到注释，占总unigene 的96.86%，unigene在NR数据库中获得的注释最多，占总unigene的96.71%；其次是COG数据库，占总unigene的89.05%，unigene在GO、KEGG、Swiss-Prot和Pfam数据库注释率依次为87.62%、41.04%、73.58%和74.56%。

2.4 差异表达基因分析

如图4所示，利用Origin绘制火山图展示DEGs分析结果。 以表达差异倍数|log₂FoldChange|>1和矫正过的P值（P-adjust＜0.05）作为筛选标准进行基因差异表达分析。图4中的点越靠近左右两边其表达差异越显著。结果表明，H₁和H₆中共有977个DEGs，其中显著上调的DEGs 784个，显著下调的DEGs 193个，DEGs的差异倍数大多集中-4~8，-log₁₀（p-adjust）的0~10，这些DEGs以上调表达为主。

2.5 差异表达基因GO富集分析

为了进一步研究北红葡萄生根愈伤组织的生根过程中DEGs的生物学功能，GO富集分析表明，一共富集350个条目，P-value从小到大展示20个条目（图5）。GO富集分析主要分为分子功能、生物学过程和细胞组分3个亚类。DEGs主要富集在氨裂解酶活性（GO：0016841）、氧化还原酶活性（GO：0016709）和苯丙氨酸酶活性（GO：0045548）等分子功能；在L-苯丙氨酸代谢过程（GO：0006558）、红糖4-磷酸/磷酸烯醇丙酮酸家族氨基酸代谢过程（GO：1902221）和次级代谢产物生物合成过程（GO：0044550）等生物学过程；质外体（GO：0048046）细胞组分。

2.6 差异基因KEGG代谢通路分析

如图6所示，从KEGG富集通路中以P-adjust从小到大选取20个通路进行展示。KEGG富集分析显示分别有33、28、10、6和15个基因显著富集于苯丙烷生物合成、植物激素信号转导、苯丙氨酸代谢、类胡萝卜素生物合成和MAPK信号通路-植物通路中。苯丙烷生物合成、植物激素信号转导、苯丙氨酸代谢、类胡萝卜素生物合成和MAPK信号通路-植物通路中上调表达DEGs分别为30、24、10、5和11个，下调表达DEGs分别为3、4、0、1和4个，KEGG富集分析显著富集通路中有80个DEGs都为上调表达，占总DEGs的86.96%（图7）。

2.7 激素相关基因的表达分析

植物激素信号转导以内源激素为信号，来调控植物生长发育和对外界刺激的应答。KEGG富集分析中植物激素信号转导通路中富集的基因较多，P-adjust 值极小，富集因子较大，试验以不同浓度蔗糖、NAA和IBA进行处理，故着重分析植物激素信号转导通路。北红葡萄生根期中愈伤组织在植物信号转导通路上共富集DEGs 28个。DEGs富集于生长素、乙烯、脱落酸、水杨酸、细胞分裂素、油菜素内酯、赤霉素途径。生长素途径包括Aux/IAA、GH3、SAUR基因家族，ARF转录因子、转运蛋白LAX和AUX，共14个DEGs，均在H₆中上调表达；细胞分裂素途径包括AHP和ARR蛋白相关基因，共3个DEGs，均在H₆中上调表达；脱落酸途径中包括受体蛋白PYL、丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶PP2C和SnRK2蛋白相关基因，共5个，H₆中2个PYL和SnRK2相关基因下调表达，3个PP2C相关基因上调表达；乙烯途径2个EFR转录因子在H₆中上调表达；水杨酸途径中2个PR1蛋白相关基因在H₆中上调表达；赤霉素途径PIF4蛋白相关基因1个，H₆中下调表达；油菜素内酯途径中BSK蛋白相关基因1个，在H₆中下调表达。总体来看，H₆中上调表达基因较多，生长素途径尤为明显，14个DEGs全部上调表达。其中有7个DEGs表达量差异尤为显著，包括3个Aux/IAA家族基因、2个EFR家族基因、1个GH3基因家族和VvPR1（图8）。

2.8 DEGs的qRT-PCR 验证

为了验证转录组测序结果的可靠性，从DEGs中随机选取6个，进行qRT-PCR进行验证（图9）。对qRT-PCR验证结果与RNA-seq数据进行Pearson相关性分析（图10），发现两者的相关系数较高（0.89），且趋势相近，表明RNA-seq分析结果可靠。

3 讨论

本研究筛选出较为适合北红葡萄生根的培养基类型为1/2B₅，这与徐美隆等^［11］的研究基本一致，之后通过不同浓度IBA、NAA和蔗糖处理，对组培苗基部生根愈伤组织进行转录组测序分析。齐向丽等^［12］研究表明，红国王组培苗适合根系生长的蔗糖浓度为25~30 g/L，较高的碳源浓度不利于根系的生长。DEGs 共977个，DEGs主要以上调表达为主。对植物激素信号转导通路中28个DEGs进行表达量分析，发现生长素途径中Aux/IAA、GH3和SAUR家族基因，ARF转录因子以及生长素运输蛋白LAX和AUX相关基因均为上调表达。

生长素是一种促进根形成的重要激素，在不定根的起始和发生过程中都起到重要作用^［13-14］。植物生长素可以在嫩叶、子叶和根系中合成^［15-16］，在植物体中游离态具有活性，当浓度过高时结合到其他分子，可以储存或者进一步分解^［17］。生长素的运输包括韧皮部长距离运输和极性运输^［18］，极性运输中包括促进其流入的蛋白（AUX1和LAX）以及促进其流出蛋白（P-Glycoprotein ABC和PIN）^［19-20］。植物激素信号转导通路中富集到了2个AUX和LAX3基因，且在H₆中上调表达，未富集出促使生长素流出的转运蛋白基因，H₆增加了促进生长素流入蛋白相关基因的表达量。植物生长素早期应答基因主要为Aux/IAA、SAUR和GH3 3类基因家族^［21］。Aux/IAA是重要的生长素原初响应基因，其家族大多数成员都与根系生长发育有关^［22］，生长素通过调节Aux/IAA蛋白，进而快速诱导一系列生长素响应基因的表达^［23］。ARF转录因子家族，其与生长素响应原件结合，抑制或促进生长素应答基因的表达，实现对植物生长发育的控制^［24-25］。Aux/IAA蛋白可以通过互作控制ARF的活性，进而促进下游响应基因的表达^［26-27］。H₆中6个Aux/IAA和3个ARF相关基因均为上调表达，高质量浓度生长素处理，会增加Aux/IAA和ARF的表达量，其中机理比较复杂，H₆中3个Aux/IAA家族基因的表达量与H₁差异明显，可能是北红葡萄生根的关键基因。有研究表明，IAA1、IAA9、IAA11、IAA13、IAA26和IAA33等都对水稻根系的形成，侧根的发育有不同程度的影响^［28］。GH3-6属于Ⅱ类GH3基因，具有维持生长素的动态平衡和调节植物生长发育的作用，其可以控制根的生长^［29］，GH3-6在H₆中表达量较高，且与H₁差异明显，对于北红葡萄生根十分重要。SAUR家族基因其功能包括调控细胞生长、生长素的合成和转运、影响乙烯受体信号并促进植物生长等，在葡萄中具有生长因子和转录以及转录调控功能^［30-31］，其在H₆中为上调表达基因。研究表明，乙烯可以促进不定根的形成 ^［32-33］，乙烯响应因子EFR可以与其他蛋白协同作用，共同调控下游基因的表达^［34］，EFR相关基因都在H₆中都有较高的表达量，表达量都与H₁中差异明显，在研究EFR对拟南芥根系影响的研究中发现，EFR过表达上调YUC5，下调CYP83A1，进而增加根系IAA含量^［35］，EFR可能为北红葡萄生根的关键基因。本研究发现北红生根期愈伤组织中响应高质量浓度IBA、NAA和蔗糖的DEGs大部分起关键的正向调控作用。有7个DEGs表达差异尤为显著，分别涉及到Aux/IAA家族基因3个、EFR家族基因2个、GH3家族基因1个和VvPR1。 这7个DEGs可能在北红葡萄的生根中起到至关重要的作用。

4 结论

本研究对北红葡萄组织培养生根培养基类型进行筛选，1/2 B₅培养基具有较高的生根率，之后以不同质量浓度蔗糖、NAA和IBA进行处理，H₆具有较高的生根率和主根数。基于转录组测序对H₁和H₆生根期愈伤组织进行分析，获得了较为完整的转录组数据，并对其进行功能注释、富集分析和激素相关基因表达量分析。生长素途径中有14个DEG_S，且在H₆中均为上调表达，说明生长素途径在北红葡萄生根中作用重大。在植物信号转导通路中有7个差异较大的DEGs，可能为北红葡萄生根的关键基因。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2020AAC03093)