党参内生细菌荧光假单胞菌RHBA17生物学特性及其对宿主的促生作用

Growth-promoting properties of Pseudomonas fluorescens RHBA17 and its effect on Codonopsis pilosula

摘要

目的 为探究荧光假单胞菌RHBA17的生理特性和对党参促生能力。 方法 从党参根部组织中分离出一株内生细菌，对其菌落形态和显微形态特征进行观察，运用生理生化，16S rRNA分子生物学对菌株进行鉴定，并对其螯合铁载体能力、产IAA能力、合成生物被膜能力、解磷能力、产酶特性等方面进行分析。 结果 分离到的菌株经鉴定隶属于假单胞菌科荧光假单胞菌属（Pseudomonas fluorescens），命名为荧光假单胞菌RHBA17（P.fluorescens RHBA17）。菌株RHBA17最适生长温度为25℃，最适pH为7.0，能在0%~11% NaCl范围生长。此外该菌株还具有很好的溶磷作用，可以产蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶，在高盐、强碱环境中具有产IAA能力且具有较高活性，这些结果说明菌株RHBA17具有较好的促进植物的生长能力。盆栽实验结果表明，RHBA17菌株显著增加了党参的根长和根鲜重，与CK组相比，株高提高了16.05%和9.43%，根长提高了7.69%，根鲜重提高了12.92%。 结论 菌株RHBA17具有较强的耐碱性，耐盐性，对恶劣环境也有一定的抵抗能力，能促进党参的生长。为进一步开发研制党参促生菌剂或微生物有机肥提供资源，为菌株RHBA17在农业生产中的应用提供了理论依据和实验基础。

Abstract

Objective The study aimed to investigate the physiological characteristics and the growth-promoting ability of Pseudomonas fluorescens RHBA17 on Codonopsis pilosula. Method In this study，an endophytic bacterium was isolated from the root tissue of Codonopsis pilosula，and its colony morphology and micromorphological characteristics were observed.The strain was identified using physiological and biochemical methods，16S rRNA molecular biology，and its ability for iron chelation，indole-3-acetic acid （IAA） production，biofilm synthesis，phosphorus decomposition，and enzyme production were analyzed. Result The isolated strain was identified as Pseudomonas fluorescens RHBA17，which exhibited optimal growth at 25 ℃ and pH 7.0，and demonstrated tolerance to the range of 0% to 11% NaCl.Moreover，the strain exhibited efficient phosphorus solubilization，as well as the production of protease，amylase，and xylanase.It also demonstrated the ability to produce IAA and exhibited high activity in high salt and strong alkali environments.These findings indicated that strain RHBA17 possessed significant plant growth-promoting capabilities.In a pot experiment，the RHBA17 strain significantly increased the root length and root fresh weight of Codonopsis pilosula.Compared to the control group，the plant height increased by 16.05% and 9.43%，root length increased by 7.69%，and root fresh weight increased by 12.92%.In summary，strain RHBA17 exhibits strong alkali and salt resistance，as well as tolerance to harsh environments，making it a suitable candidate for promoting the growth of Codonopsis pilosula. Conclusion This study provides valuable resources for the development of growth-promoting agents or microbial organic fertilizers for Codonopsis pilosula and establishes a theoretical and experimental foundation for the application of strain RHBA17 in agricultural production.

Graphical abstract

关键词

荧光假单胞菌 / 生物被膜 / 铁载体 / IAA / 溶磷 / 促生作用 / 党参

Key words

Pseudomonas fluorescens / biofilm / iron carrier / IAA / phosphorus solubilization / growth promotion / Codonopsis pilosula

植物内生菌是自然状态下栖息在植物内部，不会引起宿主植物明显疾病的微生物类群^［1-2］。国内外现有的研究表明，内生菌能够促进宿主植物生长发育、降解有毒物质和抗病原真菌或细菌化感作用、提高宿主植物对非生物和生物胁迫的耐受性^［3-5］，一些内生菌与其宿主植物形成了特殊的共生关系，并能诱导和促进植物代谢产物的合成和积累，进而影响活性药物成分的质量和产量^［6］。越来越多的研究对宿主植物的内生真菌进行了探索，发现了大量具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等多种生物活性代谢产物的植物内生菌，该领域的研究大部分都集中在药用植物上^［7-9］。叶晓婉等^［10］从明党参中分离出29株内生细菌，进一步研究发现其中有株菌对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。经过长期的自然演化，内生菌除了通过基因水平转移等合成与宿主植物相同或相似的生物活性物质，还能通过提高宿主植物对营养物质的吸收利用、调节生长相关激素等途径，促进植物在正常或不利条件下更好地生长。Scherling等^［11］研究表明具有固氮能力的Paenibacillus sp.P22能够增加杨树体内天门冬酰胺和尿素的含量，以及三羧酸循环中的有机酸和糖的消耗，从而改变宿主的氮同化模式。内生细菌可以分泌酸性磷酸酶，通过酸化、螯合等途径溶解磷酸盐，从而增加植物可利用磷的含量^［12-13］。具有溶磷特性在内生细菌中普遍存在于植物中并促生长^［14-15］。内生细菌还可以通过调节植物激素促进寄主植物生长，其中吲哚乙酸（IAA）是促进植物生长的主要激素，可诱导根原基的生成、细胞分裂和分化，并参与植物细胞间的信号转导等过程。赵晓妍等^［16］从野生大豆分离筛选的产生 IAA 的YDX14 菌株，可以显著促进小麦的生长。

因此，植物内生菌不仅是蕴藏着丰富天然化合物的宝库，同时为生物促生提供了自然来源。本研究从党参中分离出一株内生菌，对其生化特性和分子生物学鉴定，并初步对其植物促生特性等进行了研究，发现其具有潜在的植物促生作用。

1 材料与方法

1.1 培养基

所有培养基按表1配方配制，于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min备用。所有试剂皆为分析纯，分别采购于生工生物工程（上海）有限公司和北京索莱宝生物科技有限公司（Solarbio）。

1.2 仪器设备

超净工作台，苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；恒温振荡培养箱，上海一恒科技有限公司；高速冷冻离心机Eppendorf 5804R，德国；数码成像光学显微镜，奥林巴斯，日本；扫描电子显微镜，蔡司，德国；PCR扩增仪，BioRad，美国；电泳槽及电泳仪，BioRad，美国；全能型成像系统，BioRad，美国；Cary50紫外可见分光光度计，Varian，美国；高效液相色谱仪，Agilent公司，美国；气相色谱，Agilent公司，美国。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的分离、纯化

参照赵晓妍等^［16］的方法，将采自甘肃省定西市（N 34°26′~35°35′，E 103°52′~105°13′）党参的根浸入70%乙醇中30 s，用次氯酸钠溶液（2.5%有效氯）浸泡5 min，用70%乙醇漂洗30 s，最后用无菌蒸馏水洗涤5次，用无菌滤纸吸干水分备用。取0.5 g已消毒的根和5 mL无菌水混合在无菌研钵中并充分研磨，静置片刻后，取200 μL上清液涂布于Luria-Bertani（LB）培养基上，于30 ℃培养5 d。根据菌落形态挑取不同细菌，并在LB固体培养基上划线筛选、纯化，最后将纯化后的菌株保藏于25%甘油溶液中于储存在-80 ℃冰箱备用。

1.3.2 菌株RHBA17的生理生化特性鉴定

参照伯杰氏细菌鉴定手册描述的生理生化测试方法，评价菌株RHBA17的生理特性。分别按照法国梅里埃API ZYM、API 20 NE、API 50 CH试纸条及Biolog GEN III微孔板（bioMerieux）试剂盒说明书操作，分析该菌株的产酶特性、碳源利用和利用碳源产酸等理化特性。

1.3.3 菌株RHBA17的分子生物学鉴定

使用细菌基因组大量提取试剂盒提取菌株RHBA17的基因组DNA作为模板。以通用引物27F（5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492 R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）为扩增引物进行PCR扩增^［17-18］。PCR反应体系为（25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 1 μL，dd H₂O补足至 25 μL。PCR 反应程序为：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性 1 min，56 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，将质量合格的PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将核苷酸序列在NCBI/BLAST进行比对，筛选与其相似性较高的其他菌株16S rRNA序列，利用MEGA（Version 7.0），采用最大似然法法（Kimura 2-parameter model，Boots trap method 1 000）构建系统发育树。

1.3.4 不同条件下菌株RHBA17螯合铁载体能力测定

将RHBA17菌液接种于前述不同盐浓度、pH的MKB培养基中，于前述多种温度，180 r/min恒温振荡培养24 h。将培养液于室温下、8 000 rpm离心10 min，吸取适量上清液加入等体积的CAS检测液，充分混匀，静置l h后，吸取200 μL上清液于96孔微孔板中，测定630 nm波长处的吸光值（A）及参比值（Ar），螯合铁载体能力计算公式如下：

螯合铁载体能力（%）=（Ar-A）/Ar×100%^［19］

1.3.5 不同条件下菌株RHBA17产IAA能力分析

参照Ikram等^［19］的方法测定菌株RHBA17产IAA的能力。将活化后的菌株接种于含有0.5 g/L L-色氨酸的培养基中，180 r/min，28 ℃恒温摇床震荡培养，48 h后发酵液离心（1 000 r/min，10 min），取上清液与显色液的混合液200 μL（1∶1）于96孔微孔板中，测定其在530 nm处的吸光值，并计算菌悬液浓度D₆₀₀=1.0时合成的IAA量（mg/L·D₆₀₀）。

1.3.6 不同条件下菌株RHBA17合成生物被膜能力测定

将活化后的菌株RHBA17接种于5 mL不同盐浓度、pH和温度的LB液体培养基中振荡培养过夜；取10%待测菌液在无菌的加样槽中与新鲜的LB混匀；吸取100 μL混合液于96孔微孔板中，每株菌设8个重复；于28 ℃培养24 h；将96孔微孔板中菌液轻轻地倒掉，然后用去离子水缓慢地从96孔微孔板的一端冲洗2遍；吸取150 μL 0.1%结晶紫染液于96孔微孔板中，染色15 min；然后用去离子水缓慢冲洗2遍；向96孔微孔板中加入200 μL 95%乙醇，15 min后测定595 nm处的吸光值，通过D₅₉₅/D₆₀₀值评估菌株生物被膜的合成能力^［25］。

1.3.7 菌株溶磷能力的定性分析

将活化后的菌株接种于解磷培养基中，于28 ℃恒温培养6 d后观察菌落周围是否出现透明圈，并测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）^［16］。

1.3.8 菌株产胞外酶能力测定

采用点值法检测菌株产纤维素酶、木聚糖素酶、蛋白酶和淀粉酶的情况，并测定此四种酶的酶活力。

1.3.9 菌株RHBA17对党参的促生效果研究

将杀菌消毒后的党参种子于室温条件下（20±5） ℃用50 mL后续处理液浸泡48 h。本试验共设计无菌水处理组（CK）、10⁸ cfu/mL荧光假单胞菌RHBA17菌液处理组（G）、10⁸ cfu/mL荧光假单胞菌RHBA17和本实验室分离的另一促生菌（地芽孢杆菌RHBA19）混合处理组（M）（V/V=1∶1）。将处理后的种子播种于装有灭菌基质（硅藻土：蛭石：草酸盐4∶2∶1）的塑料盆栽中，每个处理6盆，每盆4粒种子，定期浇水，温度控制在（22±2）℃，湿度65%，在16 h的光照和8 h黑暗条件下交替生长，整个盆栽试验在兰州理工大学植物培养间（海拔：1 530.49±5.2 m，经纬度：E 103°46'34''，N 36°3'20''）进行。培养至第90 d后，测定各处理组植株的株高（从茎的底部到顶芽）、根长、地上部鲜质量和根鲜质量^［21］。

2 结果与分析

2.1 菌株RHBA17的鉴定

采用传统微生物分类形态学观察技术对培养48 h后的菌株RHBA17进行了菌落形态和染色观察（表2）。结果表明RHBA17菌株在LB固体培养基上呈半透明淡黄色圆形菌落，湿润，中间隆起，表面光滑。染色结果显示其属于革兰氏阴性菌、无孢子、有荚膜。该菌株甲基红试验呈阳性，V-P试验呈阴性，能够将硝酸盐还原成亚硝酸盐，可以利用柠檬酸盐；该菌株能够产生过氧化氢酶和H₂S气体。初步判定菌株RHBA17归属为荧光假单胞菌属（Pseudomonas fluorescens）。

为进一步确定两株菌的归属，将菌株RHBA17 DNA序列在NCBI进行BLAST同源性分析并构建系统发育树（图1），结果显示RHBA17菌株与3株荧光假单胞菌属菌株的16S rRNA序列相似性> 99.7%，与模式菌株ATCC 13 525^T在一个分支，菌株RHBA19与模式菌株JAM-FM 0901^T在一个分支（图1）。由此说明RHBA17菌株隶属于假单胞菌科荧光假单胞菌属（Pseudomonas fluorescens），暂将其命名为荧光假单胞菌RHBA17（P.fluorescens RHBA17）。

2.2 菌株RHBA17的环境适应性

将菌株RHBA17置于16 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和37 ℃培养24 h后观察其生物量，如图2-A所示，菌株RHBA17在16 ℃~37 ℃范围中均能生长。菌株RHBA17在25 ℃时生物量最大，D_600nm达到1.31±0.03。对菌株RHBA17的最适pH进行了测定，如图2-B所示，其能在pH 6~11的范围中生长，最适pH为7.0，在pH 7时的D₆₀₀为1.18±0.03。测定了在不同NaCl浓度（0%、1%、3%、5%、7%、9%和11%）中的生物量，如图2-C所示。其在能0%~11% NaCl范围生长。随着NaCl浓度的增加，菌株RHBA17的生物量呈先升后降的趋势，且在1% NaCl时生物量达到最大，D₆₀₀为1.22±0.02。

2.3 菌株的促生性能研究

2.3.1 不同环境下菌株RHBA17产铁载体能力分析

不同温度、pH和NaCl浓度对RHBA17产生铁载体能力的影响如图3-A所示。随温度的升高，RHBA17产铁载体能力呈先增后降的趋势，在25 ℃时产铁载体能力最强达到31.36%±0.84%，在37 ℃时不产铁载体。随pH的升高，菌株RHBA17的产铁载体能力呈先增加后降低的趋势，在pH为4、5、10、11时菌株RHBA17不产铁载体，在pH为7时产铁载体量为32.66%±3.17%达到最高（图3-B）。随NaCl浓度的增加，菌株RHBA17产铁载体能力呈先增加后降低的趋势，在9%和11% NaCl浓度下不产铁载体，在1% NaCl条件下产铁载体能力最强为35.18%±1.26%（图3-C）。综上，菌株RHBA17在强碱，高浓度盐环境条件能产铁载体，说明菌株RHBA17具有较强的耐碱性，耐盐性，对恶劣环境也有一定的抵抗能力。

2.3.2 不同环境下菌株RHBA17产IAA量的分析

由图4可知，不同温度、pH和NaCl浓度对菌株RHBA17产生IAA能力有显著性影响（P<0.05）。温度对菌株IAA的产生影响如图4-A所示，随着温度的升高，菌株RHBA17产IAA能力呈先增后降的趋势，菌株RHBA17在30 ℃时产IAA量最多为（13.13±0.14） mg/L。RHBA17在16 ℃不产IAA。图4-B表示不同pH条件下IAA的量，随pH的升高，菌株RHBA17的IAA产量呈先增后降的趋势，且在pH为7时产量达到最大，为（13.30±1.00 ）mg/L，RHBA17菌株在pH为4、5、10和11时不产IAA。不同NaCl浓度下两株菌株产IAA量如图4-C所示，随NaCl浓度的增加，菌株RHBA17产IAA能力呈先增后降的趋势，在1% NaCl时产IAA量达到最大为（14.58±1.29） mg/L，在9%和11% NaCl时不产IAA。综上，菌株RHBA17在高盐、强碱环境中具有产IAA能力且具有较高活性，这些结果说明菌株RHBA17具有较好的促生长能力。

2.3.3 不同环境下菌株RHBA17形成生物被膜的能力分析

由图5可知，随温度的升高菌株RHBA17株形成生物被膜能力呈先增后降的趋势，在25 ℃时形成生物被膜能力最强为1.13±0.17，在37 ℃时不能形成生物被膜（图5-A）。随pH的升高，其形成生物被膜能力呈先增后降的趋势，在pH为4、5、10和11环境中不能形成生物被膜。RHBA17在pH为7时形成生物被膜能力最强，为1.16±0.19（图5-B）。随NaCl浓度的增加，其形成生物被膜能力呈先增后降的趋势，在0%~5% NaCl环境中均有能形成生物被膜，且菌株在1% NaCl环境中形成生物被膜能力最强，为1.18±0.17（图5-C）。综上，菌株RHBA17在高盐、强碱环境中均能形成生物被膜。

2.3.4 菌株RHBA17溶磷和产胞外酶能力分析

内生菌通过溶磷作用加快土壤中磷的溶解从而促进植物生长。对菌株RHBA17进行溶磷能力测试，结果如表3所示，菌株RHBA17具有较强的溶磷能力。RHBA17菌株可以产蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶。表明菌株RHBA17有较好的溶磷和产胞外酶能力，具有较好的促进植物生长的作用。

2.4 菌株RHBA17对党参生长的影响

经Duncan检验和分析表明，3个处理组下党参的地上鲜质量和根长差异显著（P<0.05）。与未接种组（CK）相比，接种RHBA17（G）和混合菌株（M）显著增加了党参的根长和根鲜质量，G组和M组均促进党参株高，但均不显著。与CK组相比，G组和M组株高分别提高了16.05%和9.43%，根长分别提高了7.69%和19.71%，根鲜质量分别提高了12.92%和13.37%（表4，图6）。综上所述，RHBA17菌制剂能促进党参的生长，与单一菌剂相比，混合菌剂对党参生长的作用效果更为显著。

3 讨论

本研究从党参根部中分离到1株内生细菌，经多种方式鉴定为荧光假单胞菌RHBA17（Pseudomonas fluorescens RHBA17），是许多药用植物中普遍存在的内生细菌。Kubi等^［22］从植物根际分离到一株具有促进生长能力的耐冷的假单胞菌，该菌株被多次报道其存在于不同植物的根际和根内 ^［23］。荧光假单胞菌RHBA17在11%的NaCl条件下都能很好地生长，表明这个菌株具有很强的耐盐性。这很可能与当地干旱和高盐环境有关。有研究表明，嗜盐微生物具有促进植物生长和代谢物积累的特点^［24］。因此，本研究推测荧光假单胞菌RHBA17在促进植物生长中能发挥出重要的作用。

许多研究表明内生菌株可以促进植物生长和积累代谢物^［24-25］，其通过固氮、溶解磷、产铁载体、产IAA产生、产生物膜、产胞外酶、产植物激素和氰化氢等多种途径促进植物的生长发育^［26］。本研究发现荧光假单胞菌RHBA17在与党参互作过程中，具有良好的促生长能力，并且在产生IAA、铁载体、生物被膜和木聚糖酶方面都具有较强的能力。有研究表明从马利筋中分离得到的能够生产IAA的三株内生真菌（Penicillium chrysogenum、Alternaria alternate和Sterile hyphae）可以显著增加玉米植株的根长^［27］。分离自玉米中的芽孢杆菌具有多种促生特性，其中能够螯合铁载体的菌株可以有效抑制玉米中病原菌的生长从而保护植物^［18］。Lucero等^［28］研究发现能够形成生物被膜的内生细菌对促进小麦生长和生物防治的重要性。将荧光假单胞菌RHBA17和另一株地芽孢杆菌RHBA19混合研究其对党参的促生作用结果发现RHBA17菌制剂能促进党参的生长，与单一菌剂相比，混合菌剂对党参生长的作用效果更为显著。Khan等^［29］也有类似的研究结果，从海滩植物中分离出的6株内生细菌可以促进水稻的生长并缓解盐胁迫。本研究说明两种菌剂能够促进党参生长与其具有良好的促生能力有关。从普通乳草（Asclepias sinaica）中分离出的三株内生真菌Penicillium chrysogenum，Alternaria alternate和Sterile hyphae具有较强的产IAA能力，可显著提高玉米的根长^［30］，能够产生铁载体的芽孢杆菌可以抑制玉米中病原菌的生长^［16］。基于此，推测荧光假单胞菌RHBA17通过分泌上述促生长指标来促进党参的生长。值得注意的是，混合菌剂（M）在促进党参生长中作用更显著。

4 结论

本研究认为荧光假单胞菌RHBA17通过溶磷、产IAA、生物被膜、胞外酶、螯合铁载体等多种方式促进党参生长和代谢物的积累，因此，菌株RHBA17作为菌肥对提高党参的质量和产量具有较大的潜力。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32160066)

甘肃省自然科学基金项目(20JR5RA475)

兰州理工大学青年人才支持计划项目(2018)