分子标记辅助聚合番茄抗病自交系的选育

Molecular marker-assisted breeding of tomato resistant inbred lines

摘要

目的 将不同的抗病基因聚合到一个材料中，筛选具有综合抗病性强的番茄自交系。 方法 利用分子标记辅助选择技术，将抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-1、抗烟草花叶病毒基因Tm-2^a 、抗叶霉病基因Cf-9、抗枯萎病基因I-2聚合到同一个材料中，对同时含有4种抗病基因的番茄自交系进行室内接种鉴定，并比较分析田间主要农艺性状。 结果 6个自交系J3、J9、J14、J29、J36、J41同时聚合了Ty-1、Tm-2^a 、Cf-9、I-2等4个抗病基因，室内抗病接种鉴定其抗性水平均达到抗病（R）及以上，J14单果质量220 g，果实硬度10.2 Ka/cm²，坐果率78.5%，单株产量3.5 kg；J41，单果质量235 g，果实硬度10.5 Ka/cm²，坐果率73.4%，单株产量3.8 kg，各农艺性状显著优于对照华番11。 结论 通过分子标记辅助选择得到的6个番茄自交系同时含有4种抗病基因，田间农艺性状表现优良，可作为抗病自交系进行育种。

Abstract

Objective This study aimed to aggregate different resistance genes into a single material for the purpose of screening tomato inbred lines with comprehensive resistance. Method The molecular marker-assisted selection technique was employed to combine the anti-tomato yellow leaf bending virus disease gene Ty-1，anti-tobacco mosaic virus gene Tm-2a，anti-leaf mildew gene Cf-9，and anti-fusarium wilt gene I-2 into the same material.The tomato inbred lines containing all four resistance genes were inoculated and identified in the laboratory，and their main agronomic traits were compared and analyzed. Result The results revealed that six inbred lines （J3，J9，J14，J29，J36 and J41） successfully integrated Ty-1，Tm-2a，Cf-9 and I-2 resistance genes.J14 exhibited resistance levels of R or above，with a single fruit weight of 220 g and a fruit hardness of 10.2 Ka/cm².It demonstrated a fruit setting rate of 78.5% and a yield per plant of 3.5 kg.Similarly，J41 displayed a single fruit weight of 235 g，fruit hardness of 10.5 Ka/cm²，fruit setting rate of 73.4%，and yield per plant of 3.8 kg.The agronomic characteristics of J41 were significantly superior to those of the control variety Huafan 11. Conclusion In conclusion，the six tomato inbred lines obtained through molecular marker-assisted selection contain all four disease resistance genes simultaneously and exhibit favorable agronomic traits in the field.These lines can serve as valuable resources for breeding disease-resistant tomato varieties.

Graphical abstract

关键词

番茄 / 分子标记 / 抗病 / 自交系 / 育种

Key words

tomato / molecular marker / disease resistance / inbred lines / breeding

番茄是我国重要的蔬菜作物，栽培面积大，但各种病害发生严重，制约了番茄的可持续发展^［1］。番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）、烟草花叶病毒病（TMV）、叶霉病（Cladosporium fulvum）、枯萎病（Fusarium oxysporum）等病害发病率高，传播速度快，对番茄产业造成严重威胁^［2］。优良自交系是番茄新品种选育的前提和关键，利用分子标记辅助选择技术（MAS），将不同的抗病基因聚合到一个材料中，筛选具有综合抗病性强的亲本材料，是现阶段选育新品种的重要手段^［3］。

随着分子生物学的不断发展，番茄中抗TYLCV基因Ty-1^［4］、抗TMV基因Tm-2^a［5］、抗叶霉病基因Cf-9^［6］、抗枯萎病基因I-2^［7］已被鉴定和克隆。王军等^［8］利用分子标记辅助选择聚合水稻抗病基因Stv-bi、Pi-b和Pi-ta，选育出高产、优质、多抗水稻新品系；毕研飞等^［9］利用分子标记辅助甜瓜抗蔓枯病基因的聚合，创建了甜瓜抗病育种的分子标记选择系统，大大提高了育种效率；陈莉菁等^［10］利用 Cf-9、Mi-1、I-2、Ph-3等基因标记得到6份同时含4个抗病基因的番茄材料。传统育种方法时间长，选择效率低，大量分子标记的开发和利用，使得农作物育种时间大幅缩短，加快了育种进程^［11］。近几年，分子标记辅助育种技术已在多种作物中被广泛利用，并取得良好效果。

本研究利用国内已公布的Ty-1、Tm-2^a 、Cf-9、I-2基因标记，对番茄不同世代的分离群体进行田间选择和抗性鉴定，获得同时含有4种抗病基因的自交系，兼顾果实等主要农艺性状，淘汰不良株系，为番茄新品种的选育提供优质的种质资源，为其他农艺性状的分子标记选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

J15，由河西学院园艺学团队提供，含有Tm-2^a 、Cf-9、I-2抗病基因，华番11为华中农业大学选育的杂交一代番茄新品种，含有Ty-1抗病基因，SH903为张掖市绿之源农业发展有限公司选育的自交系，该材料不含以上4种抗病基因，作为感病对照。苗期接种鉴定所用的番茄黄化曲叶病毒、烟草花叶病毒、叶霉病病菌、枯萎病病菌由华中农业大学番茄课题组提供。

1.2 DNA提取与分子标记检测

番茄 DNA 的提取参照CTAB法^［12］，Ty-1基因分子标记检测利用双重SNP标记NL2-3^［13］，NL2-3的引物序列见表1，PCR反应体系：ddH₂O 15.2 μL，1×10 Buffer（Mg^2＋）2.0 μL，Primer NL3-F：0.2 μL，Primer NL3-R：0.2 μL，Primer NL2-F：0.4 μL，Primer NL2-R：0.4 μL，dNTP 0.4 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 1 μL。Tm-2^a 、Cf-9、I-2基因分子标记检测参照孙亚林^［14］的方法，引物序列见表2，PCR的反应体系为：1×10 Buffer（Mg^2＋）2.0 μL，0.5 μmol/L Forward Primer（FW） 0.5 μL，0.5 μmol/L Reverse Primer （RV） 0.5 μL，0.25 mnol/L dNTPs 0.5 μL，0.05 U/μL Taq DNA聚合酶10.2 μL，6 ng/μL模板DNA 0.5 μL。

1.3 基因聚合过程

2018年春季将J15定植于河西学院校内实训基地，苗期用Tm-2^a 、Cf-9、I-2分子标记检测105个单株，得到同时含3种抗病基因的单株材料11株，用华番11作父本，分别和11个单株杂交，获得杂交种，然后进行自交分离，在后代分离群体中，连续用4种抗病分子标记检测单株，单株留种，到F₆代4种抗病基因不再分离，结合果实相关农艺性状，剔除不良株系，其余即可作为稳定自交系。2022年在室内进行苗期抗性接种鉴定。

1.4 苗期接种鉴定

番茄黄化曲叶病毒接种鉴定参照叶青静等^［15］的方法，在密封的日光温室内，番茄幼苗4片叶时人工释放带TYLCV的烟粉虱侵染番茄材料，任其自然传播，30 d后统计各番茄材料的发病情况。病情指数=0，免疫；0<病情指数<2，高抗（HR）；2<病情指数<15，抗病（R）；15<病情指数<30，中抗（MR）；30<病情指数<100，感病（S）。

烟草花叶病毒接种鉴定参照许向阳等^［16］的方法，番茄幼苗3片叶时，每株接种2片相似的小叶，20 d后统计发病情况。病情指数同上番茄黄化曲叶病毒抗病等级。

叶霉病菌接种鉴定参照许向阳等^［16］的方法，番茄幼苗3片叶时，选取整齐一致的幼苗，在叶背面喷雾接种，20 d后统计发病情况。病情指数同上番茄黄化曲叶病毒抗病等级。

枯萎病菌接种鉴定参照许向阳等^［16］的方法，番茄幼苗3片叶时，选取整齐一致的幼苗，用10mL菌液对每株进行灌根，20 d后统计发病情况。病情指数同上番茄黄化曲叶病毒抗病等级。

1.5 主要农艺性状调查

对含有4种抗病基因的自交系进行主要农艺性状调查比较，包括植株整齐度、果实形状、单果质量、果实硬度、坐果率、单株产量等，调查标准参照《番茄种质资源描述规范和数据标准》。

2 结果与分析

2.1 分子标记辅助检测抗病基因

对F₃代分离群体进行单株抗病PCR分子检测。含抗番茄黄化曲叶病毒病基因（Ty-1）的纯合材料扩增出984 bp的条带，感病材料扩增出1 424 bp的条带，杂合材料扩增出984 bp和1 424 bp 2条条带，在检测的15株分离群体中，1、2、8、9、10、11含有纯合Ty-1基因，7、13、14、15含有杂合Ty-1基因，4、5、6不含Ty-1基因，如图1所示。

含抗番茄抗烟草花叶病毒病基因（Tm-2^a ）的材料扩增出约472 bp的条带，不含Tm-2^a 基因的材料无扩增条带，在检测的14株分离群体中，1、2、3、4、5、9、10、11、12、13、14含有Tm-2^a 基因，6、7、8不含Tm-2^a 基因，如图2所示。

含抗番茄叶霉病基因（Cf-9）的材料扩增出约415 bp的条带，不含Cf-9基因的材料无扩增条带，在检测的15株分离群体中，1、10、11、12、13、15含有Cf-9基因，2、3、4、5、6、7、8、9、14不含Cf-9基因，如图3所示。

含抗番茄枯萎病基因（I-2）的材料能扩增出500 bp的条带，不含I-2基因的材料扩增出720 bp的条带，杂合抗病材料扩增出500 bp和720 bp 2条条带，在检测的10株分离群体中，1、2、3、4、5、10含有纯合I-2基因，11含有杂合I-2基因，6、7、8、9、12、13、14、15不含I-2基因，如图4所示。

2.2 含有4个抗病基因分子标记检测

在F₆代分离群体中继续进行单株抗病分子标记检测，J3、J9、J14、J29、J36、J41共6个株系的后代群体同时含有4个抗病基因，其他材料含有1~3个不同的抗病基因，如表3所示。6个株系继续进行自交分离筛选，到F₇代抗病基因没有发生分离，可作为稳定自交系进行杂交配组。

2.3 番茄自交系苗期抗病性鉴定

2022年春季，对同时含有Ty-1、Tm-2^a 、Cf-9、I-2抗病基因的6个F₇代聚合材料进行室内接种鉴定。由表4可知，接种番茄黄化曲叶病毒后，华番11、J3、J29、J36、J41达到高抗水平，J9、J14达到抗病水平，J15表现为感病；接种烟草花叶病毒后，华番11表现为感病，J15、J14、J29、J41达到抗病水平，J3、J9、J36达到高抗水平；接种叶霉病菌后，华番11表现为感病，J15、J3、J14、J36、J41达到抗病水平，J9、J29达到高抗水平；接种枯萎病菌后，华番11表现为感病，J15、J3、J36、J41达到抗病水平，J9、J14、J29达到高抗水平。综上，聚合4种抗病基因的6个番茄自交系接种病原后均表现出抗病或高抗水平。

2.4 聚合多抗性番茄自交系农艺性状比较分析

2022年春季对同时含有4个抗性基因的F₇代自交系进行了田间主要农艺性状的比较与分析。由表5可知，J36、J41的单果质量显著高于华番11，J3、J14与华番11无显著差异；果实硬度方面，J3、J29、J36与华番11无显著差异，其他几个株系显著抵于华番11；J14、J41的坐果率显著高于华番11，其余株系与华番11无显著差异；单株产量方面，J14、J36、J41显著高于华番11。综上，J14、J41的综合性状优于华番11。

3 讨论

通过常规育种技术结合分子标记辅助育种，可提高亲本的抗病性，节约成本，加快育种进程，并且提高了育种的准确性。孙海波等^［17］利用常规杂交技术将抗白叶枯病基因Xa23、抗稻瘟病基因Pi-1和抗条纹叶枯病基因Stvb-i聚合到1个材料中，并通过花药培养使目的基因纯化，再利用分子标记技术在低世代筛选含目的基因的植株，仅用2 a时间，就选育出10份抗病材料，田间表现高抗病性，后代能稳定遗传无分离，较常规育种时间缩短一半。许向阳等^［18］利用抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3、Cf-5、Sw-5检测了128份番茄材料，2份材料含有3种抗性基因，12份材料含有2种抗性基因，分子标记检测结果与田间抗病性调查结果一致，表明分子标记选择技术结果真实可靠，同时结合田间主要农艺性状，选择果形美观、色泽亮丽、整齐度好、坐果率高，抗2种以上病害的多抗性材料，可显著提高番茄育种效率。近年来，随着生物技术和分子生物学的发展，一大批番茄种质资源被挖掘，一些控制番茄重要农艺性状的分子机理被解析^［19-20］，与抗病性、果实硬度、营养品质、不育性等紧密连锁的分子标记被开发和利用，显著提高了我国番茄育种水平^［21-22］，国内育种单位自主培育的番茄新品种浙杂503、华番13、东农727、秋盛、卓粉等正在占据主导地位。

利用分子标记辅助聚合多个抗病基因的同时，应兼顾果实形状、果实品质、产量、商品性等重要农艺性状，并结合配合力分析，选育出抗病性强、综合性状优良、遗传力强的自交系，为番茄育种提供更多的育种材料。

4 结论

本研究获得的6个番茄自交系J3、J9、J14、J29、J36、J41同时含有Ty-1、Tm-2^a 、Cf-9、I-2抗病基因，经过接种鉴定其抗性均达到抗病及以上水平，田间主要农艺性状表现优良，可作为番茄育种的亲本材料进行杂交配组和新品种选育。

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基金资助

甘肃省陇原青年创新创业人才项目(2021LQGR17)

甘肃省高等学校创新基金项目(2022A-117)