黄瓜枯萎病拮抗菌株的防病促生性能鉴定

Identification of disease control and growth promoting ability of antagonistic strains of cucumber Fusarium wilt strains

摘要

目的 有效防治设施黄瓜枯萎病，促进我国黄瓜产业的持续健康发展。 方法 通过对筛选得到的枯萎病拮抗菌株的促生性能进行鉴定，并开展黄瓜幼苗栽培试验，验证所试拮抗菌株对黄瓜幼苗枯萎病的防效。 结果 所试8株拮抗细菌均具一定的促生性能，菌株固氮酶活性、有机磷溶磷量和分泌IAA浓度范围分别为133.97~876.83 nmol （C₂H₄）/（h·mL）、14.14~20.08 μg/mL、3.43~17.78 μg/mL，其中促生性能较好的有抗生素溶杆菌42-3、唐菖蒲伯克霍尔德菌L1-3、少动鞘氨醇单胞菌L5-4和蜡样芽孢杆菌L3-1。栽培试验结果显示，唐菖蒲伯克霍尔德菌L1-3和少动鞘氨醇单胞菌L5-4对黄瓜幼苗枯萎病的防治效果最好，发病率仅为24.83%，防治效果分别为36.67%和42.67%。唐菖蒲伯克霍尔德菌L1-3对幼苗的促生效果更优，有助于黄瓜抗氧化酶活性提高。 结论 相较其他菌株，唐菖蒲伯克霍尔德菌L1-3对黄瓜幼苗枯萎病的防效更优，促生效果显著，可用于在实际生产中防治黄瓜枯萎病及其他土传病害，具有很大的研究价值。

Abstract

Objective To effectively control cucumber Fusarium wilt and promote the sustainable and healthy development of the cucumber industry in China. Method The progeny of the selected antagonistic strains against Fusarium wilt was identified and the cucumber seedling cultivation experiment was carried out to verify the control effect of the tested antagonistic strains against Fusarium wilt. Result The eight antagonistic strains all had specific probiotics，and the nitrogenase activity，soluble organic phosphorus content and secreted IAA concentration ranged from 133.97 to 876.83 nmol (C₂H₄)/(h·mL),14.14 to 20.08 μg/mL and 3.43 to17.78 μg/mL,respectively.Among them,Lysobacter antibioticus 42-3,Burkholderia cepacia L1-3,Sphingomonas paucimobilis L5-4 and Bacilllus cereus strain L3-1 had better probiotics. The results of cultivation experiment showed that Burkholderia cepacia L1-3 and Sphingomonas paucimobilis L5-4 had the best control effect on cucumber seedling Fusarium wilt，the incidence was 24.83%，the control effect was 36.67% and 42.67%.The effect of Burkholderia cepacia L1-3 on seedling growth promotion was better，which helped to increase the activity of antioxidant enzymes in cucumber. Conclusion Compared with other strains，the control effect of Burkholderia cepacia L1-3 on cucumber seedling fusarium wilt was better and the growth promoting effect was significant，which could be used in the study of cucumber fusarium wilt and other soil-borne diseases in actual production，and had great research value.

Graphical abstract

关键词

黄瓜枯萎病 / 微生物菌剂 / 土传病害 / 促生效果 / 病害防治

Key words

cucumber fusarium wilt / microbial agent / soil-borne diseases / growth promoting effect / disease control

黄瓜（Cucumis Sativus L.）作为我国最重要的设施蔬菜之一，种植面积居世界首位，超过世界栽培总面积的一半以上，对我国设施农业经济的发展具有重要意义^［1-2］。黄瓜枯萎病（Cucumber fusarium wilt）是由尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）引起的一种真菌型土传病害，其病原菌会破坏植物维管束，进而影响植株对水分的吸收和运输，造成植株枯死^［3-4］。黄瓜枯萎病可贯穿黄瓜的整个生长期，严重造成黄瓜减产甚至绝收，且因其爆发性强、破坏力大、防控难等特征，一直严重制约着世界黄瓜产业的发展^［5］。

目前对于黄瓜枯萎病的防治方法主要有生物防治、化学药剂防治和农业防治^［5-6］。化学药剂防治虽然可以在短期内有效抑制或杀死土壤中的病原菌，但长此以往不仅会对土壤环境造成无法挽回的污染，还可能使病原菌产生抗药性^［6］。而农业防治虽然可以有效减少病害发生，但由于设施栽培的单一性和连续性，诸如嫁接、配方施肥、栽培抗性品种等农业防治方法不仅费时费工，而且不能彻底消灭病原菌^［7］。微生物防治作为一种环保、高效的生物防治作物土传病害的方法，近年来备受农业科研工作者瞩目。不同于农业防治方法和使用化学杀菌剂，微生物菌剂可以更直接的作用于土壤中的病原微生物，抑制病原菌生长和繁殖，从而缓解病原菌对作物生长的胁迫，降低病害的发生率^［8］。同时，有研究表明施用外源有益微生物可以有效促进植物对土壤养分的吸收，增强植株生物量的积累，提高植物对土传病害的抗性^［9］。韦巧婕等^［10］研究发现芽孢杆菌配制的微生物菌肥可有效促进黄瓜生长，降低黄瓜枯萎病的发生率，同时该菌肥还对多种作物的病害均具有显著防效。梁银等^［11］分离的放线菌CT205也被证实对黄瓜生长具有显著的促生作用，对黄瓜枯萎病防效达51.85%。罗文建等^［12］在黄瓜根际土壤中分离出一株贝莱斯芽孢杆菌，经研究发现，其对黄瓜枯萎病的防治效果为66.03%，防效显著。

现如今，随着我国设施农业的大力发展，作物土传病害的防治已成为促进现代设施农业可持续发展的重中之重。黄瓜枯萎病作为一种毁灭性的全球性病害，合理有效的防治对我国黄瓜产业的发展具有重要意义^［13］。本试验以筛选自10 a连作黄瓜健康植株根际土壤中的黄瓜枯萎病拮抗细菌为研究材料，通过对菌株的促生效果（固氮酶活性、溶磷性能、分泌IAA性能）进行鉴定，并开展黄瓜幼苗栽培试验，研究微生物菌剂对黄瓜幼苗枯萎病的防治效果和对幼苗生长生理的影响，以期为设施黄瓜生产过程中枯萎病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

菌株来源：由甘肃省武威、靖远、兰州的黄瓜枯萎病发病田块（连作10 a以上）黄瓜根际土壤中分离筛选得出，各菌株对尖孢镰刀菌生长均具有较好的拮抗效果，抑菌圈直径>15.0 mm，其中L1-3抑菌圈最大，为20.8 mm，见表1。

靶标病原菌：尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum），由中国农业科学院蔬菜花卉所植保研究室提供。

1.2 拮抗菌株促生功能鉴定

试验于2021年6月在甘肃省农业科学院蔬菜研究所微生物实验室进行。分别对拮抗菌株进行促生功能（固氮、溶磷及分泌IAA能力）的鉴定，研究不同菌株的促生能力。菌株固氮酶活性测定采用乙炔还原法（acetylene reduction assays，ARA），方法参考撖冬荣等^［14］、高亚敏等^［15］的相关文献。使用钼蓝比色法进行溶磷能力定量测定，参考柴晓虹等^［16］的方法。分泌IAA能力定性及定量测定分别采用Salkowski比色法和紫外分光光度法，方法参考李明源等^［17］的相关文献。

1.3 黄瓜幼苗栽培试验

1.3.1 试验材料

试验于2021年8~9月在甘肃省农业科学院蔬菜研究所试验地塑料大棚内进行，供试黄瓜为甘丰袖玉，供试菌株选用试验1.2中促生性能较好的42-3、L1-3、L5-4和L3-1 4种菌株。

1） 拮抗菌发酵液制备：将无拮抗反应的4株供试菌株分别接种于50 mL液体LB培养基（30 min，121 ℃灭菌）^［18］中，于28 ℃、140 r/min振荡培养2 d，待细菌充分生长后，放于6 ℃冰箱保存。黄瓜播种前将培养好的菌液用无菌水调节浓度至D₆₀₀达0.6左右。

2） 黄瓜枯萎病菌悬液制备：将保存好的黄瓜枯萎病菌种用接种针接种到PDA培养基（30 min，121 ℃灭菌）^［19］中，待培养基布满菌丝后，倒入无菌水刮取菌丝，双层纱布过滤除去菌丝，将滤液用无菌水稀释为浓度1×10⁶ CFU/mL的孢子悬浮液，置于6 ℃冰箱冷藏备用。

3） 栽培基质：山东聊城鲁亿育苗基质有限公司与山东齐鲁大学联合研发的固体育苗基质，有机质含量35%~45%，腐殖酸含量15%~25%，pH值5.5~6.5。

1.3.2 试验设计

选取籽粒饱满、大小均匀的黄瓜种子，经55 ℃温水浸种30 min后均匀铺洒在湿毛巾上，置于温箱（28 ℃）中催芽24 h，挑选长势一致的种子（胚根长约1 cm）充分浸没在制备好的黄瓜枯萎病菌悬液中30 min后捞出。试验以CK（未接种枯萎病菌悬液、未施菌剂）为清水对照，设K（只接种枯萎病菌）、KJ₁（枯萎病菌+42-3菌剂）、KJ₂（枯萎病菌+L1-3菌剂）、KJ₃（枯萎病菌+L5-4菌剂）、KJ₄（枯萎病菌+L3-1菌剂）共5个处理。将黄瓜种子播于5×10育苗穴盘中，一穴一粒，每处理50粒，3次重复，同时每穴对应施加5 mL配置好的拮抗菌剂（对照组中分别加入5 mL LB液体培养基）。种子播好后覆土覆膜，将穴盘搬至棚中，在黄瓜生长至第30天时进行植株的生长生理指标测定。试验采用随机区组设计，黄瓜出芽80%及以上时揭掉塑料薄膜，日常田间管理与试验地管理一致。

1.4 黄瓜幼苗栽培试验测定项目及方法

1） 生长指标：株高、茎粗分别用直尺和游标卡尺测量；叶面积（第2片真叶）使用叶面积仪（托普云农TPYX-A）测量；单株鲜质量：植株利用清水反复冲洗，再用吸水纸吸干，用分析天平测定植株鲜质量。

植株根冠比=\frac{\mathrm{地下}\mathrm{部鲜}\mathrm{质量}}{\mathrm{地上}\mathrm{部鲜}\mathrm{质量}}×100

壮苗指数=(\frac{\mathrm{茎粗}}{\mathrm{株高}}+\frac{\mathrm{地下}\mathrm{部干}\mathrm{质量}}{\mathrm{地上}\mathrm{部干}\mathrm{质量}})×全株干质量

2） 生理指标：叶绿素含量采用丙酮提取法测定；根系活力采用氧化三本基氮唑法（TTC）测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定；过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性使用Solarbio生化试剂盒测定。

3） 抗病性指标：黄瓜苗期枯萎病分级标准及病情指数计算参照宛宝洁等^［20］的相关文献。

0级：无症状；1级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积不超过总面积的50%；2级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积超过总面积的50%；3级：叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活；4级：全株严重萎蔫，以致枯死。

植株发病率为病原菌接种后30 d各处理发病株数占调查总株数的百分比。

病情指数=\frac{\sum (\mathrm{病级}\mathrm{株数}\times \mathrm{代表}\mathrm{级数})}{\mathrm{植株}\mathrm{总数}\times \mathrm{最高}\mathrm{代表}\mathrm{级值}}×100

防治效果=\frac{\mathrm{对照}\mathrm{病情}\mathrm{指数}-\mathrm{处理}\mathrm{病情}\mathrm{指数}}{\mathrm{对照}\mathrm{病情}\mathrm{指数}}×100

1.5 数据整理与分析

采用Excel 2019和Spss 2015进行数据整理、分析，并通过单因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan法进行显著性分析，数据均以平均值±标准误（mean±SE）表示。使用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株促生性能测定

对所试8种拮抗菌株（表1）的促生功能分别进行测定，结果如表2所示，8种拮抗菌株均具一定的固氮、溶磷、分泌IAA能力，固氮酶活性范围为133.97~876.83 nmol （C₂H₄）/（h·mL），有机磷的溶解量范围在14.14~20.08 μg/mL，其中固氮酶活性较高的是L1-3、L5-4和42-3，有机磷溶磷量较大的是L1-3、L3-1和L5-4、51-3。L1-3固氮酶活性和有机磷溶磷量均显著高于其他菌株，其次是L5-4和L3-1。L5-4的IAA分泌能力最强，其次是42-3。IAA分泌浓度定性测定结果（图1）显示，42-3和L5-4在加入显色液后颜色最深，两菌株间差异不明显，N-2次于前两者，其余各拮抗菌株加入显色液后样品颜色较浅，菌株分泌IAA能力较弱，定量测定显示所试菌株IAA分泌浓度为3.43~17.78 μg/mL，分泌IAA能力较强的是L5-4和42-3。

所试菌株中，菌株L1-3固氮酶活性和有机磷溶磷量均显著高于其他菌株，且具较强的分泌IAA能力，42-3固氮酶活性和IAA分泌浓度较高。菌株L3-1溶磷效果较强，仅次于L1-3。

2.2 不同微生物菌剂对黄瓜幼苗生长的影响

由表3可知，接种病原菌的黄瓜幼苗相比对照，植株各生长指标均明显降低。施加微生物菌剂的处理相比未施菌剂（K），除KJ₄外，黄瓜幼苗茎粗均增长显著，KJ₃幼苗株高、茎粗、叶面积分别显著增长27.79%、20.05%、26.58%，与CK无显著差异，壮苗指数显著增加24.24%，同时，除KJ₃外，其他菌剂处理幼苗单株鲜质量均显著低于CK。KJ₂壮苗指数最大，与各处理差异显著，比K处理提高48.49%。微生物菌剂的施加均不同程度地促进了带病黄瓜幼苗生长，缓解了病原菌对黄瓜幼苗生长的胁迫影响，其中KJ₂促生效果更好，其次是KJ₃。

2.3 微生物菌剂处理对黄瓜幼苗叶绿素含量的影响

叶绿素是植物光合作用过程中最重要的色素，微生物菌剂的施加有效促进感病植株叶绿素含量的增加，促进植株同化产物的积累和对养分的吸收。图3显示，黄瓜幼苗在接种黄瓜枯萎病后植株叶绿素含量均显著下降，叶绿素a、b、a+b含量分别下降33.33%、22.64%、32.13%。微生物菌剂处理相比未施菌剂的K处理，KJ₁叶绿素a、b、a+b分别显著提高50.58%、30.49%、48.16%，KJ₂处理叶绿素a、a+b显著升高。

2.4 微生物菌剂对黄瓜幼苗根系活力的影响

由图4可以看出，微生物菌剂均显著提高了黄瓜幼苗的根系活力，在施加微生物菌剂后，各处理黄瓜幼苗根系活力均显著大于K处理，其中KJ₂的幼苗根系活力最大，比K处理提高169.57%，比CK提高20.90%，其次是KJ₁，显著提高138.57%。

2.5 微生物菌剂对黄瓜幼苗可溶性蛋白含量的影响

枯萎病菌会影响黄瓜植株可溶性蛋白的积累，K处理可溶性蛋白含量相比CK显著降低3.56%。同时，相比微生物菌剂处理，KJ₁、KJ₃和KJ₄可溶性蛋白含量均显著提高，KJ₃比K处理增加6.10%，比CK增加2.62%，差异显著。KJ₃微生物菌剂处理有效促进了幼苗可溶性蛋白的积累，同时提高了植株抗逆性（图5）。

2.6 微生物菌剂对黄瓜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

接种枯萎病菌导致黄瓜植株POD活性显著下降，活性降低42.56%。微生物菌剂处理中，KJ₁对黄瓜幼苗抗氧化酶活性影响较小，植株抗氧化酶活性与K处理差异不显著且均显著低于对照。KJ₃处理黄瓜幼苗POD、SOD活性相比K处理均差异显著，分别提高59.49%、46.55%，与对照无显著差异。此外，KJ₂和KJ₄处理幼苗POD活性亦显著高于K处理（图6~7）。

2.7 微生物菌剂对黄瓜幼苗枯萎病的防治效果

对各处理黄瓜幼苗发病率调查分析，结果显示，试验所用4种拮抗菌均能有效抑制黄瓜幼苗枯萎病的发生，施加微生物菌剂的黄瓜幼苗发病率显著降低。其中KJ₂和KJ₃处理发病率最低，仅为24.83%，相比K处理显著下降40.33%，病情指数分别为15.94和14.43，KJ₃处理的防治效果最好，达42.67%（表4）。

3 讨论与结论

为促进现代农业的可持续健康发展，减少使用化学杀菌剂对环境的污染，利用微生物防治作物土传病害的研究已成为一大热点。黄瓜枯萎病作为黄瓜最重要的病害之一，在发病时往往会对生产者造成严重的经济损失^［21］。现阶段，利用微生物防治黄瓜枯萎病的研究颇多，包括真菌^［22］、放线菌^［23-24］，以及芽孢杆菌属、单胞菌属和溶杆菌属等多种细菌。本研究通过对温室黄瓜发病田块的土壤微生物进行筛选鉴定，并分别测定各菌株的促生性能，得到抗生素溶杆菌（42-3）、唐菖蒲伯克霍尔德菌（L1-3）、少动鞘氨醇单胞菌（L5-4）和蜡样芽孢杆菌（L3-1）4种促生性能较好的黄瓜枯萎病拮抗菌株。芽孢杆菌属和溶杆菌属已被多项研究证实，可以有效防治黄瓜枯萎病等多种作物病害的发生^［25］。季倩茹等^［26］的研究表明，芽孢杆菌在单施和联用时均可有效防治黄瓜幼苗枯萎病，可以显著促进黄瓜植株生长和抗氧化酶活性的提高。宫安东等^［27］在研究一株伯克霍尔德菌后发现其具有高效的溶磷效果，对苗期玉米的促生作用显著，同时其产生的挥发性物质对多种病原真菌具有高效广谱的抑制作用。王志刚等^［28］的研究表明，鞘氨醇单胞菌具有较好的解磷和分泌IAA能力。本研究中对拮抗菌株促生性能的测定结果与前人研究结果一致。4种菌株均具较好的促生性能，其中唐菖蒲伯克霍尔德菌（L1-3）抑菌效果最好。

黄瓜枯萎病菌侵染会影响黄瓜植株地上部和地下部对水分和养分的吸收运输，从而抑制黄瓜植株生长和生物量等的积累，降低黄瓜的抗氧化酶活性^［29］。研究结果显示，所试不同微生物菌剂对带病黄瓜的促生效果不同，但均可有效提高带病黄瓜的根系活力和可溶性蛋白含量。相比之下，抗生素溶杆菌（42-3）和唐菖蒲伯克霍尔德菌（L1-3）对带病黄瓜的促生作用更优，植株壮苗指数和叶绿素含量显著升高，对黄瓜根系活力的提升效果亦优于其他两菌。过氧化物酶和超氧化物歧化酶能够及时清除植物体内过多的自由基，使其维持在一个正常的动态水平，以提高植物的抗逆性，保证植物正常生长发育^［30］。通过对比分析，唐菖蒲伯克霍尔德菌（L1-3）和少动鞘氨醇单胞菌（L5-4）对带病黄瓜抗氧化酶活性的提升效果更好，有助于提高黄瓜幼苗抗性。张璐^［31］研究发现，抗生素溶杆菌可以有效降低黄瓜幼苗枯萎病发病率，死株率仅37.50%，防治效果22.86%。在黄秋斌等^［32-33］的研究中，蜡样芽孢杆菌也被证实对小麦纹枯病、根腐病病原菌的抑菌效果明显，防病效果显著。本研究中，微生物菌剂处理后的黄瓜幼苗枯萎病发病率均明显降低，病害防治效果良好，并且在各微生物菌剂施用浓度及施用量等一致的条件下，相比抗生素溶杆菌（42-3）和蜡样芽孢杆菌（L3-1），唐菖蒲伯克霍尔德菌（L1-3）和少动鞘氨醇单胞菌（L5-4）对黄瓜枯萎病的防治效果更好，这也与前期拮抗菌株抑菌筛选结果匹配。

综上所述，唐菖蒲伯克霍尔德菌（L1-3）对黄瓜幼苗枯萎病的防治效果更优，能够更好地缓解病原菌对黄瓜幼苗生长的抑制，促进黄瓜幼苗生长，提升植物抗性。然而该菌在针对作物病害方面的研究报道较少，对比其他研究常用菌种，该菌在作物病害防治方面具有较大的研究潜力，但该菌在实际生产中对作物病害的防治程度及菌剂作用机理尚待进一步研究。

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基金资助

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