黄瓜果实弯曲特性差异蛋白质组学研究

A comparative proteomic investigation of fruit bending in cucumber（Cucumis Sativus L.）

摘要

目的 采用蛋白质组学技术，从蛋白表达水平的角度探究黄瓜果实弯曲的分子机制，对系统地解析黄瓜果实弯曲形成和调控的复杂机理具有重要意义。 方法 利用双向凝胶电泳和质谱分析技术，研究黄瓜开花座果期、果实膨大期和商品成熟期黄瓜顺直果实、弯曲果实腹部和脊部的蛋白水平变化，筛选黄瓜弯曲特性相关差异表达蛋白，利用生物信息学方法对差异蛋白的生物学功能、参与生物过程、调控机制与蛋白之间的相互作用、染色体定位信息等进行分析，并结合实时定量PCR技术对基因表达模式进行验证，挖掘黄瓜果实弯曲相关基因。 结果 分别从3个时期中筛选出11、7和43个差异表达蛋白，通过功能分析发现22个功能类别参与黄瓜弯曲过程；层次聚类分析和染色体定位分析发现，商品成熟期生命活动最为活跃，并且第6染色体在黄瓜果实弯曲形成和调控过程中发挥相对重要的作用；结合mRNA水平验证，筛选出与黄瓜果实弯曲相关的关键蛋白核酮糖1，5-二磷酸羧化酶加氧酶大亚基、天冬氨酸蛋白酶、14-3-3蛋白等，这些蛋白主要参与氧化还原过程、细胞周期、光合作用和脂类代谢等功能。 结论 为进一步探索黄瓜果实弯曲形成的相关调控机制奠定了基础。

Abstract

Objective The objective of this study was to investigate the molecular mechanism underlying cucumber fruit curvature by examining changes in protein expression levels.Understanding the complex mechanisms involved in the formation and regulation of cucumber fruit curvature is crucial. Method Two-dimensional gel electrophoresis and Mass Spectrometry were used to analyze the protein level changes in straight and curved cucumber fruits at three stages：fruit setting，fruit development，and fruit maturity.Differentially expressed proteins （DEPs） associated with cucumber curvature were identified，and their biological functions，involvement in various biological processes，interaction between regulatory mechanisms and chromosome localizations were analyzed.Additionally，real-time quantitative PCR analysis was conducted to validate the genes related to fruit curvature in cucumber. Result A total of 11，7，and 43 DEPs were identified at the three respective stages，covering 22 functional categories.Hierarchical clustering and chromosome localization analyses revealed that the fruit maturity stage exhibited the highest activity，with chromosome 6 potentially playing a significant role in the formation and regulation of cucumber fruit curvature.Furthermore，through mRNA level verification，several key proteins linked to cucumber fruit curvature were identified，including ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase oxygenase large subunit，aspartic protease，and 14-3-3 protein.These proteins were involved in redox processes，transport，cell cycle regulation，photosynthesis，and protein hydrolysis. Conclusion The findings of this study provide a foundation for further exploration of the regulatory mechanisms underlying cucumber fruit curvature.

Graphical abstract

关键词

黄瓜 / 果实 / 弯曲 / 蛋白质组学 / 生物信息学

Key words

cucumber / fruit / bend / proteomics / bioinformatics

黄瓜（Cucumis sativus）是世界上重要的瓜类蔬菜作物之一，栽培面积广泛，果实形状是其重要的商品性状，直接影响黄瓜的外观品质、风味和口感^［1-2］。黄瓜果实形状通常以果形指数为分类标准，从相近的同一类中鉴定黄瓜果实弯曲性^［3］。在黄瓜栽培和育种工作中，果形一直是育种者重点关注的性状之一，有效减少弯曲果实的比率，培育顺直、整齐一致的品种尤为关键^［4］。因此，开展黄瓜果实弯曲性研究将有助于提高黄瓜生产的商品率，为明确黄瓜果实弯曲机理、培育果形优良的新品种提供理论依据。

黄瓜弯曲果实的发育是一个复杂的调控过程，属于由多基因控制的数量遗传，主要是由基因加性效应所控制，并具有较高的遗传力^［5］。Zhang等^［5］以弯曲黄瓜品种L18和顺直品种D9320为亲本构建F₂代群体，通过数量性状位点（QTL）分析在6号染色体上鉴定到1个与黄瓜果实弯曲相关的QTL位点，最近标记距离为2.5 cm。从组织细胞学角度分析，黄瓜果实细胞的数量和大小决定了果实的形状，细胞分裂和细胞膨大在其中起到关键作用^［6］。葛长军^［7］通过石蜡切片的方法观察弯曲果实L18的果皮，发现凸面的外果皮细胞大于凹面，并且中果皮细胞大小不一。近几年，Wang等^［8］通过对弯曲黄瓜果实凹面、凸面和顺直果实进行转录组分析，发现与乙烯合成和信号通路相关基因的表达水平相比于顺直果实差异显著，其中CsERF025转录因子极显著差异表达。进一步研究表明CsERF025促进乙烯合成相关基因的表达和乙烯的产生，从而促进黄瓜果实弯曲。Li等^［9］研究发现过量表达CsYUC10b基因，会导致果实两侧生长素对称合成，从而诱导黄瓜顺直果实发育。徐圆等^［10］发现黄瓜Cs14-3-3基因可能通过调节控制细胞周期停止的激酶WEE1的活性和油菜素甾醇类化合物（BRs）信号转导通路参与黄瓜果实弯曲。这些结果表明植物内源激素在黄瓜弯曲果实形成过程中发挥重要作用，与拟南芥顶端弯钩形成过程相关报道类似^［11-13］。尽管几个黄瓜果实弯曲相关基因已经得到分离与鉴定，但关于该性状的分子机制研究仍有待深入研究。

基于质谱的蛋白质组学弥补了基因组学和转录组学之间的不足，被广泛用于研究参与特定生理过程的关键蛋白，以及蛋白质翻译后修饰、蛋白质表达谱的构建、功能分析和蛋白质之间相互作用^［14］。蛋白质组学与基因组学、转录组学、代谢组学整合，将有助于更好地理解植物各项生命活动^［15］。目前，黄瓜蛋白质组学已被广泛应用到盐胁迫下黄瓜幼苗的响应机制、干旱和盐胁迫下的黄瓜种子的反应机制、黄瓜幼苗根系代谢和黄瓜抗花叶病毒等^［16-19］，但针对黄瓜果实弯曲的蛋白响应机制尚未见报道。因此，为了对黄瓜果实弯曲的复杂活动有全面和深入的认识，将从蛋白组学角度挖掘黄瓜弯曲果实差异表达蛋白、对弯曲发生的反应途径以及信号调控网络，对从整体上系统地解析黄瓜果实弯曲形成和调控的复杂机理具有重要意义。

本研究利用双向凝胶电泳和质谱分析技术，研究不同发育时期黄瓜顺直果实、弯曲果实腹部和脊部蛋白质组的变化规律，获得黄瓜果实弯曲性相关的关键蛋白，初步探索不同发育时期黄瓜果实弯曲的调控机制。结合GO、Cluster分析等生物信息学手段对差异蛋白质的生物学功能、调控机制等进行鉴定，利用实时定量PCR技术检测黄瓜顺直果实、弯曲果实腹部和脊部的基因表达量变化，探索黄瓜果实弯曲的调控机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以果实易弯曲的黄瓜品种L18为试验材料，种植在浙江省农业科学院试验基地温室，正常田间管理。在开花座果期、果实膨大期及商品成熟期（即开花后第6天、第12天和第18天）时，采摘植株第12~15节的顺直果实和自然弯曲果实，沿果实中线将弯曲果实腹部、脊部分离，在果实中部取样，每份样品由至少3个不同单株的6个果实等量混合而成，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 黄瓜果实弯曲特性蛋白质组学分析

1.2.1 蛋白质提取

使用液氮研磨后，参照三氯醋酸（TCA）/丙酮沉淀法^［20］进行黄瓜果实蛋白质的提取。提纯的蛋白质干粉转入1.5 mL Eppendorf（EP）管中，保存于-80 ℃超低温冰箱。

1.2.2 蛋白质定量

采用Bradford的方法^［21］测定样品中蛋白质浓度，以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，并作定量标准曲线。用紫外分光光度计测定每个蛋白样品在595 nm处的相对吸光度，将测出的样品溶液OD值代入标准曲线读取浓度。

1.2.3 双向电泳

黄瓜果实双向电泳采用24 cm、pH 4~7 IPG非线性胶条（Bio-rad），蛋白质的上样液总体积为460 μL，在聚焦仪中进行等电聚焦。等电聚焦程序设定如下：50 V水化12 h，300 V慢速升压0.5 h，700 V慢速升压0.5 h，1 500 V线性升压1.5 h，9 000 V线性升压3 h，9 000 V快速升压4 h，使整个聚焦过程所用总电压达52 000 V时完成蛋白等电聚焦分离^［22-23］。

将IPG胶条放入8 mL平衡缓冲液Ⅰ（6 mol/L尿素、20%甘油、2%SDS、0.375 mol/L^{Tris-HCl和1 mol/L DTT）中平衡15 min；再用8 mL平衡缓冲液Ⅱ（6 mol/L尿素、20%甘油、0.375 mol/LTris-HCl和2.5 mol/LIAA）平衡15 min，IAA平衡过程保持避光。迅速将平衡好的胶条在10×电泳缓冲液（3% Tris碱、14.4%甘氨酸、1% SDS）中涮洗1次，转到12.5% SDS-PAGE凝胶上方，使胶条下端紧密接触二向胶胶面并加入0.5%的低熔点琼脂糖封胶液［24］。加入1×电泳缓冲液后，最开始设定每片胶2 W进行电泳45 min，然后以每片胶17 W进行电泳至溴酚蓝达到凝胶底部即可停止电泳。采用胶体硝酸银染色法对2-DE胶进行染色［25］。}

1.2.4 凝胶图像分析和质谱鉴定

采用UMAX PowerLook 1 100 XL 扫描仪对凝胶进行图像扫描（300 dpi，256灰阶），将图像用PD Quest v8.0.1图像分析软件进行斑点检测、组内分析和胶图匹配分析等，筛选表达量上调2倍以上（P<0.05）的蛋白点为差异表达蛋白点，并将这些点用于质谱分析^［26］。

将差异蛋白点用切胶笔切取，使用胰酶（Promega）对蛋白点进行胶内酶解，并对其进行肽段抽提与点靶^［27］。利用德国布鲁克（Bruker Dalton）Autoflex speed™ MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析。利用软件FlexAnalysis（Bruker Dalton）过滤基线峰、识别信号峰。利用BioTools（Bruker Dalton）软件搜索NCBI数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，以鉴定的蛋白质为何种蛋白质。

1.2.5 生物信息学分析

根据质谱分析原始数据，进行数据预处理及均一化，每组样品试验重复3次。数据合并后利用两样本student t检验和差异倍数方法筛选差异表达蛋白质。对筛选出的差异蛋白进行GO功能注释分析，并通过Cluster软件和Tree View软件对差异表达蛋白质进行层次聚类分析。将鉴定到的差异表达蛋白质所对应的基因序列信息与黄瓜基因组数据库相比对，获得差异基因在染色体上的位置信息。

1.3 实时荧光定量分析

取50~100 mg果实样品，利用Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取黄瓜果实总RNA。并采用Agilent 2 100分析仪器、配套试剂和软件对1 μL总RNA进行完整性分析和定量分析，定量范围25~500 ng/μL。对8个差异蛋白点序列信息进行分析，以β-action为内参，引物序列见表1。将RNA反转录成cDNA，并参照Takara公司的实时荧光定量试剂盒的说明书进行Real time PCR扩增。反应体系总体积为20 μL，包括2 μL cDNA模板，10 μL的SYBR Master Mix缓冲液，20 mmol/L的上、下游引物分别0.4 μL，Milli Q水补足体积至20 μL。采用Bio-Rad CFX96，按照机器说明书进行扩增，PCR程序设置为：预热温度95.0 ℃，3 min。扩增一共设置35个循环，具体步骤为95.0 ℃，10 s；56.2 ℃，20 s；72.0 ℃，20 s。溶解曲线分析为70.0 ℃~95.0 ℃，每5 s增加0.5 ℃。利用2^-ΔΔCt方法进行相对表达量数据分析，用3次重复的平均值进行作图。

2 结果与分析

2.1 黄瓜果实弯曲特性相关差异表达蛋白质分析

分别从开花座果期、果实膨大期及商品成熟期的黄瓜果实中检测到2 114、1 929和2 368个与果实弯曲相关的差异蛋白质，即顺直果实、弯曲果实腹部和脊部之间存在着表达差异的蛋白质。以t检验（P<0.05）且表达量变化2倍以上为标准，在3个时期分别筛选出符合标准的差异蛋白点56个、47个和94个。3个发育时期双向电泳图谱的平均匹配率为87%。商品成熟期蛋白质数量与其他2个时期相比较高，说明这一时期生命活动较其他2个时期更为复杂和活跃。

对197个差异蛋白质进行质谱分析鉴定，开花座果期、果实膨大期和商品成熟期分别有11、7和43个蛋白质获得成功鉴定（图1），鉴定成功率为30.96%。经过数据库检索与比对，其中7个差异蛋白点物种来源于黄瓜，为鉴定成功蛋白质总数的11.48%。其他136个差异蛋白质点的质谱数据未获得可靠的匹配。鉴定蛋白质多数在弯曲果实和顺直果实中产生差异，少数为弯曲果实腹部和脊部间差异表达蛋白质。

2.2 差异蛋白点的鉴定及功能分类

基于参与的生物过程，对鉴定成功的61个差异蛋白点进行生物学功能分类，结果如图2，共分为22个功能类别，包括氧化还原（13）、蛋白质水解（7）、转运（6）、新陈代谢过程（5）、细胞蛋白质代谢（3）、细胞周期（3）、光合作用（2）、逆境胁迫（2）、核黄素合成（1）、细胞骨架组成与发生（1）、氮代谢（1）、脂类代谢（1）、核苷酸代谢（1）、mRNA代谢（1）、生物节律（1）、蛋白酶体调节（1）、生物过程（1）、DNA损伤应激反应（1）、DNA复制调节（1）、复制后修复（1）、翻译延伸（1）以及未获得分类蛋白（7）。结果表明，与氧化还原过程相关的差异蛋白点最多，并且转运、细胞周期、光合作用和蛋白质水解等功能蛋白质也在黄瓜果实弯曲中发挥重要的作用。

在参与氧化还原过程的蛋白质中，与顺直果实相比，超氧化物歧化酶铜-锌复合体（HZ5012）、硫氧还蛋白过氧化物酶（HZ7104）、叶绿素A、B结合蛋白（HZ4224）、33 kU叶绿体锰稳定蛋白（HK4406）和叶绿体锰稳定蛋白（HK4421）在弯曲果实腹部与脊部均上调表达，而在弯曲果实腹部和脊部之间没有显著差异；线粒体加工肽酶β亚基（HZ8805）、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶加氧酶大亚基（HZ7629）和粪卟啉原III氧化酶（HZ7417）在弯曲果实腹部与脊部均下调表达，而腹部和脊部之间没有显著差异；2-半胱氨酸氧还蛋白类似蛋白（HP2208）在弯曲果实腹部上调表达，核酮糖1，5-二磷酸羧化酶加氧酶大亚基（HZ2002）在弯曲果实腹部下调表达，但在顺直果实和弯曲果实脊部之间均未达到2倍表达量差异；过氧化物氧还蛋白（HK2205）、细胞溶质alkenal/one 氧化还原酶（HZ5615）在弯曲果实腹部下调表达，在脊部与顺直果实之间表达没有显著差异；推测蛋白（HK4001）在弯曲果实脊部上调2倍表达，但在顺直果实与弯曲果实腹部之间未达到2倍表达量差异。蛋白质的不同种类及其表达量差异说明果实弯曲的形成是一个复杂的过程，氧化还原反应是其中的重要环节，相关差异蛋白质通过多种反应途径共同作用于弯曲的形成和调控。

与转运过程相关的蛋白质中，ATP酶CF1β亚基（HZ4803）虽然在不同部位表达差异倍数未达到最高，但是整体表达量水平高于其他转运相关差异蛋白质。参与细胞周期过程中的14-3-3蛋白（HK2415）在弯曲果实腹部上调表达，表达量差异达到3倍，在脊部和顺直果实之间表达无显著差异，说明ATP酶CF1β亚基和14-3-3蛋白对果实弯曲的影响作用较大。

此外，核黄素合成酶（维生素B2合成酶，HP8012）在顺直果实中下调表达、表达量差异达到3倍以上，而在弯曲果实腹部和脊部之间没有显著差异。天冬氨酸蛋白酶（HP4412）在顺直果实中上调2倍表达、在弯曲果实腹部和脊部之间没有显著差异。说明这2种差异蛋白质在果实膨大期对果实弯曲也起到重要作用，它们分别参与核黄素合成和脂代谢过程。

2.3 差异表达蛋白质点层次聚类分析

对开花座果期、果实膨大期和商品成熟期的差异蛋白质进行层次聚类分析，利用TreeView获得聚类分析直观图（图3），差异表达量被分为下调（绿色），上调（红色）和没有表达变化（黑色）3种类群，颜色越亮就代表信号越强。差异蛋白质主要分为2个大类，分别包括20和41个差异蛋白质。第一类（HZ9412~HK4319）多在果实发育初期表达量低，而在果实发育中后期表达量高；第二类（HZ7802~HZ1314）多在果实发育初期或中期表达量高，在果实发育中后期表达量低。根据差异蛋白质的表达情况，不同时期和部位也被聚类为2组，一组为果实膨大期弯曲果实腹部和脊部、商品成熟期弯曲果实腹部和脊部；另一组包括开花座果期顺直果实、弯曲果实腹部和脊部，果实膨大期顺直果实，商品成熟期顺直果实，说明不同时期蛋白质表达量的差异远大于相同时期不同部位的蛋白质表达量差异。

根据表达量变化规律分别将差异蛋白质的第一类共20个差异蛋白，分为4个亚类（HZ9412~HZ2210；HZ8413~HK2415；HZ8014~HP2208；HZ4803~HK4319）；第二类共41个蛋白，分为8个亚类（HZ7802~HK5702；HZ7601~HK8521；HZ7908~HK4001；HZ8610~HZ2117；HZ5219；HZ7302~HZ1127；HZ1602~HP8012；HZ2509~HZ1314）。最大亚类（HZ7302~HZ1127）包含的蛋白质表达量在商品成熟期顺直果实中下调表达，其中大部分是只在商品成熟期具有表达差异的蛋白质，另外包含2个只在开花座果期差异表达和1个只在果实膨大期差异表达的蛋白质，商品成熟期差异蛋白数量相较于其他2个时期蛋白更多。具有表达相似性的蛋白往往具有相似的功能，因此，寻找相同时期顺直果实和弯曲果实间的差异蛋白，进而分析这些蛋白在不同时期、顺直果实、弯曲果实腹部和弯曲果实脊部的表达变化规律，有助于深入了解蛋白质功能及其与果实弯曲特性的调控机制。

黄瓜幼苗不同发育时期的蛋白质各亚类中代表性蛋白相对表达量变化见图4，其具体变化规律如下：

HZ7629为商品成熟期差异表达蛋白质，在顺直果实中上调表达。在顺直果实、弯曲果实腹部和脊部，其商品成熟期的表达量均高于开花座果期和果实膨大期。在顺直果实中随着果实发育呈直线上升趋势，在弯曲果实腹部和脊部的表达情况几乎相同，呈先略下降后上升趋势。从果实膨大期开始，在顺直果实中的表达量高于在弯曲果实中的表达量并一直持续至商品成熟期。

HZ8413是商品成熟期差异表达蛋白质，在弯曲果实腹部下调表达。在顺直果实中，从开花座果期到商品成熟期表达量逐渐升高；在弯曲果实腹部和脊部，从开花座果期到商品成熟期表达量均呈先上升后下降趋势，且每个时期的表达量差异非常接近。

HZ8014是商品成熟期差异表达蛋白质，在顺直果实中下调表达。在顺直果实中，从开花座果期到商品成熟期表达量逐渐降低，在弯曲果实腹部和脊部，从开花座果期到商品成熟期表达量呈先下降后上升趋势。在果实膨大期，HZ8014在顺直果实、弯曲果实腹部和脊部的表达量比较接近。在开花座果期，其在弯曲果实脊部的表达量高于腹部和顺直果实。

HZ4803是商品成熟期差异表达蛋白质，在顺直果实中上调表达。在顺直果实、弯曲果实腹部和脊部中，HZ4803从开花座果期至商品成熟期的表达量均呈现先下降后上升趋势。

HZ7802是商品成熟期差异表达蛋白质，在顺直果实中上调表达。从开花座果期到商品成熟期，在顺直果实、弯曲果实腹部和脊部中其表达量均呈先下降后上升趋势。

HZ4701是商品成熟期差异表达蛋白质，在顺直果实中上调表达。从开花座果期到商品成熟期，在顺直果实中其表达量呈先下降后上升趋势，在弯曲果实腹部呈逐渐下降趋势，在弯曲果实脊部呈先上升后下降趋势。

HP4412是果实膨大期差异表达蛋白质，在顺直果实中上调表达。从开花座果期到商品成熟期，在顺直果实中其表达量呈先上升后下降趋势，在弯曲果实腹部和脊部均呈现下降趋势，且从开花座果期到果实膨大期下降趋势非常明显。在果实膨大期和商品成熟期，HP4412在顺直果实中的表达量均高于弯曲果实腹部和脊部。

HZ2117是商品成熟期差异表达蛋白质，在顺直果实中下调表达。从开花座果期到商品成熟期，在顺直果实中呈下降趋势，在弯曲果实腹部和脊部其表达量均呈先下降后上升趋势。

HZ5219是商品成熟期差异表达蛋白质，在顺直果实中下调表达，且在弯曲果实脊部上调表达，在弯曲果实腹部的表达量位于两者之间。从开花座果期到商品成熟期，在顺直果实和弯曲果实腹部其表达量均呈先上升后下降趋势，在弯曲果实脊部呈先略下降后上升趋势。在果实膨大期，其顺直果实和弯曲果实腹部的表达量高于弯曲果实脊部。

HP2315是果实膨大期差异表达蛋白质，在顺直果实中下调表达。从开花座果期到商品成熟期，在顺直果实中其表达量呈先上升后下降趋势，在弯曲果实腹部呈逐渐上升趋势，在弯曲果实脊部均呈现先下降后上升趋势。

HZ1602是商品成熟期差异表达蛋白质，在弯曲果实中腹部下调表达。从开花座果期到商品成熟期，在顺直果实、弯曲果实腹部和脊部其表达量均呈现先上升后下降趋势。在开花座果期，HZ1602在弯曲果实腹部的表达量高于脊部和顺直果实。

HP6709是果实膨大期差异表达蛋白质，在顺直果实中下调表达。从开花座果期到商品成熟期，在顺直果实中其表达量呈先下降后上升趋势，在弯曲果实腹部和脊部呈先上升后下降趋势，在弯曲果实脊部和顺直果实中的表达量及差异变化趋势非常接近。

2.4 差异表达蛋白质染色体定位分析

将61个差异蛋白质对应序列信息分别与黄瓜基因组信息进行比对，获得差异蛋白质在黄瓜染色体上的位置信息，并利用Mapchart软件将数据可视化（图5）。共60个差异蛋白质序列分别成功定位在黄瓜7条染色体上，第6和第4条染色体上最多，分别为13个和11个，第2条染色体上最少，只有5个。同时包含3个时期差异表达蛋白质信息的染色体为第1、第3和第6染色体，说明第6染色体在黄瓜果实弯曲形成和调控过程中相对起重要作用。除第7染色体以外，其他6条染色体上均存在参与氧化还原过程相关差异蛋白序列信息分布比较均匀，最多为3个，最少为1个。参与转运过程的蛋白质序列主要定位在第5染色体上，少数在第7染色体上。参与蛋白质水解的差异蛋白质序列信息主要定位于第4染色体。参与光合作用蛋白序列信息主要定位于第6染色体。在成功获得定位的蛋白质中，HK4319与HZ3109（Chr1），HK2205和HP2208（Chr3），HK2415和HZ2509（Chr4），HZ4904和HZ5219（Chr4），HZ1127和HZ5605（Chr5），HK0614和HZ1602（Chr6），HK4406和HK4421（Chr6），HP4303和HZ2210（Chr6），HZ3816和HZ3821（Chr7）分别定位在相同染色体的相同位置，推测可能具有相似的功能，在黄瓜果实弯曲形成和调节过程中发挥作用。

2.5 差异表达蛋白质转录水平分析

对分别参与氧化还原过程、转运过程、核黄素代谢、脂代谢和氮代谢过程的8个差异蛋白质在mRNA水平进行验证（图6），分别为核酮糖1，5-二磷酸羧化酶加氧酶大亚基（HZ7629）、核黄素合成酶（维生素B2合成酶，HP8012）、天冬氨酸蛋白酶（HP4412）、超氧化物歧化酶铜-锌复合体（HZ5012）、细胞溶质alkenal/one氧化还原酶（HZ5615）、谷氨酰胺合成酶（HZ7601）、ATP合酶CF1β亚基（HZ4803）、富甘氨酸RNA结合蛋白（HZ1302）。结果表明，转录水平与蛋白质水平表达趋势一致的蛋白为验证蛋白总数的62.5%。其中，蛋白点HP8012、HZ5012、HZ5615、HZ7601和HZ1302的表达变化与在mRNA水平的表达具有相似性。蛋白点HZ7629和HZ4803表达变化呈相反趋势。蛋白点HP4412在蛋白质水平表现为顺直果实中上调，但在mRNA水平弯曲果实腹部、脊部和顺直果实的表达量没有显著差异。

3 讨论

3.1 黄瓜果实弯曲特性相关差异蛋白质的分离和鉴定

黄瓜果实弯曲严重影响黄瓜的商品价值，降低黄瓜弯曲果实比率具有实际经济价值^［9］。通过差异蛋白质组学研究能对果实弯曲发生过程中蛋白质调控网络有广泛而完整的认识，找到果实弯曲发生过程中的标志性蛋白质，为果实弯曲性状的改良和调控提供依据。本研究主要采用双向电泳结合MALDI-TOF-MS质谱鉴定的方法鉴定黄瓜果实弯曲相关差异蛋白点，在弯曲果实中共鉴定197个蛋白质点，结合生物信息学和实时定量PCR筛选出61个差异表达蛋白（开花座果期11个，果实膨大期7个，商品成熟期43个），功能分析表明这些差异蛋白参与氧化还原过程、转运、细胞周期等功能。

3.2 氧化还原反应相关蛋白

植物体内活性氧（ROS）水平的提高会对细胞造成伤害，需要抗氧化防护系统平衡过多的ROS^［28］。过氧化物氧还蛋白是新近发现的一类过氧化物酶，属于抗氧化蛋白超家族，过量的ROS积累使植物细胞内的大分子物质发生过氧化，影响植物的正常生长^{［29，30］}。过氧化物氧还蛋白在弯曲果实腹部的下调表达可能使内部抗氧化防护系统失去平衡，活性氧无法被及时清除，腹部细胞的正常生长发育受到影响，导致果实发生弯曲。

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是一个双功能的酶，不仅调节光合作用碳吸收，还调控植物光呼吸^［31］。Rubisco一般由多个大亚基和小亚基组成，大亚基由叶绿体基因编码，起主要活性作用，具有催化1，5-二磷酸核酮糖的羧化和氧化作用^［32］。本试验中，Rubisco大亚基（HZ7629、HZ2002）在弯曲果实下调表达，证实黄瓜果实弯曲特性与光合作用和光呼吸密切相关，原因可能是光合速率低使弯曲果实生长发育所必需的能量不足，从而影响了果实的正常生长发育。

超氧化物歧化酶（SOD）是生物体重要的抗氧化酶之一，在反应过程中起关键作用的是SOD中的金属结合部位^［33］。前人研究表明超氧化物歧化酶铜-锌复合体（Cu/Zn-SOD）具有缓解抗氧化损伤和维持细胞活性氧物种内稳态的功能^［34-35］。Cu/Zn-SOD（HZ5012）在弯曲果实中上调表达，说明弯曲果实中的氧化作用高于顺直果实，需要产生大量的Cu/Zn-SOD以维持细胞活性氧稳态。综上所述，黄瓜果实氧化状态的均衡对于抑制果实弯曲至关重要。

3.3 细胞周期相关蛋白

14-3-3蛋白在细胞信号转导、细胞周期的调控、细胞的凋亡等生理过程中起着重要的作用，也在低温胁迫、盐和碱胁迫、机械损伤等应答上起作用^［36-38］。不同的14-3-3蛋白同工型具有不同的细胞特异性，进行发育表达、逆境应答多方面的功能调控^［39］。14-3-3蛋白的C-末端通常直接参与蛋白之间的相互作用，以多种形式与靶蛋白进行互作^［40］。Pignocchi等^［41］发现14-3-3蛋白与拟南芥EDE1蛋白相互作用，介导与细胞周期相关的维管排列，从而影响细胞分裂。张泽风^［42］发现水稻OsGF14-B蛋白和OsGF14-E蛋白协同调控水稻细胞分裂、蛋白合成等籽粒发育过程。本研究中14-3-3蛋白（HK2415）在黄瓜果实不同部位的表达差异说明了细胞周期和信号转导等方面的调控对果实发育初期果型出现弯曲有一定的影响作用，这有助于从细胞调控水平探明黄瓜果实弯曲的机理。

3.4 脂类代谢相关蛋白

天冬氨酸蛋白酶（AP）是一类重要的蛋白水解酶，参与植物的防御反应、蛋白质的加工和降解，以及生物调控作用^［43-44］。植物天冬氨酸蛋白酶在调控诸如对病原菌和害虫的识别、诱导防卫反应开启等生物学过程中发挥着重要的作用^［45］。Prasad等^［46］分离并鉴定了一个预测的编码AP的水稻基因OsCDR1，在拟南芥和水稻异位表达OsCDR1基因，增加了植株对细菌和真菌病害的抗性。Guo等^［47］发现GmAP1蛋白能增强本氏烟草对细菌P.syringae的抗性。天冬氨酸蛋白酶（HP4412）在弯曲果实中下调表达，说明弯曲果实新陈代谢以及诱导防卫反应开启功能可能受到了抑制，导致果实发生弯曲。

3.5 黄瓜果实不同时期弯曲特性相关差异蛋白质表达变化规律

对开花座果期、果实膨大期和商品成熟期的黄瓜果实弯曲相关差异蛋白质进行研究，可以获得不同发育时期与果实弯曲相关的差异蛋白质。从本研究结果可以看出，商品成熟期差异蛋白质数量明显高于其他两个时期，说明这一时期生命活动较其他两个时期更为复杂和活跃，与果实弯曲相关的调控体系更加庞大。开花座果期与果实膨大期间的差异蛋白种类不多、数量差异不大，这两个时期与果实弯曲相关的生命活动相对简单，有助于分析和确定果实发育过程中与弯曲调控相关的关键蛋白及其表达变化规律。对差异蛋白在3个发育时期的表达变化规律进行分析，能够进一步了解其在果实弯曲形成和发育过程中发挥的作用和调节机制。

3.6 差异蛋白质表达量验证

蛋白质水平的表达也受到转录和翻译后修饰作用的调节控制，本试验中62.5%的基因表达规律与蛋白质表达规律相符合。其中，蛋白点HZ7629、HZ4803在蛋白质与mRNA的表达水平相反，蛋白点HP4412在蛋白质水平表现为顺直果实中上调，但在mRNA水平弯曲果实腹部、脊部和顺直果实的表达量没有显著差异。mRNA与蛋白量的变化不一定呈线性一致性的关系，它与转录过程中时间和空间的变化有很大的关系^［48］。翻译速率、蛋白质合成延迟、蛋白质转运和反应速率等都会影响蛋白质表达水平^［48］。从mRNA水平对弯曲相关差异蛋白质进行研究能够获得果实弯曲相关基因的表达规律，从而进一步分析和了解黄瓜果实弯曲形成和调节机制。

4 结论

通过蛋白质组学分析与基因表达量验证初步筛选出的与黄瓜果实弯曲性相关的关键蛋白有核酮糖1，5-二磷酸羧化酶加氧酶大亚基、天冬氨酸蛋白酶、超氧化物歧化酶、14-3-3蛋白等。通过对鉴定的差异蛋白质进行功能分析，发现其主要参与氧化还原过程、转运、细胞周期、光合作用和脂类代谢等，这些途径共同调控黄瓜弯曲果实的形成。

参考文献

[1] Liu X， Pan Y， Liu C，et al.Cucumber fruit size and shape variations explored from the aspects of morphology，histology，and endogenous hormones［J］.Plants，2020，9（6）：772.

[2] Feng S， Zhang J， Mu Z，et al.Recent progress on the molecular breeding of Cucumis sativus L.in China［J］.Theoretical and Applied Genetics，2020，133，1777-1790.

[3] Kanahama K， Saito T.Effect of planting density and shading on the fruit curvature in cucumber［J］.Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1984，53（3）：331-337.

[4] Zhang T， Li X， Yang Y，et al.Genetic analysis and QTL mapping of fruit length and diameter in a cucumber （Cucumber sativus L.） recombinant inbred line （RIL） population［J］.Scientia Horticulturae，2019，250：214-222.

[5] Zhang P， Qin Z W， Wang L L，et al.Mapping quantitative traits loci linked to bending fruit trait in cucumber［J］.Journal of Northeast Agricultural University （English Edition），2011，18：1-5.

[6] Böhner J， Bangerth F.Cell number，cell size and hormone levels in semi-isogenic mutants of Lycopersicon pimpinellifolium differing in fruit size ［J］.Physiologia Plantarum，1988，72（2）：316-320.

[7] 葛长军.黄瓜主要种质资源果实曲直性评价［D］.哈尔滨：东北农业大学，2008：36-47.

[8] Wang C， Xin M， Zhou X，et al.The novel ethylene-responsive factor CsERF025 affects the development of fruit bending in cucumber［J］.Plant Molecular Biology，2017，95（4）：519-531.

[9] Li S， Wang C， Zhou X，et al.The curvature of cucumber fruits is associated with spatial variation in auxin accumulation and expression of a YUCCA biosynthesis gene［J］.Horticulture Research，2020，7：135.

[10] 徐圆，秦智伟，周秀艳.黄瓜果实弯曲相关基因Cs14-3-3的克隆及表达分析［J］.园艺学报，2013，40（5）：896-904.

[11] 徐圆.黄瓜果实弯曲相关基因Cs14-3-3的克隆及对拟南芥的遗传转化［D］.哈尔滨：东北农业大学，2013.

[12] Huang P， Dong Z， Guo P，et al.Salicylic acid suppresses apical hook formation via NPR1-mediated repression of EIN3 and EIL1 in Arabidopsis ［J］.The Plant Cell，2020，32（3）：612-629.

[13] Zhao N， Zhao M， Wang L，et al.EBF1 negatively regulates brassinosteroid-induced apical hook development and cell elongation through promoting BZR1 degradation［J］.International Journal of Molecular Sciences，2022，23（24）：15889.

[14] Han D， Ma X， Zhang L，et al.Serial-omics and molecular function study provide novel insight into cucumber variety improvement［J］.Plants，2022，11（12）：1609.

[15] 秦爱，郑晓敏，王坤.基于质谱的植物蛋白质组学研究方法［J］.植物科学学报，2018，36（3）：470-478.

[16] Li B， He L， Guo S，et al.Proteomics reveal cucumber Spd-responses under normal condition and salt stress［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2013，67：7-14.

[17] Du C， Li H， Liu C，et al.Understanding of the postgerminative development response to salinity and drought stresses in cucumber seeds by integrated proteomics and transcriptomics analysis［J］.Journal of Proteomics，2021，232：104062.

[18] Du C X， Fan H F， Guo S R，et al.Proteomic analysis of cucumber seedling roots subjected to salt stress［J］.Phytochemistry，2010，71（13）：1450-1459.

[19] Nováková S， Šubr Z， Kováč A，et al.Cucumber mosaic virus resistance：Comparative proteomics of contrasting Cucumis sativus cultivars after long-term infection［J］.Journal of Proteomics，2020，214：103626.

[20] Wang L， Ma H， Song L，et al.Comparative proteomics analysis reveals the mechanism of pre-harvest seed deterioration of soybean under high temperature and humidity stress［J］.Journal of Proteomics，2012，75（7）：2109-2127.

[21] Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72（1-2）：248-254.

[22] 赵玲玲，毕青，周雪，等.大白菜根系蛋白质双向电泳体系优化［J］.分子植物育种，2015，13（1）：178-183.

[23] 张丽，姜丽，石韵，等.桃果实总蛋白质双向电泳优化体系的建立［J］.食品与生物技术学报，2013，32（3）：250-257.

[24] 刘晓林，杨学勇，余宏军，等.适用于黄瓜叶片、根系和果实总蛋白的双向电泳体系的建立［J］.基因组学与应用生物学，2016，35（3）：721-727.

[25] Blum H， Beier H， Gross H J.Improved silver staining of plant proteins，RNA and DNA in polyacrylamide gels［J］.Electrophoresis，1987，8（2）：93-99.

[26] 田晏，侯召华.冬枣果实发育过程中非标记定量蛋白质组学分析［J］.食品科学，2022，43（6）：221-228.

[27] Katayama H， Nagasu T， Oda Y.Improvement of in-gel digestion protocol for peptide mass fingerprinting by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2001，15（16）：1416-1421.

[28] 李立人.核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶的结构，调节及遗传工程前景［J］.生物科学信息，1989，1：12-15.

[29] Krøll J.Molecular chaperones and the process of cellular immortalization in vitro［J］.Biogerontology，2002，3：183-185.

[30] 祁伟亮，孙万仓，马骊.活性氧参与调控植物生长发育和胁迫应激响应机理的研究进展［J］.干旱地区农业研究，2021，39（3）：69-81.

[31] 张帅.蓖麻核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶RcRBCL表达纯化、晶体生长及功能分析［D］.通辽：内蒙古民族大学，2022.

[32] 李金鑫，周海城，王玉文，等.糠椴核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因生物信息学分析［J］.北华大学学报（自然科学版），2020，21（4）：542-545.

[33] 彭佳铭，屈仁军，王世威，等.丹参超氧化物歧化酶SmMSD2基因的克隆与表达分析［J］.药学学报，2023，58（2）：454-464.

[34] 王梦馨，吴国火，崔林，等.茶树花Cu/Zn-SOD酶活性及其基因表达分析［J］.热带作物学报，2020，41（6）：1167-1173.

[35] Leng X， Wang P， Zhu X，et al.Ectopic expression of CSD1 and CSD2 targeting genes of miR398 in grapevine is associated with oxidative stress tolerance［J］.Functional &Iintegrative Genomics，2017，17：697-710.

[36] 胡开辉，黄桂英，颜松，等.斑玉蕈低温胁迫下菌丝体酶活变化及差异蛋白质组学研究［J］.菌物学报，2009，28（4）：584-590.

[37] Roberts M R， Salinas J， Collinge D B.14-3-3 proteins and the response to abiotic and biotic stress［J］.Plant Molecular Biology，2002，50：1031-1039.

[38] Camoni L， Visconti S， Aducci P，et al.14-3-3 proteins in plant hormone signaling：doing several things at once［J］.Frontiers in Plant Science，2018，9：297.

[39] 崔娜，李天来，李悦.植物中14-3-3蛋白的主要功能［J］.生物技术，2007，17（2）：86-89.

[40] 崔娜，于志海，韩明利，等.植物14-3-3蛋白研究进展［J］.西北植物学报，2012，32（4）：843-851.

[41] Pignocchi C， Doonan J H.Interaction of a 14-3-3 protein with the plant microtubule-associated protein EDE1［J］.Annals of Botany，2011，107（7）：1103-1109.

[42] 张泽风.14-3-3蛋白在水稻籽粒发育中的功能及其调控机制研究［D］.福州：福建农林大学，2015：6-12.

[43] 程相杰，徐莉萍，母小焕，等.玉米天冬氨酸蛋白酶基因家族的鉴定与表达分析［J］.玉米科学，2022，30（1）：53-62.

[44] Runeberg‐Roos P， Saarma M.Phytepsin，a barley vacuolar aspartic proteinase，is highly expressed during autolysis of developing tracheary elements and sieve cells［J］.The Plant Journal，1998，15（1）：139-145.

[45] Simoes I， Faro C.Structure and function of plant aspartic proteinases［J］.European Journal of Biochemistry，2004，271（11）：2067-2075.

[46] Prasad B D， Creissen G， Lamb C，et al.Overexpression of rice （Oryza sativa L.） OsCDR1 leads to constitutive activation of defense responses in rice and Arabidopsis ［J］.Molecular Plant Microbe Interactions，2009，22（12）：1635-1644.

[47] Guo B， Wang H， Yang B，et al. Phytophthora sojae effector PsAvh240 inhibits host aspartic protease secretion to promote infection［J］.Molecular Plant，2019，12（4）：552-564.

[48] Liu Y， Beyer A， Aebersold R.On the dependency of cellular protein levels on mRNA abundance［J］.Cell，2016，165（3）：535-550.

基金资助

甘肃省自然科学基金项目(20JR10RA797)