低温逆境对青藏高原小嵩草叶片PSII光化学效率的影响

Effects of low-temperature stress on the PSII photochemical efficiency of Kobresia pygmaea in alpine meadow on the Qinghai-Tibetan Plateau

摘要

目的 探究低温逆境对高山植物叶片PSⅡ反应中心光化学效率的影响，明确光合机构的适宜运行温度。 方法 应用叶绿素荧光图像分析手段，以青藏高原典型寒冷中生植物小嵩草（Kobresia pygmaea）为材料，研究低温对叶片PSII光化学效率和非光化学猝灭的影响。 结果 PSⅡ最大光化学量子效率（F_v/F_m）在5℃至15℃时较高（P<0.05）。低温可影响PSⅡ光化学效率和非光化学猝灭的光响应过程，引起稳态作用光强下PSⅡ运行效率（F_q′/F_m′）和PSⅡ效率因子（F_q′/F_v′）的降低，以及非光化学猝灭（NPQ）的增高，并导致PSⅡ反应中心光化学效率的变异系数（CV）升高。低温对PSⅡ最大效率（F_v′/F_m′）和NPQ总变异的贡献较强光明显，但F_q'/F_m'、F_v′/F_m′、F_q′/F_v′和NPQ均没有呈现低温和强光的交互效应，即使模拟-5 ℃的低温也未能完全抑制光合机构的活性。 结论 低温可导致小嵩草叶片PSⅡ光化学效率的不稳定性增高，植株在承受逆境胁迫的同时，又表现出对高寒生境的极强适应性和耐性，是形成高寒小嵩草草甸地带性分布的重要因素。

Abstract

Objective The objective of this study was to investigate the impact of low-temperature stress on the photochemical efficiency of Photosystem II （PSII） in alpine plants and determine the optimal operating temperature of their photosynthetic apparatus. Method Using the chlorophyll fluorescence imager technique，we examined the effects of low-temperature stress on PSII photochemical efficiency and non-photochemical quenching in Kobresia pygmaea，a typical low-temperature-tolerant arid mesophyte alpine species. Result The results demonstrated that the maximum photochemical quantum efficiency （F_v/F_m） of PSII was significantly higher at temperatures ranging from 5 ℃ to 15 ℃，indicating a relatively lower adaptation temperature for the species.Low temperature exerted influence on the rapid photosynthetic response process of PSII photochemical efficiency and non-photochemical quenching.Low-temperature stress led to decreased PSII operation efficiency （F_q'/F_m'） and PSII efficiency factor （F_q'/F_v'），while increasing non-photochemical quenching （NPQ） and resulting in a high coefficient of variation （CV） of photochemical efficiency，including F_v/F_m.The contribution of low temperature to the total variation in F_v′/F_m′ and NPQ was slightly higher than that of high light intensity.However，there was no interaction observed between low temperature and strong light intensity regarding F_q'/F_m'，F_v′/F_m′，F_q'/F_v'，and NPQ.Notably，even at a low temperature of -5 ℃，the activity of the photosynthetic apparatus was not completely inhibited. Conclusion Low temperature may result in increased instability in PSII photochemical efficiency.The alpine species K.pygmaea displays strong adaptation and tolerance to low-temperature stress，which is crucial for its zonal distribution in alpine meadows.

Graphical abstract

关键词

低温逆境 / 青藏高原 / 小嵩草 / 叶绿素荧光 / PSII非光化学猝灭

Key words

low temperature / Qinghai-Tibetan Plateau / Kobresia pygmaea / chlorophyⅡ fluorescence / non-photochemical quenching

青藏高原为我国重要的牧区之一，以小嵩草（Kobresia pygmaea）为建群种和优势种的高寒小嵩草草甸是其独特的植被类型，为该区域分布最广、面积最大的草地类型^［1-2］。小嵩草草甸作为高山和高寒气候的产物，具有典型的高原地带性和山地垂直地带性植被分布特征^［3］，在我国集中分布在青藏高原东部及其周围高山上部^［4］，占青海省草地面积的12.3%。小嵩草属莎草科（Cyperaceae）嵩草属（Kobresia）多年生草本植物，植株矮小，高仅1~3 cm，叶片线性，叶长不及4 cm，宽0.5~1 mm；根系发达，主要分布在地表10 cm的土层，常与土壤形成致密的草根盘结层^［5-6］。植株密集的生长方式和矮小的构型能避免低温引起的冻害，还能抵御疾风下强烈蒸腾所导致的植物体水分丧失^［7］，呈现出对高原极端生境的极强适应性，是高原牧区重要的可更新草地资源。

低温是影响植物地理分布和物种多样性的重要环境因子^［8］。低温胁迫可制约植物体的生理代谢过程和生长发育进程等^［9-10］，其中光合机构的生理过程对低温逆境尤为敏感^［11］，能影响到包括光合电子传递速率、气孔的开度和碳同化等过程的各个方面^［12］。青藏高原地区的生存环境严酷，“高”和“寒”为其显著的自然特征；表现为海拔高，空气稀薄，年温差小而日温差大，风力强劲，气候变化剧烈^［13］。低温逆境是青藏高原地区植物生长季内极为常见的非生物胁迫因素，尤其在高寒草甸地带。植物对低温胁迫的适应性和抵抗能力既受系统发育的遗传基因控制，又受个体发育过程中生理状态的制约^［14］。植物可通过调节生理和生化过程来提高其适应生存环境的能力，以抵御和忍耐自然逆境的胁迫 ^［15］；生长在青藏高原的高山植物，如小嵩草，经长期的自然选择和适应，也必然具备较强的调节适应能力，以确保极端生境中生理功能的正常运行。因此，从分析典型高山植物叶片光合机构的有效运行入手，研究植物在青藏高原极端气候环境下的生存策略，并以其生理生态适应性为基础，探讨维系高寒嵩草草甸地带性分布格局的内在因素，对保护青藏高原脆弱生态系统和维护区域经济的可持续发展具有重要意义。

光合作用作为植物体的重要生理过程，其功能的有效运行依赖于对周围环境的适宜程度和光合机构对逆境的适应能力^［16］。青藏高原地区近地表面的太阳光辐射很强，且日照时间长^［17］。一般认为，除驱动植物光合作用外，光合机构吸收的太阳光能更多处于过剩状态^［18］，需通过非辐射热能耗散等途径予以消除^［19-20］。非辐射能量耗散能够有效消除叶片吸收的过剩光能，避免活性氧分子（reactive oxygen species，ROS） 在PSII反应中心的过量积累，阻止反应中心复合体的过度氧化，降低过剩光能对类囊体膜的潜在伤害^［21］，被认为是维系光合机构有效运行的重要保护机制^［22］。更多研究认为，在伴随低温和干旱等逆境胁迫时，植物体吸收的太阳光能更容易处于过剩状态^［16］，因此，胁迫生境中植物光合机构对过剩激发光能的快速有效耗散尤为重要。小嵩草长期生存在高原极端环境中，其光合生理过程对低温等逆境具有较强的耐性和抗性。然而，长期低温逆境对高山植物光合适温的影响如何？是否意味着抵御极端逆境的加强？是否会阻碍植物光合机构的非辐射能量耗散过程，抑或基于驯化适应而表现对日间强光逆境的抗性？这些问题尚缺乏深入探究。本文借助叶绿素荧光图像分析系统，研究了不同低温下小嵩草叶片光系统II 反应中心（photosystem II；PSII）的光化学和非光化学能量耗散特性，探讨了PSII反应中心非辐射能量耗散的猝灭保护机理，以期揭示典型高山植物小嵩草适应低温逆境的生理基础，为高寒小嵩草草甸的地带性分布提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样地

野外试验样地选在青海大学-清华大学三江源高寒草地生态系统野外观测站，该站位于青海省玉树州称多县珍秦镇。草地类型为高寒小嵩草-杂类草草甸，草皮层采自该站气象站附近草地。站区地理坐标为N 33˚24'，E 97˚18'，海拔4 270 m；年平均气温为-5.6~3.8 ℃，年均降水量为562.2 mm，降水主要集中植物生长季的6~9月份，约占全年降水总量的75%。气候类型为典型高原大陆性气候。

小嵩草为该小嵩草-杂类草草甸的主要优势种和建群种，次优势种有矮嵩草（Kobresia humilis）、异针茅（Stipa aliena）、波伐早熟禾（Poa poophagorum）、珠芽蓼（Polygonum viviparum）、雪白萎陵菜（Potentilla.nivea）等，草甸伴生植物有羊茅（Festuca ovina）、垂穗披碱草（Elymus nutans）、美丽风毛菊（Saussurea superba）和蒙古蒲公英（Taraxaum mongolicun）等。

站区土壤类型为高山草甸土，土层薄，仅40~ 50 cm厚。受高寒低温气候的影响，腐殖层分解缓慢，腐殖质含量丰富，土壤有效肥力不高；土壤中腐殖质含量丰富，但有效肥力较低，有机质含量仅为2.36%，土壤pH为6.92。土壤中速效氮、速效磷和速效钾的含量分别为14.0，l7.0、76.5 mg/L，其中氨态氮和硝态氮分别为5.1、8.9 mg/L。

1.2 植物材料及低温处理

野外采样选在高寒小嵩草-杂类草草甸植物生长季的草盛期，2020年7月1日在草甸挖取4块草皮，切割为30 cm×30 cm，厚度约15 cm的方形草皮块。浇透水，装箱移送至西宁研究所，并立即放置到光照培养室内。翌日用宽胶带密封草皮块的4个边侧面后，将草皮块安置在室内LED人工光源下方，距离光源约1 m。仔细整理草皮块，沿土层表面剪除多余杂类草，并随时捡除草丛中出现的草原毛虫（Gynaephora qinghaiensis）。光照培养室内LED人工光源的光合量子通量密度（PPFD）为（500 ± 30） µmol/（m²·s）；昼夜温度为（24 ± 1）/（18 ± 2） ℃，光周期12 h/12 h；室内相对湿度恒定，约为50%。早晚喷洒少量水，使草皮块始终处于较潮湿状态，且注意维持小嵩草植株处于自然生长状态。2020年7月30日再次在小嵩草-杂类草甸进行采样和测定。

1.3 低温控制及叶绿素荧光参数的测定

1.3.1 温度控制平台的改造

采用CF-imager叶绿素荧光图像分析仪（Chlorophyll fluorescence Imager，Technologica Ltd，UK ）测定单株离体叶片的叶绿素荧光参数。将暗箱内测定平台用中空的金属铝材改造为可控温度的载物平台，10 cm×15 cm，厚度约1.5 cm；载物台固定安置在原平台之上并用石棉网等隔绝热能传递。用英国产恒温控制系统（Grant LTD 6/20； Grant Instruments （Cambridge） Ltd，England），采用循环冷却液控制载物平台的温度。控温期间测定平台的降温速率为0.8 ℃/min；升温速率较快，约8 ℃/min。

1.3.2 离体叶片叶绿素荧光参数的测定

叶绿素荧光参数的测定从草皮块移入光照培养室后的第2天开始。测定前，草皮块在室内LED人工光源下照光约1~2 h。齐草皮层表面剪取约25株小嵩草，选取单株中剔除衰老叶片后的2~4枚幼嫩及成熟叶片一并测定。将温度控制载物台置于LED红蓝光源及CCD相机正下方，其上铺垫湿润的棉毛垫；离体叶片依次紧密排列在棉毛垫上，并用直径0.105 mm透明鱼线固定。关闭室内光源，启动依据试验目的编写的预置程序。叶绿素荧光图像测定期间暗室内气温维持在（24±1） ℃，相对湿度恒定，约45%。

1.3.3 叶绿素荧光参数的测定程序

稳态作用光强下温度响应曲线的测定：在铺垫湿润棉毛垫的载物台表面依次排放剪取的小嵩草叶片，设20、10、5、0和-5 ℃共5个温度梯度，依次降温测定。控制载物台温度为20 ℃，暗适应15 min后，测定最小叶绿素荧光产率（F_o）和最大叶绿素荧光产量（F_m）。调节Grant 恒温控制系统，以1 000 µmol/（m²·s）稳态作用光强为光化光，运行温度响应曲线的测定程序。调温至目标温度，每一温度平衡15 min后检测最大荧光产率（F_m′）和稳态荧光产率（F_s）；测定F_m和F_m′的饱和脉冲光为6 840 µmol/（m²·s），持续时间60 ms。因降温速率为0.8 ℃/min，故从前温度达到设定目标温度值后的实际平衡时间依次为15、3、7、7、7 min。

不同温度下光响应曲线的测定：设6个温度梯度，依次为：-5、0、5、10、15、20 ℃。每一测定温度下更换新植物材料后再运行程序；15 min暗适应期间，每隔5 min测定一次F_o和F_m，然后依次测定不同光强下的叶绿素荧光参数。设12个光强梯度，依次为：25、50、100、150、200、300、500、800、1 000、1 200、1 500和1 800 µmol/（m²·s）。每一光强下测定一次F_m′和F_s。25至150 µmol/（m²·s）间平衡时间为2 min，高于200 µmol/（m²·s）以后平衡时间设为1 min。测定F_m和F_m′的饱和脉冲光为6 840 µmol/（m²·s），持续时间60 ms。

光温交互试验：20 ℃控温条件下，经暗适应15 min后，测定F_o和F_m；然后，依次调节Grant 恒温控制系统，控制测定温度为20、10和0 ℃，在每一温度梯度下依次开启200、800和1 500 µmol/（m²·s）的稳态作用光强并测定F_m′和F_s。从20至10 ℃和10至0 ℃降温期间，200 µmol/（m²·s）光强下的平衡时间为15 min，其余两个光强下的光照平衡时间均为5 min。达到平衡后每一光强下测定一次F_m′和F_s。测定F_m和F_m′的饱和脉冲光为6 840 µmol/（m²·s），持续时间60 ms。

1.3.4 植株叶片定位及图像的数据化解析

在荧光图像的图形采集框中，定位并分割视野中的小嵩草叶片，使之解析为叶绿素荧光参数的数据值。分割提取小嵩草叶片，视为多个植株的重复样本。具体数据解析过程参见CF imager操作手册。

1.3.5 PSII反应中心的光化学效率和非光化学猝灭分析

不同温度下PSII最大光化学量子效率（F_v/F_m）分别以准确暗适应5、10、15 min时的F_o和F_m计算，式中F_v =F_m-F_o。

PSII最大效率（F_v'/F_m'）和PSII运行效率（F_q'/F_m '）分别由（1）和（2）式^［23］计算：

F_v'/F_m'=（F_m′-F_o′）/F_m′（1）

F_q'/F_m '=（F_m′-F_s）/F_m′（2）

PSII效率因子（F_q'/F_v '）和非光化学猝灭 （NPQ）依照Bilger和Björkman的公式^［24］（3）和（4）式计算：

F_q'/F_v '=（F_m′-F_s）/（F_m′-F_o′）（3）

NPQ=F_m/F_m′-1（4）

上述计算中F_o′以Oxborough和Baker经验公式^［25］（5）式估算：

F_o′=F_o/（F_v/F_m +F_o/F_m′）（5）

式中：F_o和F_m为20 ℃恒温15 min暗适应时的叶绿素荧光产率；不同温度光响应曲线测定时，则分别以-5、0、5、10、15、20 ℃时暗适应15 min的F_o和F_m计算。

1.4 光合色素测定

齐草皮块剪取小嵩草植株地上部分，剔除单株枯黄叶片后分3份，每份精确称取0.250 g鲜叶，浸入内含20 mL 丙酮和乙醇的混合提取液（丙酮∶乙醇∶水为4.5∶4.5∶1）的棕色玻璃瓶中；盖紧瓶盖，置5 ℃左右低温避光处浸提约15 d，至叶片无色。用UV-1601紫外分光光度计（日本，岛津公司）测定浸提液在663、645和470 nm波长的吸收光度值，叶绿素和类胡萝卜素含量测定和计算参见师生波等^［26］报道。

1.5 数据分析

荧光图像解析后的原始数据经Microsoft Excel软件整理后，再用SPSS 16.0软件进行统计分析。不同测定温度之间的差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA），应用最小显著差异法（LSD） 进行多重比较，显著性水平设定为α=0.05。强光和低温胁迫间交互效应分析采用一般线性模型双因素方差分析法（two-way ANOVA of GLM）。用Microsoft Excel软件制图，图中数据以平均数（\overline{x}）表示，垂直条表示标准差（SD）；变异系数（CV）以均数的标准差百分数估算，CV=SD/\overline{x}。各荧光参数的样本数及其差异显著性见文中和图标示。

2 结果和分析

2.1 小嵩草叶片PSⅡ最大光化学量子效率的温度响应

不同温度下的测定表明，暗适应5、10和15 min时，小嵩草叶片的PSⅡ最大光化学量子效率（F_v/F_m）在5、10和15 ℃时较高（P<0.05）；20 ℃时F_v/F_m值已有较显著降低，而从-5 ℃升至5 ℃时，F_v/F_m值均呈逐渐增高的趋势（图1）。随暗适应时间的延长，-5 ℃时的F_v/F_m值呈现增加趋势；而高于15 ℃以后，则呈降低趋势。说明，小嵩草叶片内禀最大光化学效率的适宜温度在5~15 ℃之间，且-5 ℃的低温并没有完全或很快抑制F_v/F_m的活性。

经15 min暗适应后，F_v/F_m均值变异系数（CV） 从20 ℃到-5 ℃依次为：2.12%、1.54%、1.64%、1.59%、1.50%和2.55%。表明，-5 ℃和20 ℃温度时，其叶片F_v/F_m的稳定性明显较低。

2.2 快速光响应曲线及对模拟低温的应答

PSⅡ运行效率（F_q′/F_m′） 的快速光响应曲线随光强的增加呈降低趋势，各曲线随测定温度的降低依次降低（图2-A）。PSⅡ最大效率（F_v′/F_m′） 随光强的增加其降低趋势不明显，中高光强范围较为平缓，且不同温度间曲线很接近（图2-B）。PSⅡ反应中心的非光化学猝灭（NPQ）随光强增加呈增高趋势，不同温度间差异较大；较高光强范围内，NPQ值依测定温度的降低而趋于降低（图2-C）。PSⅡ效率因子（F_q′/F_v′）的光响应曲线随光强的增加而降低，随测定温度的降低也呈依次降低趋势（图2-D）。

2.3 稳态光强下PSⅡ反应中心光化学效率和非光化学猝灭的温度响应

1 000 µmol/（m²·s）稳态作用光强下，随测定温度的降低，F_q′/F_m′值的下降趋势不明显，仅10 ℃时的F_q′/F_m′值显著高于0 ℃的（图3-A）。F_v′/F_m′则随测定温度的降低呈现升高趋势，20 ℃至5 ℃范围内增加显著，但低于5 ℃后F_v′/F_m′值的差异不明显（图3-B）。随测定温度的降低，NPQ值逐渐升高，除10 ℃和5 ℃间差异不显著外，其余各温度间NPQ值均呈现显著性差异（图3-C）。F_q′/F_v′值随测定温度的降低呈下降趋势，然而仅20 ℃时F_q′/F_v′值显著较高，且低于5 ℃后其均值的降低不显著（图3-D）。

低温也导致PSⅡ反应中心光化学效率稳定性的降低，如：F_v′/F_m′的CV值随温度降低依次为5.9%、4.37%、5.45%、6.81%、8.36%，F_q′/F_m′的CV依次为8.10%、9.74%、10.58%、11.20%、12.35%，而F_q′/F_v′为6.37%、10.44%、12.84%、15.21%、14.72%。

2.4 稳态作用光强和低温的交互效应分析

图4显示了20、10和0 ℃测定温度时，叶绿素荧光参数在200、800和1 500 µmol/（m²·s） 3个稳态作用光强下的变化。结果表明，中低光强下，10 ℃时的F_q′/F_m′较高，且在200 µmol/（m²·s）低光强时较为显著；而1 500 µmol/（m²·s）高光强时则随测定温度的降低呈下降趋势（图4-A）。随温度降低，F_v′/F_m′值在3个光强下均呈增高趋势，且中、高光强时3个温度间呈显著性差异（图4-B）。3个稳态光强下，F_q′/F_v′均随测定温度的降低呈下降趋势，且0 ℃时降低较显著（图4-D）。NPQ随温度降低呈现显著升高趋势，低强光时NPQ均值间的差异较大（图4-C）。

采用一般线性模型的双因素方差分析法（GLM unveriation），进一步分析了低温和高光强间的交互效应。结果表明，稳态作用光强下F_q'/F_m'和F_q′/F_v′对总变异的贡献（η²）较高，而低温对F_v′/F_m′和NPQ的影响要高于强光（表1）；强光和低温共存时，F_q'/F_m'、F_v′/F_m′、F_q′/F_v′和NPQ的显著性（Sig.）均较高，说明没有交互效应产生。

2.5 小嵩草叶片的光合色素

小嵩草叶片的叶绿素含量较类胡萝卜素高约5.32倍，叶绿素a、b比值（Chl a/b）为3.12（图5）。

3 讨论

小嵩草是青藏高原高寒小嵩草草甸的优势种和建群种，主要分布在海拔3 000 m的低斜坡到5 960 m的高地^［27-28］，生境恶劣，生长季内低温、疾风、强辐射等极端气候极为常见。植物常处于非生物胁迫状态^［29-30］，呈现出对高寒生境的较强适应性^［7］。小嵩草为典型寒冷中生植物，长期的高寒生存环境塑造了其较强的耐低温能力，表现为叶片PSⅡ最大光化学量子效率（F_v/F_m）的最适温度较低，在5~15 ℃之间。0 ℃低温可引起F_v/F_m的降低，然而，即使温度降至-5 ℃时也没有完全能抑制光合机构的活性。而温度高于15 ℃后，F_v/F_m值随暗适应时间的延长则呈降低趋势，呈现出光合电子传递和CO₂同化的限制。因载物平台上湿润的棉毛垫能维系离体叶片的水分供应，不存在叶片水分散失而导致光合活性降低的可能性；因此，温度高于15 ℃后，F_v/F_m值的降低及随暗适应时间的进一步降低，更多缘于较高温度时PSⅡ反应中心的逐渐失活和类囊体结构的开始紊乱^［31］。20 ℃和-5 ℃时，不仅F_v/F_m值较低，其均值的标准差也相对较大；与师生波等^{［26，32］}对小嵩草土壤干旱胁迫的结果极为相似，说明，叶片光合机构的稳定性明显较低。15 min暗适应后，对F_v/F_m均值变异系数（CV） 的计算进一步证实，-5℃和20 ℃时，PSⅡ反应中心容易呈现失活现象；当然，此时F_v/F_m的降低更多缘于PSⅡ反应中心的可逆失活。

逆境生理研究中，光响应曲线常用于分析快速光强度变化时光合机构光化学反应的生理可调节性^［33］。本研究中，除PSⅡ最大效率（F_v′/F_m′）外，低温逆境对小嵩草叶片PSⅡ运行效率（F_q′/F_m′）、PSⅡ效率因子（F_q′/F_v′）和PSⅡ反应中心非光化学猝灭（NPQ）的快速光响应曲线均有影响。1 000 µmol/（m²·s）的稳态作用光强下，F_q′/F_m′和F_q′/F_v′随温度的变化与不同测定温度时光响应曲线的相对变化趋势较一致，而F_v′/F_m′和NPQ的变化趋势则与之相悖。一个原因与两者稳态与非稳态测定的方式不同有关；光响应曲线属快速非稳态测定，每一梯度光强的平衡时间很短，F_v′/F_m′和NPQ在1 min或2 min的光强梯度测定中显然尚未达到稳态。通常光合气体代谢的光响应曲线测定需要经过一段时间的光诱导^［34］，叶绿素荧光的快速光响应也存在一个光适应状态的平衡^［35］。F_v′/F_m′和NPQ均与类囊体膜质子梯度的建立有关，其稳态过程与通过PSII反应中心的线性电子传递通量（LET），即PSII运行效率F_q′/F_m′不尽相同；F_q′/F_m′可快速反应光环境变化或其他环境因子改变时PSII反应中心的电荷分离状况^［21］。事实上，参数1-F_v′/F_m′也曾经被用作非辐射热能耗散的度量^［16］，也说明与NPQ的产生机理的相似。本文依据不同光强下基础荧光产率（F_s）和最大荧光产率（F_m′）的稳定趋势，将小于150 µmol/（m²·s）低光强的平衡时间设为2 min，而将大于200 µmol/（m²·s）光强的定为1 min。此平衡时间远大于诸多叶绿素荧光参数的快速光响应测定^［35］，各测定光强下的F_s已趋于稳定且F_m′也不再呈现较大变化；但涉及热耗散的F_v′/F_m′和NPQ尚未能完全平衡^［11］，尤其在低温环境下^［14］。与低温时F_v/F_m均值的稳定性降低相同，F_v′/F_m′、F_q′/F_m′和F_q′/F_v′随温度降低其均值CV也呈降低趋势；说明，低温下PSⅡ反应中心光化学效率的变异程度都较大，也与早期在土壤干旱胁迫的研究极为相近^{［26，32］}。非光化学淬灭的增高也可缘于失活反应中心的补充^［34-35］，故随NPQ值的升高其均值的CV较为稳定。因此，低温逆境不仅引起了小嵩草叶片PSⅡ反应中心光化学活性的抑制，也导致了其不稳定性的增高。

3个稳态作用光强和3个温度间的交互试验进一步证实，20、10、0 ℃测定温度时，F_q′/F_m′、F_v′/F_m′和F_q′/F_v′，以及NPQ随温度的变化趋势在3个光强下较一致，尤其1 500 µmol/（m²·s）高光强时的变化与1 000 µmol/（m²·s）稳态作用光强下的趋势极为类似。同样，F_q′/F_m′、F_v′/F_m′、F_q′/F_v′和NPQ在3个光强间的相对变化也与光响应曲线中的表现较一致。由图2-B和图4-B可知，无论快速光响应曲线的测定，还是3个稳态光强下的测定，F_v′/F_m′随光强的变化程度均较小，其均值相对平缓稳定。长期生存在青藏高原极端环境中的典型高山植物，一方面无时无刻承受着高寒逆境的胁迫，另一方面又呈现出较强的耐性和抵御逆境胁迫的能力^［36］；表现为，尽管低温引起了F_q′/F_v′和F_q′/F_v′的降低，但NPQ可持续升高且F_v′/F_m′有升高趋势；同时，PSⅡ光化学效率的不稳定性增大，但NPQ的CV几无变化。说明，小嵩草PSⅡ反应中心光化学淬灭能力的降低能较好地被非光化学淬灭的稳定提升所匹配，光合机构可维系运行，呈现出对低温逆境的较强适应和耐性。结果也进一步证实：环境胁迫常引起非辐射能量耗散的增强^［37-38］和PSⅡ反应中心能量转化效率的降低^［39］，也是植物体维系光合机构有效运行的一种保护措施^{［31，35］}。

本研究中，快速光响应曲线测定时每一个温度下均更换新的植物材料，而1 000 µmol/（m²·s）稳态光强下的温度响应测定和光温交互试验，都是由20 ℃开始，采用同一植物材料依次降温测定。不同的测定方式下，F_q′/F_m′、F_v′/F_m′和F_q′/F_v′在不同温度间的相对变化趋势基本一致，3个光强间的变化也与光响应曲线的结果相符。但快速光响应曲线中，NPQ的计算由于采用了每一次更换材料后暗适应15 min的最大荧光产率F_m，不同温度下其数值均低于20 ℃较适宜温度时的F_m，不可避免可导致低温范围内NPQ的相对低估。因此，随温度降低，NPQ光响应曲线相对变化也呈现依次降低趋势，这也是与稳态作用光强下NPQ相对变化截然相反的另一个原因。由于涉及与PSⅡ反应中心完全处于关闭状态时F_o的比较，不同温度下更换植物材料的快速光响应曲线的测定只得依据相应测定温度时的F_m进行计算，也就造成了对非光化学淬灭能力的低估。稳态光强下及光温交互试验均表明，NPQ随温度的降低呈升高的趋势（图3-C和图4-C），这既是叶片光合机构遭受潜在光抑制或光伤害的表现^{［31，34］}，也意味着小嵩草叶片能积极耗散低温逆境下由于光合电子传递能力的降低而积累的过剩激发能，维系光合机构的正常运行。此结果不仅与小嵩草的干旱模拟试验^{［26，32］}较一致，也与早期强太阳UV-B辐射对美丽风毛菊的研究结果^［18］相符。

低温逆境可影响植物叶片的光化学活性，导致光合电子传递速率的降低，致使PSⅡ反应中心积累较多的过剩激发能，引起光合机构的光抑制甚至光伤害^［39-40］。但低温逆境是否会加剧高光强引起的光抑制作用，低温和强光的双因素方差分析表明，F_q'/F_m'、F_v′/F_m′、F_q′/F_v′和NPQ均没有交互效应（表1），即强光下PSII光化学效率的降低和非光化学猝灭的增加并没有因为低温胁迫而加重。两因子中，光强是影响F_q'/F_m'和F_q′/F_v′的主要因素，其对总变异的贡献（η²）要高；而低温对F_v′/F_m′和NPQ的影响要高于强光。此结果与前期师生波等^［26］就土壤干旱和光强的交互效应研究结果不尽相同。土壤干旱胁迫时，尽管其对总变异的贡献很小，但非光化学猝灭NPQ和F_v'/F_m'存在着两种胁迫因子的交互效应。显然，土壤干旱为较缓慢的胁迫过程，植物可获得一定的驯化适应；但低温逆境往往表现为一个快速的胁迫过程，植物的抵御完全源自其抗性的强弱。因此，低温的影响较深刻，有时会高于光强；而小嵩草叶片PSII反应中心的光抑制不被低温逆境所加剧，则可能与长期低温强光的逆境驯化有关。

4 结论

综上所述，小嵩草为典型耐寒冷、旱中生植物，其叶片F_v/F_m的最适温度在5 ℃和15 ℃之间。尽管-5 ℃的低温并没有完全抑制光合机构的活性，但低温逆境也引起了小嵩草PSⅡ反应中心光化学活性的抑制，并导致其不稳定性的增高。温度响应和光温交互试验均表明，NPQ的增高能耗散因光化学效率降低而积累的过量激发能，维系叶片光合机构的有效运行。光强是影响F_q'/F_m'和F_q′/F_v′的主要因素，而低温对F_v′/F_m′和NPQ的贡献要高于强光，强光的光抑制并没有被低温胁迫所加剧。显然，小嵩草的生长发育过程既承受着高寒逆境的胁迫，又表现出较强适应性和耐性，其光合机构的正常运行处于不断受损和修复的平衡过程中；因此，低温也构成高寒小嵩草草甸地带性分布的重要因素。

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基金资助

青海省自然科学基金项目(2019-ZJ-7016)

青海省自然科学基金项目(2020-ZJ-919)

青海省创新平台建设专项(2017-ZJ-Y14)

青海省创新平台建设专项(2021-ZJ-Y05)