羊肉组织中6种抗微生物药物残留检测的 HPLC-MS/MS方法建立

Development of an HPLC-MS/MS method for detecting residues of six antimicrobial agents in lamb tissue

摘要

目的 为了对羊肉及其副产品中抗微生物药物残留进行快速痕量检测，优化检测技术，建立羊可食组织中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种药物残留检测的高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）。 方法 对0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇2种不同药物提取液进行了对比；以动物性食品中氟喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类药物检测国家标准为参考，比较HLB和C₁₈ 2种固相萃取柱对6种目标药物的净化效果；同时，分别用0.1%甲酸水、乙腈、0.1%甲酸乙腈、甲醇、0.1%甲酸甲醇作为洗脱液对提取净化后的样品进行洗脱，对比交叉组合的提取和洗脱效果。将建立方法应用于实际样品检测，并与国家标准检测方法进行对比和统计分析。 结果 确定了以0.1%甲酸乙腈提取30 min，HLB固相萃取柱净化，0.1%甲酸甲醇洗脱时，恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种药物质谱信息捕捉准确，色谱分离效果良好，在限定浓度范围内标准曲线回归系数R²均大于0.99，在5、20、50 μg/kg 3个加标浓度下回收率为73.3%~114.0%，相对标准偏差（n=6）1.01%~13.01%。6种药物在羊3种可食组织中检出限（LOD）0.05~1.2 μg/kg，定量限（LOQ）0.16~3.8 μg/kg，均低于现行国家标准中规定的该类药物残留检出限。单因素方差分析结果显示，方法与国家标准检测方法在检测结果上差异不显著（P>0.05）。 结论 建立了羊可食组织中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素药物残留检测的高效液相色谱串联质谱法，该方法灵敏、准确、高效，可为羊肉及其副产品中抗微生物药物残留监测、筛选和精准识别提供技术支撑。

Abstract

Objective This study was conducted to establish a high-performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method in order to optimize the detection technology and improve accuracy and efficiency of detecting antimicrobial drug residues in mutton and its by-products，specifically enrofloxacin，ciprofloxacin，ofloxacin，gentamicin，tilmicosin，and tylosin in mutton and its by-products. Method The study compared the extraction efficiency of 0.1% formic acid acetonitrile and 0.1% formic acid methanol. The purification effects of HLB and C18 solid-phase extraction columns on the six target antimicrobials were compared against national standards for detecting fluoroquinolones，aminoglycosides，and macrolides in animal food.Various eluents，including 0.1% formic acid water，acetonitrile，0.1% formic acid acetonitrile，methanol，and 0.1% formic acid methanol，were used to elute the extracted and purified samples，and their extraction and elution effects were compared.The established method was applied to the detection of actual samples and compared with the national standard. Result The results demonstrated that accurate information regarding enrofloxacin，ciprofloxacin，ofloxacin，gentamicin，tilmicosin，and tylosin could be captured by mass spectrometry using 0.1% formic acid acetonitrile extraction for 30 minutes，followed by washing with 0.1% formic acid methanol.The regression coefficients （R²） of the standard curves were all greater than 0.99 within the limited concentration range.The recovery rates ranged from 73.3% to 114.0%，and the relative standard deviations ranged from 1.01% to 13.01% at concentrations of 5，20，and 50 μg/kg. The detection limits （LOD） and quantitative limits （LOQ） of the six drugs in three types of edible sheep tissues were found to be in the range of 0.05~1.2 μg/kg and 0.16~3.8 μg/kg，respectively，which were lower than the detection limits stipulated in current national standards. Single-factor analysis of variance indicated no significant difference between the established method and the national standard method （P>0.05）. Conclusion A sensitive，accurate，and efficient HPLC-MS/MS method was established for the detection of enrofloxacin，ciprofloxacin，ofloxacin，gentamicin，tilmicosin，and tylosin residues in edible lamb tissues which could serve as a technical reference for monitoring，screening，and accurate identification of antimicrobial residues in mutton and its by-products.

Graphical abstract

关键词

羊可食组织 / 抗微生物药物残留 / 高效液相色谱串联质谱法

Key words

edible tissue sheep / antimicrobial drugs / high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

抗微生物药物在食品动物养殖中广泛应用，对防治疾病、提高生产性能发挥了重要作用。但与此同时带来了抗微生物药物残留及耐药性问题^［1］，消费者通过动物性食品长期摄入后对健康有潜在危害^［2-3］。因此，我国高度重视抗微生物药物的残留监控^［4］。动物性食品中抗微生物药物检测方法主要有酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）^［5］、分子印迹技术（molecular imprinting，MIT）^［6-7］、液相色谱法（liquid chromatography，LC）^［8］、气相色谱串联质谱法（gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）^［9-11］、液相色谱串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）^［12-16］等。但对多种不同类别抗微生物药物残留检测的方法较少，难以满足同时对多种抗微生物药物进行检测的需求。因此，探索动物性食品中多种抗微生物药物的快速检测方法，对于保障肉产品食用安全、促进动物养殖业健康发展至关重要。

为了对羊肉及其副产品中抗微生物药物残留进行有效监测，实现复杂样品基质中多种抗微生物药物残留的快速痕量检测，优化检测技术，提高检测效率，本研究建立了羊可食组织中多种抗微生物药物残留检测的高效液相色谱串联质谱法（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS），与国家标准规定的抗微生物药物检测方法比较。以期提高抗微生物药物检测效率，为动物可食产品中抗微生物药物残留检测、监测和精准识别提供科学依据，为确保羊肉食品质量安全提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

于屠宰加工企业随机采集57份羊肉组织（肌肉、肝脏、肾脏）。

1.1.2 仪器

液相色谱-质谱联用仪（Agilent 1290-6460 HPLC-MS/MS）、色谱柱：Eclipse Plus C₁₈（粒径1.8μm规格2.1 mm×50 mm，美国Agilent公司）、固相萃取小柱（HLB、C₁₈，美国Agilent公司）；高通量组织研磨仪（SCIENTZ-48，宁波新芝生物科技股份有限公司）；高速冷冻离心机（3-18ks，德国SIGMA公司）；冷冻台式真空离心浓缩仪（CVS-3110，东京理化械株式会社）。

1.1.3 试剂和药物标准品

甲酸、甲醇、乙腈为国产色谱纯（山东禹王和制药有限公司），柠檬酸、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠等试剂均为国产分析纯（烟台市双双化工有限公司）。恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、替米考星、泰乐菌素、庆大霉素标准品（纯度≥98%），购自上海Macklin生化科技有限公司。胶体金免疫层析试纸条（北京勤邦生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

准确称取2.5 g（±0.01 g）组织样品，用高通量组织研磨仪均质后进行样品前处理；使用胶体金免疫层析试纸条初步筛查无抗微生物药物残留样品作为空白样品，准确称取（2.5±0.01）g均质后的空白组织样品作为空白对照；准确称取（2.5±0.01）g均质后的空白组织样品后加入不同浓度梯度的标准工作液用于绘制标准曲线。

1.2.2 HPLC-MS/MS测定

1.2.2.1 提取

准确称取（2.5±0.01） g均质后的组织样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液10 mL，涡旋振荡2 min，再加入10 mL0.1%甲酸乙腈，涡旋振荡2 min，利用超声波清洗仪超声辅助提取30 min，4 ℃、6 000 r/min离心5 min，将上清液转入另一50 mL聚丙烯离心管中，样品残渣重复上述提取步骤，合并2次提取的上清液。

1.2.2.2 净化

HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水进行活化，取2.3.1提取液以小于1 mL/min的流速通过HLB固相萃取柱，再用10 mL乙醇淋洗，弃去淋洗液。用真空泵将固相萃取柱抽干30 min后，加入10 mL 0.1%甲酸甲醇进行洗脱 ，洗脱液收集于15 mL聚丙烯离心管中。收集的洗脱液在冷冻台式真空离心浓缩仪中35 ℃、2 000 r/min浓缩挥发至干燥，再以1 mL 0.1%甲酸水-甲醇（V∶V=9∶1）复溶残渣，经0.22 μm尼龙有机相微孔滤膜过滤后供仪器检测。

1.2.2.3 测定条件

液相色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C₁₈，1.8 μm，2.1 mm×50 mm或相当者；进样量：1 μL；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；流动相：A：0.1 mmol/L甲酸水溶液；B：甲醇。梯度洗脱条件见表1。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描（ESI+）；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：350 ℃；母离子、子离子、碎裂电压和碰撞气能量：见表2。

1.2.2.4 基质匹配标准曲线的绘制

用阴性空白样品提取液配制标准工作液：吸取混合标准工作液，用空白样品提取液稀释成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、300.0、500.0、1 000.0、2 000.0、3 000.0、5 000.0 μg/L浓度系列基质标准工作溶液。基质匹配标准溶液，按以上所述仪器条件进行测定。在上述浓度序列中至少选取5个浓度建立线性回归方程并绘制标准曲线，外标法定量。

1.2.3 样品检测及数据分析

将本研究所建立方法应用于实际样品检测，得出检测药物残留量。同一批样品通过氟喹诺酮类^［17］、氨基糖苷类^［18］及大环内酯类^［19］类药物残留检测国家标准方法检测，得出检测结果。使用Excel软件并采用单因素方差分析，对恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种抗微生物药物的检出结果进行分析比较，对比2种方法检测结果之间的差异性。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

应用Agilent 6460三重四级杆串联质谱仪对恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种抗微生物药物质谱条件进行优化。通过不同碎裂电压及碰撞气能量的选择，确保6种抗微生物药物质谱信息准确。恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素质谱图如图1~ 6 所示。

2.2 色谱条件优化

本研究对流动相条件进行了优化，以甲醇为有机相，同时在水相中添加甲酸，以0.1%甲酸水为水相，在不同时间段设置有机相和水相在流动相中的比例，利用不同浓度梯度考察分离效果。6种抗微生物药物质量色谱图如图7~12。

2.3 样品前处理条件优化

2.3.1 样品提取液及提取时间的选择

为了将6种抗微生物药都能较好的从样品中提取出来，在使用Na₂EDTA-Mcllvaine溶液进行初步提取的基础上，对0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇2种不同药物提取液进行了对比。在2.5 g初筛阴性样品中分别加入6种抗微生物药的混合标准工作液，通过不同溶液提取后测定药物浓度。在确定样品提取液后设置5~40 min共8个时间点，测定不同作用时间对提取效果的影响。结果显示0.1%甲酸乙腈对6种抗微生物药综合提取效果更好（图13~14），故选择Na₂EDTA-Mcllvaine溶液和0.1%甲酸乙腈作为样品提取液。在提取30 min后6种抗微生物药回收率不再明显改变（图15）。

2.3.2 固相萃取柱的选择

以动物性食品中氟喹诺酮类^［17］、氨基糖苷类^［18］和大环内酯类^［19］药物残留检测国家标准所使用的固相萃取柱为参考，对比HLB和C₁₈ 2种固相萃取柱对6种目标抗微生物药的净化效果。HLB固相萃取柱对恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素回收率达到70.48%~92.56%，C₁₈固相萃取柱对6种抗微生物药净化后回收率为34.63%~63.20%（图16）。

2.3.3 洗脱液的选择

在对比0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇2种不同药物提取液的同时，分别用0.1%甲酸水、乙腈、0.1%甲酸乙腈、甲醇、0.1%甲酸甲醇作为洗脱液对提取净化后的样品进行洗脱，对比交叉组合的提取和洗脱效果。从对比结果中可以看出，以0.1%甲酸乙腈为提取液，0.1%甲酸甲醇为洗脱液时效果最佳（图13~14）。

2.4 方法检出限、定量限和回收率

2.4.1 检出限

恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种抗微生物药物残留检测方法在肉羊3种可食组织中检出限0.05~1.2 μg/kg，定量限0.16~3.8 μg/kg（表3），均低于现行国家标准中规定的氟喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类药物残留检出限。

2.4.2 回收率

羊肌肉、肝脏、肾脏中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素在5、20、50 μg/kg 3个加标浓度下回收率为73.3%~114.0%，相对标准偏差（n=6）0.1%~13.1%（表4）。

2.5 样品测定

采用建立的6种抗微生物药物残留检测的HPLC-MS/MS对57份羊肉组织测定结果显示，6种药物均有检出，并检出了不得用于食品动物的氧氟沙星。恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素检出的样品份数分别为3、31、20、29、50、6份，其中替米考星检出率最高（87.72%），恩诺沙星最低（5.26%）；6种抗微生物药物残留范围分别为（μg/kg）：0.181 1~1.291 5、0.391 9~2.609 0、0.058 1~0.569 8、79.261 9~105.205 8、0.115 8~40.382 5、0.261 4~0.362 0（表5）。

将新建方法检测的试样中抗微生物药物残留量，与食品安全国家标准方法的测定结果进行单因素方差分析，结果显示，差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

质谱条件中的碎裂电压和碰撞气能量对离子丰度具有较大影响，对方法灵敏度有决定性作用^［20］。本研究在液相色谱仪中装入二极管，应用Agilent 6460三重四级杆串联质谱仪对恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种抗微生物药物质谱条件进行优化。首先在离子初步扫描（Ms2 Scan）模式下，寻找并选择6种药物的母离子，在确定碎裂电压后，通过逐级改变碰撞气能量来对母离子进行二级质朴扫描（Ms2 SIM），根据离子质荷比及其响应值选择具有代表性的子离子，以此来确定定性离子和定量离子。最后在全离子扫描（MRM）模式下将化合物离子信息进行复查，确定6种抗微生物药物质谱信息准确。

色谱条件作为液质联用技术中的重要影响因素，其流动性的组成及比例、色谱柱的选择及使用等条件都会对对化合物的色谱峰形、响应值和分离效果产生较大影响^［21］。H⁺能促进Q1四极杆内［M+H］⁺峰的形成，增加化合物在正离子模式下的离子化效率、分离度和响应强度^［22］。本研究对流动相条件进行了优化，以甲醇为有机相，同时在水相中添加甲酸，以0.1%甲酸水为水相，在不同时间段设置有机相和水相在流动相中的比例，利用不同浓度梯度考察分离效果，恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种抗微生物药物在本实验色谱条件下均可得到有效分离，为定性和定量分析奠定有利前提条件。

固相萃取技术（SPE）是根据不同待分离组分与萃取柱填料之间的相互作用力差异，利用多选择性固体吸附剂，将目标物、基质和干扰物分开，再经有机溶剂洗脱，从而实现对目标物分离和富集的一种前处理方式，常用于浓缩分析物和提高检出限。固相萃取由于对低浓度样品体系具有较高的选择性和适用性，被广泛应用于样品的预处理、浓缩和分析过程中^［23］。本研究对比了C₁₈和HLB固相萃取柱对恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素的保留效果，C₁₈固相萃取柱靶向作用小，对大多数化合物都具有一定的的保留能力，试验结果显示其对大环内酯类的替米考星及泰乐菌素保留效果较差，而对氨基糖苷类的庆大霉素保留效果却优于HLB固相萃取柱，但从6种目标药物的整体保留效果来看，显然后者净化后回收率更高。

本研究建立了动物性食品中6种抗微生物药物残留检测的HPLC-MS/MS，实现了3大类抗微生物药物的跨类别检测。方法灵敏、准确，仪器测定可在10 min内完成，但仍存在样品前处理过程耗时耗力的问题。本文所建立的方法样品前处理过程使用传统固相萃取柱，对于样品中目标待测物仍需经历提取、净化、洗脱等步骤，且样品检测过程依赖于仪器和实验技术人员，不能解决现场大批量样品检测问题。所以，未来动物性食品中危害化合物残留检测技术必然向着简单、便捷的样品前处理方向发展，笔者认为将快速高效前处理过程结合痕量测定手段是解决这一问题的有效途径，这也符合高效基质分散固相萃取技术（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，and Safe，QuEChERS）^［9，24］、ELISA、胶体金免疫层析法等技术的发展趋势。

4 结论

本研究建立了羊可食组织中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素药物残留检测的高效液相色谱串联质谱法。6种药物质谱信息捕捉准确，色谱分离效果良好，在限定浓度范围内标准曲线回归系数R²均大于0.99，可用于样品定性及定量分析。将新建方法应用于实际样品中抗微生物药物残留量检测，所得结果与食品安全国家标准方法的测定结果进行单因素方差分析，结果显示，差异不显著（P>0.05）。方法灵敏、准确、高效，可为羊肉及其副产品中抗微生物药物残留监测、筛选和精准识别提供技术参考，为确保羊肉品质量安全提供科学依据。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2019YFC1605705-2)

国家自然科学基金项目(32060822)

国家自然科学基金项目(31960726)

国家自然科学基金项目(31560700)

甘肃省重点研发项目-农业(20YF8FA136)

甘肃农业大学青年导师基金项目(GAU-QDFC-2020-010)

甘肃省优秀研究生“创新之星”项目(2021CXZX-391)