乳宁散对隐性乳房炎奶牛产奶性能影响和防治效果的评价

Effects of Ru Ning Powder on milking performance and subclinical mastitis prevention and treatment of dairy cows

摘要

目的 通过测定隐性乳房炎奶牛的产奶性能、血液理化和抗氧化能力等指标评价乳宁散在奶牛TMR全日粮中添加对隐性乳房炎的防治作用。 方法 选取400头高产奶牛，分为四组，每组100头牛，分别为乳宁散添加组（饲粮中每日添加乳宁散140 g/头牛，患隐性乳房炎），微生态制剂组（饲粮中每日添加微生态制剂100 g/头牛，患隐性乳房炎），对照组（正常日粮，患隐性乳房炎）及空白组（正常日粮，不患隐性乳房炎），试验期30 d。投药前一天和添加第30天检测4组奶牛的体细胞数和产奶性能；每组选取8头奶牛采集外周血及乳汁，分析比较血液理化、抗氧化（SOD、GSH-PX和T-AOC等）指标和促炎因子指标（IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α）。 结果 乳宁散添加组奶牛的产奶性能、血液理化指标和对照组相比与空白组相比均无显著性（P>0.05），乳宁散组与空白组的体细胞数和对照组相比差异显著（P<0.05），乳宁散组抗氧化能力和对照组与空白组相比有显著性差异（P<0.05），与微生态制剂组结果一致；乳宁散组IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α表达量对对照组有极显著性差异（P<0.01），降低幅度高于微生态制剂组。 结论 饲料中添加乳宁散对奶牛的产奶及健康均无影响，可有效防治隐性乳房炎。

Abstract

Objective The study aimed to evaluate the effectiveness of Ru Ning Powder addition to TMR diet in prevention and treatment of dairy cow’s subclinical mastitis by measuring their milking performance，blood physicochemical indexes and antioxidant capacity. Method Four hundred high-yielding cows were employed，and they was divided into four groups as follows：Ru Ning Powder addition group （140 g Ru Ning Powder were added to the feed for each cow per day，suffering from subclinical mastitis），microecological preparation addition group （100g microecological preparation were added to the feed for each cow per day，suffering from subclinical mastitis），control group （normal feeding，suffering from subclinical mastitis） and blank group （normal feeding，no subclinical mastitis）.The period of trial was 30 days. The number of somatic cell and milking performance of four groups of cows were determined on the day before dosing and on the 30th day after dosing.Eight cows in each group were selected for blood collection，milk collection，and for analyzing serum metabolism，antioxidant indicators （SOD，GSH-PX，T-AOC and more） and pro-inflammatory factor indicators （IL-1、IL-6、IL-8 and TNF-α）. Result Ru Ning Powder addition groups had no significant differences in milking performance and serum metabolism with the control and blank groups（P>0.05）.The somatic cell counts of both Ru Ning Powder addition group and blank group was significantly different from the control group（P<0.05）.The antioxidant capacity of Ru Ning Powder group was significantly different from the control and blank groups （P<0.05），while it did not significantly differ with microecological group. In Ru Ning Powder group，the contents of IL-1、IL-6、IL-8 and TNF-α were significantly different with the control group （P<0.01），and the decreasing amplitude was higher than that of the microecological group. Conclusion The results showed that Ru Ning Powder addition to the feed could effectively prevent and cure subclinical mastitis of dairy cows，with no effects on milking and health of them.

Graphical abstract

关键词

奶牛 / 隐性乳房炎 / 乳宁散 / 抗氧化 / 促炎因子

Key words

cows / subclinical mastitis / Ru Ning Powder / antioxidant / pro-inflammatory factor

乳房炎是世界上奶牛养殖业中一种常见的疾病，分为临床乳房炎和亚临床乳房炎。临床乳房炎奶牛的一般临床症状包括乳房出现红、肿、热、痛，产奶量急剧下降，严重者会出现乳头坏死^［1-3］。亚临床乳房炎又称为隐性乳房炎，发病后不表现临床症状，但乳汁体细胞数、pH值和电导率等相关指标有异常变化^［4］，发病率是临床乳房炎的15~40倍，而且会使患病牛产奶量降低4%~10%，大大降低乳的品质^［5-6］。目前，奶牛乳房炎主要采用抗生素和增强免疫力的药物来综合防治。虽然抗生素在治疗奶牛乳房炎方面发挥着重要作用，但不合理使用抗生素会导致耐药菌株持续出现，使其治疗效果不断下降。所以，单靠抗生素不能从根本上解决奶牛乳房炎问题。

随着人们对健康生活的日益重视，食品中抗生素残留问题也日益受到消费者的关注，非抗生素疗法也应运而生。中药是来源于自然界的纯天然物质，具有无药物残留、高效低毒、不易使致病菌产生耐药性等特点^［7］，用中药治疗奶牛隐性乳房炎具有较好的疗效。杨仲儒、钟英杰等人利用中药可调节奶牛免疫功能、活血通经、抑制细菌增长、有效提高机体细胞免疫功能的优点，对患有隐性乳房炎的奶牛进行治疗^［8-10］。乳宁散主要成分为蒲公英、淫羊藿、王不留行等中药，主治功能为活血化瘀，消痛，增强动物机体免疫力。王国庆等用乳宁散对患隐乳奶牛采用灌服的方式来检验乳宁散对奶牛机体的影响和治疗效果^［11］，证实给奶牛每天灌服乳宁散140 g持续7 d时治疗隐性乳房炎效果最佳。本试验旨在验证饲料中添加乳宁散是否会对奶牛产奶性能和健康状况产生影响，以及对隐性乳房炎的防治效果。

1 材料与方法

1.1 试验药物

乳宁散由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中兽医研究室研制。微生态制剂（生产批号为2021112501），由内蒙古和美科盛生物技术有限公司所研发，其主要成分包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及发酵豆粕等。兰州隐性乳房炎诊断液（LMT）（生产批号为2021106403）购自兰州牧药所生物科技研发有限责任公司。

1.2 试验动物与分组

本试验开展于宁夏回族自治区吴忠市孙家滩开发区奶牛养殖业专业合作社，试验动物伦理学证明批号为SYXK（Gan）2019-0002，试验时间为2021年12月7日至2022年1月10日。采取整群添加乳宁散和微生态制剂的方法，根据牛场DHI数据，乳宁散组（RG）、微生态组（MG）和对照组（CG）分别选取100头SCC（体细胞数）≥20万个/mL的奶牛，空白组（BG）选取100头SCC<20万个/mL的奶牛。乳宁散组和微生态组每日饲喂全混合日粮（TMR）的基础上每头牛分别添加140 g/d乳宁散和100 g/d微生态制剂进入饲料混匀后整棚投喂；对照组与空白组每日饲喂TMR日粮。

1.3 饲养管理

牧场根据中华人民共和国奶牛饲养标准配制TMR全日粮，日粮组成见表1。

所有试验奶牛按照牧场原定饲养方案进行，保证四组参试奶牛饲养管理基本一致。每天在中班投料时将乳宁散和微生态制剂添加到全日粮中。在试验期间四组奶牛均无患其他疾病。

1.4 样本采集与处理

采取投药前一天投药第10、20、30天时采集奶汁、血液，每个试验组挑选8头牛，采集不抗凝血和抗凝血用于检测血液理化指标、抗氧化酶活力及促炎因子表达量。

1.5 指标测定

1.5.1 产奶性能指标

乳脂率（MF）、乳蛋白（MP）、乳尿素氮（LN）和产奶量等产奶性能指标数据根据宁夏DHI测定中心每月提供奶牛产奶性能测定（DHI）进行统计。

1.5.2 乳汁体细胞数测定

乳汁体细胞数（SCC）根据宁夏DHI测定中心每月提供奶牛产奶性能测定（DHI）进行统计。

1.5.3 LMT检测

根据LMT诊断液说明书进行操作及结果判定。

1.5.4 血液生理学指标测定

采用Vet scan Hm 5血液分析仪分析抗凝血指标，包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）。采用迈瑞全自动生化仪（BS—240VET）分析血清中的生化指标，包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、尿素（UREA）、尿酸（UA）和血清肌酐（CREA-S）等。

1.5.5 血清抗氧化指标测定

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和总抗氧化能力（T-AOC）严格按照南京建成生物工程研究所所产试剂盒说明书进行。

1.5.6 促炎因子指标测定

白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子（TNF-α）严格按照上海酶联生物科技有限公司所产试剂盒说明书进行。

1.6 统计分析

采用SPSS 26.0统计分析软件对测得的产奶性能指标、血常规以及血生化进行单因子方差分析（one-way ANOVA），使用GraphPad做图分析体细胞数、抗氧化指标和促炎因子，以P<0.05作为评价差异性的标准。

2 结果与分析

2.1 乳宁散添加对奶牛产奶性能的影响

由表2可知，在奶牛饲粮每日添加140 g乳宁散，各试验组中的乳脂率、乳蛋白率、尿素氮率以及产奶量均无差异性（P>0.05）。

2.2 乳宁散添加对奶牛乳汁体细胞数的影响

由图1可知，以空白组为对照，在饲料添加前一天时，乳宁散组、微生态组和对照组体细胞数均和空白组有显著性差异（P<0.05）；在饲料添加第30天时，与空白组相比，乳宁散组和微生态组没有显著性差异（P>0.05），对照组和空白组有极显著性差异（P<0.01）。

2.3 乳宁散添加对奶牛乳汁LMT积分的影响

由表4可知，饲料添加前一天时，空白组均为LMT积分为0的健康牛，乳宁散组LMT积分为28，微生态组LMT积分为29，对照组LMT积分为23。饲料添加第30天时，空白组LMT积分为3，乳宁散组积分为4，微生态组积分为7，对照组积分为30。说明乳宁散可显著降低乳汁LMT积分，且效果优于微生态组，空白组和对照组LMT积分有上升的趋势。

2.4 乳宁散添加对奶牛血液生理学指标的影响

2.4.1 血常规

由表5可知，以空白组为对照，各试验组中WBC、RBC、HGB和PLT均无显著差异性（P>0.05）。乳宁散组和微生态组WBC随着饲料添加有一定下降趋势，对照组有一定上升趋势。

2.4.2 血清生化

由表6可知，各试验组中ALT、AST、ALP、ALB、TG、UREA、UA和CREA-S等指标均无显著性差异（P>0.05）。

2.5 乳宁散添加对奶牛抗氧化指标影响

由表7可知，以空白组为对照，乳宁散组NAG活力在饲料添加前一天与第10天时与空白组有极显著性差异（P<0.01），在第20、30天时没有显著性差异（P>0.05），与微生态组一致；MDA含量与MPO活力在饲料添加前一天时和空白组有极显著性差异（P<0.01），在第10、20、30天时没有显著性差异（P>0.05），微生态组MDA含量在饲料添加30 d时和空白组没有显著性差异，MPO在第20天时和空白组没有显著性差异；T-AOC、GSH-PX活力与SOD活力在饲料添加前一天时和空白组有极显著性差异（P<0.01），在第10、20、30天时没有显著性（P>0.05），且均与微生态组保持一致。

2.6 乳宁散添加对奶牛促炎因子表达量的影响

各试验组奶牛血液IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α表达量结果如图2所示。以空白组为对照，乳宁散组IL-1表达量在饲料添加前一天与第10天时和空白组有极显著性差异（P<0.01），在第20天时和空白组有显著性差异（P<0.05），在30天时和空白组相比没有显著性（P>0.05）；微生态组在饲料添加第20、30天时与空白组相比没有显著性（P>0.05）；对照组IL-1均和空白组有极显著性差异（P<0.01）。乳宁散组IL-6表达量在饲料添加前一天与第10天时和空白组有极显著性差异（P<0.01），在第20天时和空白组有显著性差异（P<0.05），在30天时与空白组相比没有显著性（P>0.05）。微生态组在饲料添加30 d时IL-6表达量仍和空白组有显著性差异（P<0.05）；对照组IL-6均和空白组有极显著性差异（P<0.01）。乳宁散组IL-8表达量在饲料添加前一天和第10天时和空白组有极显著性差异（P<0.01），在20 d时和空白组有显著性差异（P<0.05），30 d时与空白组相比没有显著性（P>0.05）；微生态组在饲料添加30 d时IL-8表达量仍和空白组有显著性差异（P<0.05）；对照组IL-8均和空白组有极显著性差异（P<0.01）。乳宁散组TNF-α表达量在饲料添加前一天和第10天时和空白组有极显著性差异（P<0.01），在第20天时和空白组有显著性差异（P<0.05），在第30天时无差异性（P>0.05）；微生态组在饲料添加第30天时与空白组相比没有显著性（P>0.05）；对照组TNF-α均和空白组有极显著性差异（P<0.01）。

3 讨论

奶牛隐性乳房炎无明显临床症状、难及时发现，一旦隐性乳房炎发展为临床乳房炎，不仅会增加治疗费用，延长治疗周期，而且会缩短奶牛的产奶寿命。奶牛隐性乳房炎在实际治疗中多以抗生素疗法为主，经治疗后常因乳中抗生素残留导致经济损失，所以寻找可代替抗生素的药物便成为了当今世界奶牛养殖的热门话题^［12-13］。中药作为一种天然药物，因其具有调节奶牛免疫功能和增强机体抗氧化能力，被越来越多的牧场用来防治奶牛隐性乳房炎^［14］。

乳宁散作为一种纯中药复方，具有成本低廉、临床治疗效果确切、应用方便、无药物残留等特点，主要功能为活血化瘀，提高机体免疫力。微生态制剂主要成分为植物乳杆菌，在饲料添加治疗隐性乳房炎的过程中具有活血化瘀的功效^［15-16］。在日粮中每天添加乳宁散140 g，共30天，乳宁散组SCC显著下降，说明在饲料中添加乳宁散有降低乳汁中体细胞的功能，可能具有抑菌消炎等作用。同时，乳宁散添加试验中乳脂、乳蛋白、乳尿素氮和产奶量在组间比较中均没有差异性，说明乳宁散不会对奶牛的产奶性能造成影响。

血液理化指标主要反应了动物机体组织器官的健康程度、代谢表达是否正常^［17-19］。在日粮中每天添加乳宁散140 g，第30天检测其WBC、UA和CREA-S等指标与健康组奶牛不存在显著差异，说明乳宁散对奶牛组织器官与生理代谢没有影响，适合长期饲料添加。

乳宁散组方中蒲公英、王不留行和淫羊藿等主要成分均是天然抗氧化药物。有研究报道称，蒲公英的有效成分蒲公英多糖和黄酮能清除自由基^［20-21］，对延缓衰老起到重要作用；康文锦等^［22］也证明蒲公英多糖能清除体内自由基，增强小鼠体内抗氧化酶的活性；李赵嘉等^［23］研究发现蒲公英黄酮能增强蛋鸡机体抗氧化能力；李芸达等^［24］研究表明王不留行多糖具有较强的抗氧化活性。该试验结果显示，乳宁散在饲料添加第20天时NAG、MPO活力与MDA含量均降低且与空白组一致。乳宁散组中T-AOC、GSH-PX和SOD活力均在第10天时有显著升高，表明乳宁散有显著提升机体抗氧化能力的作用。

IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α作为机体炎症反应中的主要促炎因子，参与机体炎症反应^［25］。TNF-α是单核-巨噬细胞在机体炎症期间产生的炎症细胞因子^［26］，IL-1和IL-6是由巨噬细胞和T淋巴细胞分泌^［27］，用来参与部分非特异性免疫调节及促炎反应。IL-8是C-X-C趋化因子亚家族的成员，是中性粒细胞的重要激活剂，并参与各种炎症反应^［28］。有研究报道称，蒲公英和淫羊藿可通过抑制NF-κB信号通路的激活降低IL-1、IL-6、IL-8、和TNF-α的表达，达到抗炎镇痛的作用^{［29，30］}。乳宁散组在添加第30天时，IL-1、IL-6和IL-8的表达量表达水平与健康组基本一致，而微生态组与空白组IL-6和IL-8表达量表达仍显著高于健康组。乳宁散组TNF-α表达量在试验第20天时降至空白组水平。

本试验结果证明，乳宁散在增强抗氧化能力与降低促炎因子表达量作用优于微生态制剂。王清宇等人^［31］将杜仲叶、银杏叶、黄芪和甘草等中药接种乳酸杆菌和酵母菌等益生菌发酵后制成中药微生态制剂，证明此中药微生态制剂对奶牛乳房炎有较好的治疗效果。乳宁散中蒲公英、王不留行和淫羊藿等中药与微生态制剂中植物乳杆菌联用的对隐性乳房炎的治疗效果有待进一步探讨。

4 结论

综合以上结果，在奶牛TMR全日饲粮中添加140 g/d乳宁散对奶牛产奶性能、血液常规指标以及血清代谢指标没有影响，能有效降低乳汁体细胞数和促炎因子表达量、提高抗氧化能力，可用于预防、治疗奶牛隐性乳房炎。

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基金资助

奶牛乳房炎综合防控技术研发及标准化乳房炎控制奶牛场建设与示范：奶牛乳房炎绿色防控产品与技术研发(2019BBF02027)