当归春化作用相关SOSEKI基因的鉴定及表达分析

Identification and expression analysis of the vernalization-related SOSEKI gene in Angelica sinensis

摘要

目的 探明当归（Angelica sinensis）春化作用相关SOSEKI （SOK）基因的生物学功能，分析其对春化作用和冷冻温度的表达响应。 方法 基于当归种苗春化作用（0 ℃）和冷冻贮藏（-3 ℃）后的全长转录组测序，挖掘春化作用基因FLOWERING LOCUS C （FLC），利用在线生物信息学工具分析其生物学功能，并对表达模式进行qRT-PCR验证。 结果 从当归全长转录组中挖掘到一个含1 005个碱基的AsSOK基因，包括FLC及其侧翼基因UPSTREAM OF FLC （UFC） 和 DOWNSTREAM OF FLC （DFC），亚细胞定位于细胞核；保守基序和系统进化树分析显示，该基因编码的蛋白质含有4个保守基序（motif-2、-4、-5和-6），与黄胡萝卜（Daucus carota subsp.Sativus）中的LOC Dc108213152关系最近，具有相似的结构和位置。基因表达检测发现，AsSOK基因在种苗春化作用过程中表达量显著下降，而在冷冻贮藏过程中显著增加。 结论 第一次挖掘到并全面分析了当归春化作用相关基因AsSOK的生物学功能，为利用基因编辑AsSOK调控当归抽薹开花等研究提了供理论基础。

Abstract

Objective To study the biological function of the vernalization-related SOSEKI (SOK) gene in Angelica sinensis and to analyze its expression pattern in response to vernalization and freezing temperatures. Method The vernalization-related FLC gene was found out based on the full-length transcriptome sequencing of A. sinensis seedlings stored at vernalization (0 ℃) and freezing (-3 ℃) temperatures,its biological function was analyzed using the online bioinformatics tools, and gene expression was validated by qRT-PCR. Result A three-gene cluster AsSOK of 1 005 bases was identified in A.sinensis,consisting of FLC and its two flanking genes UPSTREAM OF FLC (UFC) and DOWNSTREAMOF FLC (DFC), and localized subcellularly in nucleus. Conserved motif and phylogenetic analysis showed that the AsSOK protein contained four motifs (motif-2,-4,-5,and -6) and had the closest relationship with LOC Dc108213152 of Daucus carota subsp.sativus with similar motif composition and position. Gene expression analysis showed that the expression level of AsSOK gene significantly decreased during vernalization, while it increased at freezing temperatures. Conclusion This study is the first time to unravel and comprehensively analyze the biological function of vernalization-related AsSOK gene cluster, which will provide fundamental basis for regulating the bolting and flowering of A.sinensis by gene AsSOK editing technique.

Graphical abstract

关键词

当归 / 春化作用 / SOSEKI / FLOWERING LOCUS C / 生物信息学分析 / 表达模式

Key words

Angelica sinensis / vernalization / SOSEKI / FLOWERING LOCUS C / bioinformatic analysis / expression pattern

当归为常用大宗药材，来自伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，年需求量约3 万t，年在地面积约4.3万hm^2［1-2］。在生产上当归一般第2年收获肉质根用作药材，留存于地中的根第3年抽薹开花，用于收获种子。但甘肃岷县等主产区当归第2年就出现高于40%的植株提前抽薹开花（即早薹开花），严重时高达90%以上，早薹开花使得植株肉质根木质化，不能入药^［3-5］。种植中早薹开花导致严重减产问题一直是多年来困扰当归高质量生产的最严重问题之一^［6-8］。

研究证实，当归为“低温长日照型”植物，即种苗在越冬期必须完成春化作用（0~5 ℃），且春季移栽后需满足长日照（>10 h）才能抽薹开花^［7-8］。研究发现，种苗越冬期给予-3~-8 ℃冷冻贮藏可避开春化作用，或春季移栽后给予50%~60%的植株遮阳处理，可显著降低早薹开花率^［9］。为了揭示当归抽薹开花的分子机制，很多学者就当归全生育期（春化作用和光周期）组织形态、生理生化和分子生物学等方面的变化开展了大量的研究。在组织形态方面，春化作用促使种苗根顶端分生组织生长点突起并增大^［3］。在生理生化方面，春化作用提高了种苗体内可溶性糖、游离氨基酸和有机酸含量以及硝酸还原酶活性^［10］；早薹植株相对于未抽薹植株可溶性糖和蛋白质含量降低，而游离氨基酸含量、过氧化物酶和多酚氧化酶活性升高，赤霉素（GA₁、GA₄、GA₉和GA₂₁）含量升高，而GA₈含量下降^［11-12］；抽薹开花过程中植株体内可溶性糖、赤霉素（GA₁、GA₃ 和GA₄）、吲哚乙酸、玉米素核苷和多胺类含量均逐渐增加^［13-14］。在分子生物学方面，通过对当归全生育期（春化作用和光周期）进行转录组测序与分析，发现约有70个功能基因通过主要5条途径调控抽薹开花：春化作用途径、光周期途径、激素途径、自主途径和年龄途径^{［12，14-16］}。

春化作用和光周期在诱导植物成花过程中同等重要，通常表现为春化作用可使分生组织获得向花器官转变的能力，然后给予适宜的光照才能保证开花；若冬性植物没有完成春化作用，即使给予适宜的光周期也会延迟开花或一直处于营养生长阶段^［17］。研究普遍认为，春化作用涉及开花抑制子FLOWERING LOCUS C（FLC）基因表达的表观遗传变化，FLC基因在没有经过春化作用的顶端分生组织区域高度表达，随着低温春化时间延长而逐渐减弱，待春化完成后该基因表达被关闭^［18-19］。尽管前人通过转录组测序发现了FLC基因在当归早薹花芽和正常植株中的差异表达，但是对其碱基结构、生物学功能及其表达模式没有进行深入分析^［16］。为此，本研究基于当归种苗春化作用（0 ℃）和冷冻贮藏（-3 ℃）处理后的全长转录组测序结果，挖掘FLC基因，通过在线生物信息学工具分析其生物学功能，并对表达模式进行qRT-PCR验证，为调控当归抽薹开花等方面的深入研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 全长转录组数据来源

当归全长转录组测序材料来自岷归1号正常种苗（根顶端直径0.4~0.5 cm）的3个不同温度及时长处理：未完成春化作用（T₁；0 ℃，14 d）、完成春化作用（T₂；0 ℃，60 d）和冷冻贮藏回避春化作用（T₃；-3 ℃，125 d）；全长转录组由广州基迪奥生物科技有限公司测序完成，原始数据已提交NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA789039）。

1.2 方法

1.2.1 当归SOK基因簇鉴定

AsSOK基因的编码序列（coding sequence）来自于当归种苗在T₁、T₂和T₃处理后的全长转录组测序与分析结果。生物学功能分析利用Swiss-Prot数据库（https：//www.uniprot.org）。AsSOK蛋白质序列分析利用ExPASy在线网站（https：//web.expasy.org/protparam），获取氨基酸长度、相对分子质量、理论等电点和分子式。AsSOK蛋白质二级结构预测（如α-螺旋、β-转角和无规则卷曲等）利用PRABI-Gerland在线网站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）。AsSOK蛋白质亚细胞定位利用Cell-PLoc 在线网站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）。AsSOK蛋白质3D 建模利用Phyre 2在线网站（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）。

1.2.2 系统发育树和保守基序分析以及多序列比对

在TAIR数据库（https：//www.arabidopsis.org）和NCBI 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），收集模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和其他植物中与AsSOK蛋白质置信度较高的99个蛋白质，利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。利用DNAMAN软件进行蛋白质多序列比对，深蓝色表示相似度100%、粉色>75%、浅蓝色>50%，R表示无规则卷曲。AsSOK蛋白质保守基序分析利用MEME在线网站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme），并利用TBtools对保守基序进行可视化。

1.2.3 AsSOK基因表达检测

以0 ℃和-3 ℃处理不同时期（14、21、30、45和60 d）的当归正常种苗为检测材料，利用Plant RNA Kit （R6827，Omega）提取总RNA，使用超微量浓度检测仪和琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度、浓度和完整性。利用NCBI 在线工具Primer-BLAST （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计AsSOK基因引物序列，正向引物：ACACTGCTCCAAACACTCCAT、反向引物：GTTGTCGTTTGCCTTGTCGG （5'→3'），产物片段176 bp；以Actin作为内参基因，正向引物：TGGTATTGTGCTGGATTCTGGT、反向引物：TGAGATCACCACCAGCAAGG （5'→3'），产物片段109 bp^［20］，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。利用FastKing cDNA Kit（KR116，Tiangen）合成cDNA；利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（FP205，Tiangen）进行qRT-PCR检测；利用2 ^－△△Ct 法计算AsSOK基因的相对表达水平^［21］。

1.3 数据分析

针对AsSOK基因相对表达水平，每个试验重复3 次，采用SPSS 22.0软件进行One-Way ANOVA Duncan 数据差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 当归SOK基因的鉴定

通过对当归种苗春化作用和冷冻贮藏处理后的全长转录组测序结果进行分析，发现有一个含有1 005 bp的AsSOK基因（图1），其编码含有335个氨基酸的蛋白质在Swiss-Prot数据库中被功能注释，该AsSOK蛋白质的相对分子质量37.45 ku、理论pI 5.48、分子式C₁₆₁₀H₂₅₅₄N₄₅₆O₅₄₄S₁₄、不稳定指数64.14、脂肪族氨基酸指数63.13、平均疏水指数-0.849。蛋白质二级结构分析表明，AsSOK蛋白质的α螺旋（h）的比例28.96%、延伸链（e）的比例8.06%、β转角（t）的比例4.78%、无规则卷曲（c）的比例58.21%（图2）。3D建模结果显示，AsSOK蛋白质中的37个氨基酸与UPSTREAM OF FLC （UFC）蛋白质（DUF966，SOK4 D85A突变体）的置信度达到99.90%（图3 ）。亚细胞定位显示，AsSOK蛋白质定位于细胞核。

2.2 当归SOK基因的系统进化树分析与多序列比对

通过对AsSOK蛋白质以及其他99个蛋白质进行系统进化树分析，结果表明，这100个蛋白质可分为4类：Ⅰ（29）、Ⅱ（11）、Ⅲ（6）和Ⅳ（54），其中，Ⅳ可分为5个亚类：Ⅳa （9）、Ⅳb （8）、Ⅳc （15）、Ⅳd （6）和Ⅳe （16）；AsSOK蛋白质归属于Ⅳc，相似度最高的5个蛋白质依次分别为：黄胡萝卜（Daucus carota subsp.sativus） LOC Dc108213152、蓝果树（Nyssa sinensis） KAA Ns8530887.1、小果咖啡（Coffea arabica） LOC Ca113700942、小果咖啡（C.arabica） LOC Ca113697966 和咖啡（欧基尼奥伊德斯种，C.eugenioides） LOC Ce113776751（图4）。多序列比对结果显示，AsSOK蛋白质与以上5个蛋白质的序列相似度分别达到89.55%、61.31%、44.05%、42.6%和43.8%（图5）。

2.3 当归SOK蛋白质保守基序分析

保守基序分析结果表明，AsSOK蛋白质归属的Ⅳc中15个蛋白质共有6个motif，顺序依次为motif-3、motif-1、motif-6、motif-5、motif-4和motif-2，序列长度15~50；AsSOK蛋白质含有4个motif（motif-6、motif-5、motif-4和motif-2），其余14个蛋白质均含有6个motif；其中，AsSOK蛋白质与黄胡萝卜（Daucus carota subsp.sativus）中的LOC Dc108213 152具有相似的结构和位置（图6~7）。

2.4 当归SOK基因对春化作用和冷冻贮藏温度的响应

通过利用qRT-PCR对当归种苗中AsSOK基因在春化作用（0 ℃）和冷冻贮藏（-3 ℃）不同时期的表达水平进行测定，结果显示，在0 ℃处理下，AsSOK基因相对表达水平随着春化时间的延长显著下降；而在-3 ℃处理下，AsSOK基因相对表达水平随着冷冻时间的延长显著增加（图8）。

3 讨论

植物的开花主要受到5条途径的调控：春化途径、光周期途径、赤霉素途径、自主途径和年龄途径，其中涉及到正调控因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 （SO C1）、CONSTANS （CO）和APETALA 1 （AP1）等，以及负调控因子FLC、auxin response factors （ARFs）和Gibberellin receptor GID1B （GID1B）等^［17］。对当归的研究发现，其抽薹开花也主要受到以上5条途径的共同调控^{［12，14-16］}。当归为“低温长日照型”植物，目前对响应低温春化作用和光周期的关键基因功能鉴定，尤其是针对FLC的研究还鲜见报道。本研究基于当归种苗春化作用（0 ℃）和冷冻贮藏（-3 ℃）后的全长转录组测序结果，开展了开花抑制因子FLC基因的挖掘、生物学功能分析和基因表达模式验证。

SOSEKI（SOK，日语中为“奠基石”）基因簇为3基因［FLC、UFC和DOWNSTREAM OF FLC （DFC）］的一部分，该3个基因FLC、UFC和DFC协同响应低温春化作用^［22-23］。目前，从模式植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）基因组中已鉴定5个同源SOK基因，即SOK1（At1g05577）、SOK2（At5g10150）、SOK3（At2g28150）、SOK4（At3g46110）和SOK5（At5g59790），分别编码372、414、540、343和423个氨基酸；进一步研究发现，这5个AtSOK蛋白质为极度保守的不稳定蛋白质，可通过影响细胞分裂方向协同调控细胞极性，进而在细胞形态建成方面起到关键作用^［23-24］。本研究发现，当归中的AsSOK基因含有1 005 bp，可编码含有335个氨基酸的AsSOK不稳定蛋白质，其与SOK4 D85A突变体（DUF966）中的UFC-like蛋白质置信度高达99.9%。对AtSOK4蛋白质的积累研究发现，其在植株侧根和胚中有少量积累^［23］。基于研究亚细胞定位预测表明，AsSOK蛋白质定位于细胞核，这暗示其可以通过转录调控赋予种苗顶端分生组织获得营养生长向生殖生长转化的能力。

研究发现，拟南芥中的5个AtSOK蛋白质均含有2个保守结构域：DIX-like结构域和CG基序，其在细胞极性分化中起到关键作用^［24］。本研究发现，当归AsSOK蛋白质含有4个保守基序，几乎不含CG基序，与黄胡萝卜（Daucus carota subsp.sativus）中的LOC Dc108213152具有相似的结构和位置。同时，系统进化树和多序列比对分析也显示，AsSOK蛋白质与LOC Dc108213152亲缘关系最近且相似度最高。这与当归和黄胡萝卜均为伞形科植物有关，也暗示二者具有相同的春化作用诱导抽薹开花的调控机制。

到目前为止，对于SOK基因簇（UFC、FLC和DFC）协同调控的研究鲜见报道。通过对拟南芥研究发现，低温春化作用使得UFC（At5g10150）、FLC（At5g10140）和DFC基因（At5g10130）的表达水平下降，然而UFC基因表达的稳定性相对FLC基因较差^［25］。本研究发现，低温春化作用（0 °C）抑制了当归中开花抑制因子AsSOK基因的表达，而冷冻贮藏（-3 ℃）诱发了AsSOK基因的高表达。这进一步从分子水平上证实了前人的研究结果：低温春化诱发了当归早薹开花，而冷冻贮藏通过规避春化作用有效抑制早薹开花^{［3，7-8，26］}。

4 结论

当归中AsSOK基因包括FLC基因及其侧翼基因UFC和DFC，可编码含有4个保守基序蛋白质，与伞形科植物黄胡萝卜（Daucus carota subsp.Sativus）中的LOC Dc108213152结构最为相似。尽管第一次从当归中挖掘到春化作用相关SOK基因，并对其生物学功能进行了较为全面的分析以及表达验证，但对其组成基因UFC、FLC和DFC的具体结构和生物学功能，还需要进行深入研究。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32160083)

国家中药材产业技术体系(CARS-21)

干旱生境作物学国家重点实验室主任基金项目(GSCS-2021-Z03)