邻苯二甲酸二丁酯对镰刀菌化感抑制机制研究

Allelopathy inhibition and its mechanism by dibutylphthalate on Fusarium

摘要

目的 研究邻苯二甲酸二丁酯（DBP）对百合根际土壤致病镰刀菌的增殖效应及其对该类真菌细胞亚显微结构的影响，阐明DBP对镰刀菌化感作用的效果。 方法 试验设置7个DBP浓度处理（CK：0 mmol/L、T₁：0.05 mmol/L、T₂：0.10 mmol/L、T₃：0.50 mmol/L、T₄：1.00 mmol/L、T₅：2.00 mmol/L、T₆：4.00 mmol/L），在添加了DBP的培养基上对4种镰刀菌（尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum ）进行培养，检测了DBP对镰刀菌菌落生长和产孢量的影响，并利用透射电子显微镜观察了DBP处理后尖孢镰刀菌亚显微结构的变化。 结果 DBP对镰刀菌产生了显著的化感抑制效应，在0.05~4.00 mmol/L的浓度范围内，随DBP浓度升高，菌落生长速度降低，产孢量下降，综合化感效应指数均随DBP浓度的增加上升，抑菌作用增强。DBP处理的尖孢镰刀菌，菌丝、孢子出现缢缩、畸形，并且表现出一定的浓度效应；细胞发生质壁分离，细胞壁、质膜被破坏，细胞内出现黑色颗粒，细胞内出现斜纹。 结论 DBP对兰州百合枯萎病致病菌镰刀菌的生长发育及其致病性具有持续的化感抑制作用，因此可尝试将其应用于百合病原性连作障碍和土传病害的防治。

Abstract

Objective To study the value-added effect of dibutylphthalate （DBP） on the pathogenic Fusarium in lily rhizosphere soil and its effect on the ultrastructure of the fungal cells，and to clarify the effect of DBP on the allelopathy of Fusarium. Method In the experimental setup of 7 DBP concentration treatments，four Fusarium species （F.oxysporum，F.solani，F.tricinctum，and F.avenaceum） were cultured on the medium supplemented with DBP，and the growth and spore production as well as the submicroscopic structure of F.oysporum cells were measured. Result DBP had a significant allelopathy inhibitory effect on Fusarium strains.Within the DBP concentration range of 0.05 mmol/L to 4.00 mmol/L，the colony growth rate decreased with increasing concentration，while the spore production decreased，resulting in an increase in synthetic index.The submicroscopic observation results showed that under the DBP treatment on F.oxysporum，both the fungal hyphae and spores were constricted and malformed，and these changes seem to be more serious with the increase of DBP concentration.In addition，plasmolysis was observed in some cells，and the cell wall and plasma membrane were disturbed，and some kind of black particles appeared in the cells. Conclusion These results suggest that DBP has allelopathic inhibitory effect on the growth and development of Fusarium，the pathogenic fungi of Lanzhou lily wilt，and its pathogenicity，so it can be tried to apply it to the prevention and control of lily pathogenic continuous cropping disorder and soil-borne diseases.

Graphical abstract

关键词

镰刀菌 / 根系分泌物 / 邻苯二甲酸二丁酯 / 化感效应 / 亚显微结构

Key words

Fusarium / root exudates / dibutylphthalate / allelopathic effect / sub-microstructure

病原性镰刀菌的积累及化感物质的积累是两个引起兰州百合连作障碍的主要原因。镰刀菌属（Fusarium）是植物根际土壤中存在最广泛的真菌之一，该属包括70个种^［1］。在作物连作栽培条件下，镰刀菌属真菌的积累是引起花生、黄瓜、香草等作物产生连作障碍的重要原因^［2］，该属的一些种，如Fusarium oxysporum是引起植物产生枯萎病的典型病原真菌^［3-6］。植物根系分泌物中存在的大量化感物质既可以对自身及周围其他植物产生化感作用，又可以通过对根际微生态环境的作用影响植物的生长发育^［7］。因此，研究根系分泌物对镰刀菌的影响，是植物病原性连作障碍治理以及土传病害防治的热点话题。

邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）是一种重要的根系分泌物，在很多植物中检测出该物质的存在，如在玉米^［8］、大豆^［9］、辣椒^［10］的根系分泌物，以及番茄^［11］植株成分中均分离鉴定出该物质，该物质可对植物自身产生化感抑制作用^［12-13］。DBP对细菌的化感作用也有报道：董蕾等^［14］研究发现，细菌节杆菌属^［15］、不动杆菌属^［16］等可以促进DBP的降解；而胡影等^［17］研究发现，DBP污染可抑制细菌生长，在对数生长期抑制作用显著。DBP对土壤病原真菌的化感效应研究仅有针对茄黄萎病植株病原性连作障碍所进行的零星报道：DBP及其类似化学物质邻苯二甲酸二异丁酯可以抑制茄子根际黄萎菌（ Verticillium dahliae）的增殖^［18-19］。DBP对于真菌的化感作用，除了上述提到的研究外，对其他真菌的化感作用效应及细胞的亚显微结构损伤研究存在很大空白。

研究DBP对土壤有害微生物的化感效应对于阐明作物连作障碍机理及其毒性效应评价具有重要意义。兰州百合是中国唯一的甜百合，该作物狭域分布，无性繁殖，多年生栽培，连作障碍发生十分严重^［20］。甘肃农业大学园艺学院兰州百合课题组开展兰州百合病原性连作障碍机理研究，通过水培法收集了兰州百合根系分泌物，利用GC-MAS方法证明DBP是兰州百合根系分泌的重要的化感自毒物质之一^［21］；同时从兰州百合主产区分离鉴定了尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）等百合枯萎病致病镰刀菌类群^［22］；且利用第二代测序技术研究了0~9 a连作栽培条件下兰州百合土壤微生物群落的变化，发现镰刀菌属真菌的积累是引起兰州百合连作障碍的原因，在连作6 a、9 a土壤中，其相对丰度分别达到了3.26%和7.60%^［23］。基于以上研究基础，本研究开展了DBP对4种百合根际土壤致病镰刀菌增殖效应的研究及其对该类真菌细胞亚显微结构的影响，以期阐明该物质对镰刀菌化感作用效果，为兰州百合枯萎病病原性连作障碍治理以及DBP的生态风险评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究选用培养基中添加外源化感物质，离体培养微生物的方法进行。DBP由上海源叶生物科技有限公司生产。4个镰刀菌株分别是：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum） 、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum ）（保存于甘肃农业大学园艺学院实验室4.0 ℃冰箱中）作为病原菌试验材料。

1.2 DBP对镰刀菌增殖的影响

试验设计7个DBP浓度处理，分别为CK（0 mmol/L）、T₁（0.05 mmol/L）、T₂（0.10 mmol/L）、T₃（0.50 mmol/L）、T₄（1.00 mmol/L）、T₅（2.00 mmol/L）、T₆（4.00 mmol/L），每处理3次重复。

将4种镰刀菌菌饼（φ=5 mm）接种于添加了不同浓度DBP的PDA培养基上，于28 ℃下恒温培养7 d。培养3 d后测定菌落的直径，每隔24 h测定一次，绘制菌落生长速率曲线。以培养第5天的数据计算菌落纯生长量；培养第7天后测量产孢量^［24-25］。同时，计算化感效应指数（RI）和综合化感效应指数（SE）^［26-31］。计算方法如下：

菌落纯生长量（mm）=2次所测菌落直径的平均值-菌饼的直径（1）

产孢量（个/mL）=（测量所得孢子数/80）×400×10 000×稀释倍数（2）

化感指数（RI）=（对照值/处理值）-1（3）

综合化感效应指数（SE）=多个测定结果的RI的平均值（4）

1.3 DBP对尖孢镰刀菌亚显微结构的影响

依据周宝利等^［19］的研究，我们设置浓度为0、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L DBP处理的尖孢镰刀菌，培养7 d后用于显微观察。具体步骤是：在无菌条件下，挑取少许菌丝，置于1.5 mL离心管中；加入0.2 mol/L的磷酸缓冲液（PBS），将其置于冷冻离心机中，于3 000 r/min，4 ℃条件下，离心10 min，重复2次，使菌丝离心成团。对离心后的菌丝团用3%戊二醛进行固定，0.2 mol/L磷酸缓冲液漂洗，2%锇酸再次固定，0.2 mol/L磷酸缓冲液再次漂洗。不同浓度乙醇、丙酮脱水，经过包埋、烘干、打磨修块、切片、染色，制成电镜切片，最后置于透射电镜（JEM-1230型）下进行观察，拍照。

1.4 数据处理

数据统计分析处理采用Excel 2016和SPSS 22.0统计软件进行方差分析，处理间的差异显著性用Duncan′s Multiple Range Test法。

2 结果与分析

2.1 DBP对镰刀菌菌落生长的影响

DBP处理抑制了镰刀菌的菌落生长，且DBP对菌落生长的抑制作用呈现明显的浓度效应。与对照相比，各菌株DBP处理的菌落生长速度均显著低于CK。从第6天开始，各处理菌落生长速率均有所减慢。各菌之间比较，尖孢镰刀菌2.00 mmol/L处理的生长抑制作用大于其他浓度的处理；茄病镰刀菌和燕麦镰刀菌4.00 mmol/L处理的生长抑制作用大于其他浓度的处理；三线镰刀菌0.50 mmol/L处理的生长抑制作用大于其他浓度的处理。总体来说，随着DBP浓度的增加，菌落生长速度受到抑制，但抑制程度不同（图1）。

2.2 DBP对镰刀菌产孢量的影响

对培养第7天的菌落产孢量测定结果进行多重比较，结果表明，DBP对镰刀菌产孢量的抑制作用具有浓度效应，与其他处理（CK除外）相比较，尖孢镰刀菌在0.05 mmol/L处理、茄病镰刀菌和燕麦镰刀菌在0.50 mmol/L处理、三线镰刀菌在0.10 mmol/L处理相对最有利于菌落的产孢，其菌落产孢量高于其他处理（P≤0.05）。以上述各镰刀菌相对最高产孢量的DBP处理浓度为分界点，总体表现出DBP对镰刀菌产孢量存在先促后抑的变化特点（从处理0.05 mmol/L 开始，DBP对尖孢镰刀菌的产孢量仅表现出抑制效应）（表1）。

2.3 DBP对镰刀菌增殖的化感效应分析

DBP对镰刀菌表现出化感作用。在菌落生长方面，4种镰刀菌在0.05 mmol/L处理受到的化感抑制作用相对最弱；在产孢量方面，尖孢镰刀菌在0.05 mmol/L处理、茄病镰刀菌和燕麦镰刀菌在0.50 mmol/L处理、三线镰刀菌在0.10 mmol/L处理受到的化感抑制作用相对最弱（图2）。综合考虑DBP对菌落生长和产孢量两个方面的影响，分析DBP对镰刀菌的综合化感效应，总体表现出：随着处理浓度的不断增高，镰刀菌受到的化感抑制作用不断增强。在同等处理条件下，比较DBP对4种镰刀菌的化感作用，尖孢镰刀菌受到的化感抑制作用最强，茄病镰刀菌、三线镰刀菌、燕麦镰刀菌受到的化感抑制作用依次不断减弱。4种镰刀菌对DBP的敏感程度不同，尖孢镰刀菌对DBP的影响表现相对最敏感，燕麦镰刀菌敏感度相对最低（图3）。

2.4 DBP对尖孢镰刀菌亚显微结构的影响

图4为镰刀菌细胞亚显微。结果表明，DBP处理的尖孢镰刀菌，其菌丝、孢子表面均呈现出不平滑，有不同程度的凸起或凹陷（图4-D至图4-O），有些孢子和菌丝的结构出现了明显的、向内的缢缩（图4-F、图4-M、图4-N），菌丝、孢子出现畸形（图4-E~图4-O）。以上变化特征均随着DBP处理浓度的增大而加剧，表现出一定的浓度效应。有些菌丝出现了明显的质壁分离现象（图4-K）。细胞内出现了大量的小体积的、高致密度的黑色颗粒（图4-L、图4-O）。部分细胞的细胞壁、质膜明显被破坏，表现出轮廓模糊，或结构不完整（图4-E、图4-F、图4-H、图4-I、图4-L、图4-M、图4-N、图4-O），有些细胞壁厚薄不均匀（图4-F、图4-O）。另外，在所有处理的菌丝、孢子细胞内，均有大量的、斜向的、较致密的条纹状结构，此结构待进一步确定。

3 讨论与结论

本研究结果显示，DBP对于镰刀菌具有显著的化感抑制效应：DBP处理可以抑制菌落的生长及孢子的产生，引起镰刀菌细胞的亚显微结构损伤，且该作用具有浓度效应。上述结果与周宝利等^［18］关于DBP处理可以抑制茄子根际黄萎病菌的增殖研究结果一致。嫁接茄子根系分泌物中DBP相对含量高于自根茄，由此推测DBP可能是嫁接茄子抗病产生的原因之一^［7］。在农田生态系统中，DBP会发生降解：先水解为邻苯二甲酸单丁酯 （MBP） 和相应的醇，然后 MBP 降解为邻苯二甲酸和苯甲酸丁酯^［32］，因此，DBP可以对尖孢镰刀菌生长发育及致病性产生持续的化感抑制作用^［33］。DBP对黄瓜幼苗抗氧化系统的激活致使活性氧的形成，从而导致细胞损伤^［34］。以上分析表明，DBP具有作为化感抑制剂应用于农作物土传病害防治的可能性。镰刀菌属是植物根际土壤中存在最广泛的真菌之一，本研究结果为评价DBP对真菌的生态效应提供了依据。

本研究在细胞亚显微结构层次揭示了DBP对镰刀菌的损伤机制，DBP处理镰刀菌，可以使真菌孢子、菌丝结构缢缩，细胞壁、质膜结构被破坏，轮廓模糊，甚至不完整，高致密度黑色颗粒明显增多。类似现象与他人关于DBP对藻类细胞亚显微结构损伤的研究结果相似，如DBP可以破坏绿藻（Mesostigma viride）细胞膜、线粒体完整性，最终导致细胞空洞化死亡^［35］；DBP可以引起短裸甲藻（Gymnodinium breve）细胞氧化损伤，表现为叶绿体、线粒体等细胞器变模糊，细胞空泡化，原生质膜皱缩，细胞内出现了大量的小体积的、高致密度的黑色颗粒。关于该黑色颗粒，前人在该类研究中亦有类似描述，但对其是何种结构，持有不同观点：有人认为该黑色颗粒为脂质体^［36］，有人认为是沃罗宁小体（Woronin bodies）^［37］，也有人认为是细胞的降解产物^［38］，还有人认为是嗜锇颗粒^［39］。脂质体是一种由磷脂组成的双分子层膜的球形小泡^［40］，是一种膜质运载体系，可提高被包裹物的生物利用度和溶解性等性能^［41］；沃罗宁小体作为细胞的一种结构，存在于孢子或菌丝的隔附近，其主要功能与隔有关^［37］。笔者根据相关文献描述及图片比对，将该黑色颗粒确定为脂质体。主要的依据是：本试验中的黑色颗粒，直径约为0.1~0.2 μm，小于上述文献提及的降解产物直径（该黑色颗粒直径约为0.5 μm）^［38］，而沃罗宁小体主要存在于孢子或菌丝的隔附近^［37］，而本试验中的黑色颗粒并不局限在隔附近存在。李赤等^［39］关于巴西蕉叶片超微结构的研究发现，嗜锇颗粒是植物叶绿体膜结构的降解产物——脂类发生集结的结果，经粗毒素处理后，细胞内嗜锇颗粒明显增多。此描述接近脂质体的形成。另一方面，按照Bangham提出的薄膜分散法（Thin-layer dispersion method），脂质体的传统制备方法主要分为三步：（1）脂质化合物等溶于有机溶剂；（2）采用减压或充氮气除去有机溶剂，形成脂质薄膜；（3）将水相介质加入脂质薄膜中洗膜，制成均匀的脂质体悬浮液^［42-43］。按上述方法，离心后的菌丝团用戊二醛固定，相当于完成脂质体传统制备方法的第一步，用磷酸缓冲液漂洗，相当于完成了第二步，用不同浓度乙醇、丙酮脱水，相当于完成第三步，故在电镜制片过程中，很容易形成脂质体。另外，本试验电镜观察的黑色颗粒直径约为0.1~0.2 μm，符合单层脂质体的粒径0.01~1 μm的范围^［41］。综上所述，笔者将电镜观察中的黑色颗粒确定为脂质体。

本研究结果还显示，DBP处理使镰刀菌菌丝细胞发生畸形，具体表现为：细胞壁厚薄不均匀，类似前人报道：在400 μL S.griseorubens E44G处理后，番茄镰刀菌的细胞呈现细胞质萎缩，质膜局部收缩，细胞壁肿胀特征^［37］。在尖孢镰刀菌被从P.incisa中提取的酚类物质处理后，其细胞质膜扭曲，出现不同程度质膜被破坏，Mohamed Mahmoud S M等分析，认为酚类化合物的亲脂性可使其穿透细胞膜，进而改变细胞通透性，形成过量的过氧化物和氧自由基，从而破坏细胞的膜结构^［34］。由此推论，DBP对尖孢镰刀菌的破坏，首先从细胞壁开始，进而延伸到内部。随着DBP处理浓度的增高，DBP对尖孢镰刀菌的破坏程度加大，呈现细胞畸形、质壁分离加剧、细胞壁、质膜破坏加重、细胞质收缩等变化。本研究还观察到尖孢镰刀菌的孢子、菌丝内出现大量的条纹状结构。该条纹状结构呈现斜向，且在所有处理的细胞中均能观察到，分布很规律，基本出现在细胞基质和液泡部位。笔者分析，该条纹状结构没有出现在同一条带上，分布错落不齐，且在细胞以外该条纹状结构中断。故该结构肯定不是电镜切片时的划痕所致；经查阅文献，发现一些真菌的卵孢子、分生孢子的电镜图片中就有“条纹状结构”的出现^［44-45］，因此该条纹结构也不是随机事件。对于该结构及其产生机制，尚需做进一步的研究，以待确定。

本研究结果显示，DBP可以对兰州百合枯萎病致病菌镰刀菌的生长发育及其致病性具有持续的化感抑制作用，因此可尝试将其应用于百合病原性连作障碍和土传病害的防治。本文通过试验，以期能全面评价DBP对植物本身以及该化学物质在土壤-植物系统中的累积特征，研究DBP对植物产生的毒害作用及其对农田生态系统所产生的生态风险，在此基础上，筛选适合的剂量、剂型及应用方法，为该新型农药研究工作开辟新的方向。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31860549)

兰州市科技计划项目(2017-4-95)

甘肃农业大学学科建设基金项目(GAU-XKJS-2018-05)