苜蓿花叶病毒和白三叶草花叶病毒复合侵染对本氏烟4种抗病相关酶活性的影响

Impact of co-infection with alfalfa mosaic virus and white clover mosaic virus on disease resistance-related enzymes in Nicotiana benthamiana

摘要

目的 探明苜蓿花叶病毒（alfalfa mosaic virus，AMV）和白三叶草花叶病毒（white clover mosaic virus，WCMV）（3∶1）复合侵染后对本氏烟（Nicotiana benthamiana）的致病机理。 方法 试验以单独摩擦接种AMV、WCMV和PBS缓冲液（pH 7.0）的本氏烟为对照，分别采用生物化学法测定了AMV+WCMV（3∶1）复合接种的本氏烟在第2、4、6、8、10天时叶片中4种抗病相关酶的活性。 结果 当AMV+WCMV（3∶1）复合接种的本氏烟叶片中过氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性达到最大值时，与单独接种AMV、WCMV和PBS缓冲液对照相比显著提高（P<0.01），且4种酶应激反应速度不同。 结论 AMV+WCMV（3∶1）复合侵染可加重病毒病害的发生，并显著提高寄主中与抗病性相关的POD、PAL、PPO、CAT4种酶活性。

Abstract

Objective This study aimed to investigate the synergistic pathogenic mechanism of co-infection with alfalfa mosaic virus （AMV） and white clover mosaic virus （WCMV） （3∶1） in Nicotiana benthamiana. Method The activities of four disease-resistant enzymes in leaves were determined at 2，4，6，8，and 10 days after co-inoculation of AMV+WCMV （3∶1） using a biochemical method，with individual friction inoculation by AMV，WCMV，and PBS buffer solution （pH 7.0） as the control. Result The results demonstrated that the activities of POD，PPO，PAL，and CAT enzymes in the leaves，which were treated with co-inoculation of AMV+WCMV（3∶1），were significantly increased compared to those inoculated with AMV，WCMV or the PBS buffer control alone（P<0.01）.The stress response rates varied among the four enzymes. Conclusion Co-infection of AMV+WCMV（3∶1） aggravated the occurrence of viral diseases and significantly enhanced the activities of 4 enzymes related to disease resistance （i.e.，POD，PAL，PPO，and CAT） in the host plant.

Graphical abstract

关键词

苜蓿花叶病毒 / 白三叶草花叶病毒 / 复合侵染 / 本氏烟 / 抗病相关酶

Key words

alfalfa mosaicvirus / white clover mosaic virus / co-infection / N.benthamiana / disease-resistance related enzymes

植物病毒病害是危害植物的主要病害之一^［1］，当植物受到病毒侵染时，首先会产生不同类型的症状，在植物病毒学研究初期，经常通过用病毒病原接种寄主后，寄主的症状表现来判断植株是否被病毒侵染，苜蓿花叶病毒侵染苜蓿后苜蓿会出现花叶、畸形等症状^［2］，林泽兰（Eupatorium lindleyanum）被烟草曲叶病毒（tobacco leaf curl virus，TLCV）侵染之后表现为黄化症状^［3］。寄主表现症状的原因是病毒粒子在寄主体内的增生，病毒粒子倾向于在系统侵染的寄主植物均匀分布，在这个过程中病毒的基因组和寄主基因组相互对抗^［4］。病毒的这种胁迫影响了寄主植物的生理生化代谢，使植株产生花叶、畸形、矮化等不同症状，同时激活了寄主中抗病相关酶基因，导致抗病相关酶活性发生某些变化^［5］。其中，过氧化物酶（peroxidase，POD）与寄主植物的木质素、酚类物质及植保素的形成有关，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）参与合成细胞壁中的木质素，并且会对光合速率以及总叶绿素含量产生影响^［6］，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是苯丙烷类物质代谢合成黄酮类植保素和木质素的反应中的关键酶，通常与细胞分化和植株防卫反应密切相关。据报道，黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）侵染烟草和玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus，MRDV）侵染玉米后，分别使叶片中PAL活性和，POD、PPO升高^［7-8］。Fridovich的自由基理论认为，植物存在一种可以清除体内多余自由基的膜保护系统，当植物受到病毒侵染后其体内的活性氧含量将会增加^［9］，过氧化氢酶（catalase，CAT）作为重要的内源性活性氧清除剂被启动，可将H₂O₂转化为H₂O和O₂，起着维持植物体内活性氧正常水平的作用^［10］；吴元华等^［11］研究发现接种PVY后烟草中叶片中各种防御酶活性显著升高；因此，植物可以通过调控这些与抗病性相关的酶活性来抵御病毒等病原物的侵染危害。

苜蓿花叶病毒（alfalfa mosaic virus，AMV）隶属于雀麦花叶病毒科（Bromovirus），苜蓿花叶病毒属（Alfamovirus），是一种（+）单链RNA病毒，其寄主范围十分广泛^［2］，能侵染多种重要经济作物和豆科牧草，如烟草、大豆、番茄、西瓜、黄瓜、马铃薯和苜蓿等，主要表现为花叶、斑驳花叶、坏死、褪绿及植株矮化等症状；AMV侵染寄主发病率高，危害严重，其中苜蓿病毒病的发生不仅严重影响了苜蓿干草和种子的产量，而且大大缩短了苜蓿草地的使用年限。白三叶草花叶病毒（white clover mosaic virus，WCMV）隶属马铃薯X病毒属（Potexvirus），是一种（+）单链RNA病毒^［12］，可侵染三叶草、昆诺黎、豇豆、豌豆、菜豆和苜蓿等多种重要的经济作物，引起病毒病的普遍发生，在三叶草上平均发病率为28.14%^［13］，表现为斑驳、花叶、褪绿、枯斑、萎蔫、坏死，且和AMV存在协生作用的复合侵染现象，复合侵染率在50%以上^［14-15］，可使症状表现加重，当AMV和WCMV以3∶1的比例复合侵染本氏烟后，症状表现为严重花叶、大褪绿斑，寄主体内病毒增多^［16］。程守丰等^［17］研究发现由AMV和WCMV复合侵染的3个苜蓿品种叶片中与抗病性相关的PPO、POD和PAL这3种防御酶活性显著升高、叶绿素和可溶性蛋白含量均降低，AMV和WCMV复合侵染苜蓿、三叶草等豆科牧草后，严重影响牧草的生长，使牧草产量降低；岳阳等^［16］研究发现AMV和WCMV以3∶1复合侵染本氏烟后，叶片中水杨酸（salicylic acid，SA）、独脚金内酯（strigolactone，SL）、油菜素内酯（brassinolide，BR）、乙烯（ethylene，ETH）升高，而茉莉酸（jasmonic acid，JA）下降。

而有关AMV和WCMV以3∶1复合接种侵染本氏烟后，是否会引起寄主中抗病相关酶活性的变化以及如何变化等问题尚未进行研究。为此，本试验通过对AMV和WCMV以3∶1混合接种本氏烟后，通过症状观察及病毒检测确定病毒混合接种成功侵染的前提下，分别测定接种侵染后第2、4、6、8、10天时叶片中POD、PAL、PPO和CAT活性，旨在探明AMV和WCMV复合侵染对寄主体内几种抗病相关酶活性的影响，研究结果对进一步揭示AMV和WCMV复合侵染寄主的协生作用致病机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植株

将无毒的本氏烟种子，分别种植于装有灭菌蛭石的塑料花盆中（13 cm×15 cm），置于温度25 ℃、相对湿度50%、光照8 000 lx、时间二段循环16 h / 8 h（L/D）的智能人工气候箱（杭州琦胜电子科技有限公司，QRGN-400-3）中，培养至4~5叶期，备用。

1.1.2 供试病毒和试剂盒

提纯的AMV和WCMV病毒：保存于-80 ℃冰箱中，质量浓度300 pg/mL。

AMV和WCMV DAS-ELISA定量检测试剂盒（double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay）：购自江苏晶美生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒接种及检测

参考岳阳等^［16］的方法进行。将AMV和WCMV按照体积比1∶0、0∶1、3∶1混合，然后各取病毒液1 mL分别加0.02 mol/L PBS缓冲液（pH 7.2）4 mL，稀释成5倍病毒液；从上述种植的本氏烟中选取60 株长势一致、健康的4~5叶期幼苗，设置4个处理：PBS（pH 7.2）、AMV+ WCMV（1∶0）、AMV+ WCMV（0∶1）、AMV+ WCMV（3∶1），每处理摩擦接种15株本氏烟；以接种AMV和WCMV体积比1∶0、0∶1、3∶1混合稀释后的病毒液分别为AMV、WCMV单独侵染处理和两种病毒复合侵染处理；以0.1 mL接种等量的0.02 mol/L PBS缓冲液（pH 7.2）为空白对照处理，做好标记，将上述各处理植株置于智能人工气候箱培养，培养条件与育苗时设置的一致，定时定量浇灌营养液，逐天观察发病情况，并在接种后第2天开始用消毒的剪刀分别剪取不同处理的3株本氏烟叶片，自来水冲洗干净后，去除叶脉，将叶片剪碎混匀，电子天平称取1 g，用锡箔纸包好，做好标记，保存于-80 ℃备用，每个处理重复取样3次；同样，第4、6、8、10天分别从各处理剩下的幼苗中取3株本氏烟，取样方法同上。

采用DAS-ELISA法，检测AMV和WCMV单独接种和混合接种后第10天两种病毒在本氏烟叶片中的含量，检测方法和结果判断按照试剂盒说明进行，将利用全波长酶标仪（美国Biotek公司）在450 nm处测定的各个样品的D 值作为y值，带入AMV含量和WCMV含量标准曲线方程y=226.63x-10.162 （R=0.999 2）和y=145.17x+6.281 3（R=0.992 6）^［16］中，求出y值，再乘以稀释倍数，即为样品中AMV、WCMV含量。

1.2.2 AMV和WCMV复合侵染对本氏烟叶片中过氧化物酶（POD）活性的影响

（1）粗酶液制备^［18］：取上述接种病毒后不同时间采集的、保存于-80 ℃冰箱中、病毒检测呈阳性的本氏烟叶片各1 g，放入冰冻的研钵中，加少许石英砂和0.1 moL/L PBS（pH 6.0）充分研磨匀浆后，倒入容量瓶中用0.1 moL/L PBS（pH 6.0）定容至100 mL；定容后倒入离心管，在4 ℃下4 000 r/min高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）中离心10 min，取上清液作为粗酶液，每个处理重复3次，放入4 ℃冰箱中备用；（2）POD测定反应液制备：向50 mL 0.1 moL/L PBS（pH 6.0）中加入28 μg愈创木酚，加热搅匀冷却后加入19 μL 30% H₂O₂溶液，混匀后制成POD测定反应液备用；（3）酶活性测定：每一个处理取5 mL离心管2只，其中1只离心管中加入3 mL POD测定反应液和1 mL粗酶液，另1只离心管中加3 mL POD测定反应液和1 mL 0.1 moL/L PBS（pH 6.0）作为空白对照，在漩涡混匀器上混匀后，每个处理重复3次，分别加入比色杯中，以空白对照用于UV-9000S紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）在470 nm处调零，然后测定470 nm处的各处理的D值，每隔1 min记录一次，以 1 min内D值降低0.01为一个酶活性单位（U），按照下式计算POD活性。

\mathrm{P}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{活性}(\mathrm{U}/(\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}\cdot \mathrm{g})\mathrm{F}\mathrm{W})=\frac{\mathrm{\Delta }{A}_{\mathrm{470}}\cdot V_T}{\mathrm{0.01}\cdot FW\cdot V_{\mathrm{t}}}

式中：Δ₄₇₀为波长在470 nm下1 min的变化；FW为样品鲜质量（g）；V_T 为提取酶液总体积（mL）；V_t 为测定时用酶液体积（mL）。

1.2.3 AMV和WCMV复合侵染对本氏烟叶片中多酚氧化酶（PPO）活性的影响

（1）粗酶液制备^［19］：将上述接种病毒后不同时间采集的、保存于-80 ℃冰箱中、病毒检测呈阳性的本氏烟叶片各1 g放入冰冻的研钵中，加2 mL 0.01 moL/L PBS（pH6.0）和0.05 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）研磨成匀浆。将匀浆倒入容量瓶中用0.01 moL/L^{PBS（pH6.0）定容至10 mL，定容后倒入离心管，在4 ℃下4 000 r/min离心15 min，取上清液作为粗酶液，保存于4 ℃冰箱中备用；（2）反应液制备：向5 mL离心管中加入2 mL 0.01 moL/L PBS（pH6.0）、1 mL 0.1 moL/L邻苯二酚，混匀后冷藏备用；（3）酶活性测定：每一个处理取5 mL离心管2只，其中1只离心管中加入3 mL反应液和0.2 mL粗酶液，另1只离心管中加3 mL反应液和0.2 mL 0.01 moL/LPBS（pH6.0）作为空白对照，使用漩涡混匀器混匀后，分别加入比色杯中，以空白对照在420 nm处调零，测定各处理在420 nm处的D值，每20 s记录一次D值，共记录5次，每个处理重复测定3次，以1 min内D值降低0.01为一个酶活性单位（U），按下式计算PPO活性。}

\mathrm{P}\mathrm{P}\mathrm{O}\mathrm{活性}(\mathrm{U}/(\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}\cdot \mathrm{g})\mathrm{F}\mathrm{W})=\frac{\mathrm{\Delta }{A}_{\mathrm{420}}}{\mathrm{0.01}FW\cdot \mathrm{t}}

式中：ΔA₄₂₀为420 nm下20 s吸光值变化平均值；FW为样品鲜质量（g）；t为反应时间（min）。

1.2.4 AMV和WCMV复合侵染对本氏烟叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影响

（1）提取缓冲液制备^［20］：将4 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、58 mg EDTA、35 μL β-琉基乙醇加入100 mmoL/L硼酸缓冲液（pH 8.8）中溶解后定容至100 mL，4 ℃下保存备用；（2）粗酶液制备：取上述接种病毒后不同时间采集的、保存于-80℃冰箱中、病毒检测呈阳性的本氏烟叶片各1 g，放入冰冻的研钵中，加入1 mL提取缓冲液研磨成匀浆后，在4 ℃下12 000 r/min离心30 min，取上清液作为粗酶液，保存于4 ℃冰箱中备用；（3）酶活性测定：在离心管中加入3 mL 100 mmoL/L硼酸缓冲液（pH 8.8）和0.5 mL 20 mmoL/L ^{L-苯丙氨酸后，将离心管置于电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械有限公司）中37 ℃下温育10 min后，加入0.5 mL粗酶液，空白对照不加粗酶液，使用漩涡混匀器混匀后37 ℃下温育60 min，分别加入比色杯中，用空白对照在290 nm处调零后，测定各处理在温育60 min前、后的吸光值，以每小时在290 nm处吸光度变化0.01所需酶量为一个酶活单位（U），按下式计算PAL活性。}

\mathrm{P}\mathrm{A}\mathrm{L}\mathrm{活性}(\mathrm{U}/(\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}\cdot \mathrm{g})\mathrm{F}\mathrm{M})=\frac{(D_{\mathrm{1}}-D_{\mathrm{0}})\cdot V_{}}{\mathrm{0.01}\cdot t\cdot V_{\mathrm{1}}\cdot FW}

式中：D₁为反应液温育60 min前的吸光值；D₀为反应液温育60 min后的吸光值；V为样品提取液总体积（mL）；V₁为所取样品提取液体积（mL），t为酶促反应时间（h）；FW为样品质量（g）。

1.2.5 AMV和WCMV复合侵染对本氏烟叶片中过氧化氢酶（CAT）活性的影响

（1）粗酶液制备^［21］：将上述接种病毒后不同时间采集的、保存于-80 ℃冰箱中、病毒检测呈阳性的本氏烟叶片各1 g放入冰冻的研钵中加入少许石英砂和0.05 moL/L^{PBS（pH 7.0）研磨成匀浆，将匀浆倒入容量瓶中用0.05 moL/LPBS（pH 7.0）定容至10 mL，在4 ℃下4 000 r/min离心15 min，取上清液，作为粗酶液，保存于4 ℃冰箱中备用；（2）酶活性测定：依次向5 mL离心管中加入1 mL 0.05 moL/LTris-HCL缓冲液（pH 7.0）、1.7 mL蒸馏水、0.2 mL 0.2 moL/L H₂O₂和0.1 mL粗酶液，以不加酶液的为空白对照，使用漩涡混匀器混匀后，分别加入比色杯中，用空白对照在240 nm处调零后，测定240 nm处各处理的D值，每隔1 min记录一次，以1 min内D值降低0.1为一个酶活性单位（U），按照下式计算CAT活性。}

\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{活性}(\mathrm{U}/(\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}\cdot \mathrm{g})\mathrm{F}\mathrm{W})=\frac{V\mathrm{t}\cdot \mathrm{\Delta }{A}_{\mathrm{420}}}{\mathrm{0.1}\cdot V\mathrm{s}\cdot FW\cdot t}

式中：ΔA₂₄₀为在波长240 nm下1 min吸光值变化；FW为样品鲜质量（g）；t为反应时间（min）；V_t 为酶提取液总体积（mL）；V_s 为测定酶液体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 接种后本氏烟中病毒含量检测及症状表现

采用DAS-ELISA方法检测接种10 d后的本氏烟叶片中AMV、WCMV带毒情况及浓度，结果表明，2种病毒单独接种和混合接种处理的45株幼苗叶片，均表现为AMV和WCMV阳性及AMV或WCMV阳性，带毒检出率均为100%（表1）。AMV和WCMV混合接种10 d后本氏烟叶片中AMV和WCMV浓度分别为958.85和579.75 pg/mL，相较于AMV和WCMV单独接种叶片中病毒浓度均显著提高，分别提高了69.86%和52.21%（表1）。

AMV和WCMV混合接种和单独接种10 d后，本氏烟叶片均有发病症状，其中2种病毒混合接种本氏烟叶片后症状最明显，出现了严重花叶、明脉的症状（图1-A）； AMV单独侵染后本氏烟叶片出现斑驳花叶、明脉症状（图1-B）；WCMV单独侵染后本氏烟叶片则出现轻花叶症状（图1-C）；对照（CK）表现健康、无症状（图1-D）。

2.2 AMV和WCMV复合侵染对本氏烟叶片中POD活性影响

由图2可知，AMV和WCMV复合侵染后，本氏烟中的POD活性显著增加，明显高于CK、AMV、WCMV单独侵染，POD活性呈现出先升高后降低的趋势，在复合侵染第6天时达到了最大值，为112.10 U/（min·g），分别比健康植株（CK）、AMV、WCMV单独侵染的POD活性提高了305.12%、45.23%、52.56%；方差分析表明，在接种后相同时间，两种病毒复合侵染的本氏烟叶片中POD活性分别与健康植株（CK）、两种病毒单独侵染的POD活性之间存在极显著差异；同时，AMV、WCMV单独侵染的本氏烟叶片中POD活性也呈现先升高后降低的趋势，在接种后同一时间，均高于CK、低于AMV和WCMV复合侵染的酶活性，在接种后第6、8天两种病毒单独侵染的酶活性之间差异极显著，其余3 d差异不显著，但是均和对照的酶活性之间差异极显著。

2.3 AMV和WCMV复合侵染对本氏烟叶片中PPO活性影响

由图3可以看出，AMV和WCMV复合侵染后，本氏烟中PPO活性显著增加，明显高于CK、AMV、WCMV单独侵染，且呈现出先升高后降低的趋势，在复合侵染第4天时达到了最大值，为（8.77±0.29） U/（min·g），分别比健康植株（CK）、AMV、WCMV单独侵染的PPO活性提高了249.40%、63.01%、50.69%；经方差分析表明在接种后相同时间，两种病毒复合侵染的本氏烟叶片中PPO活性分别与健康植株（CK）、AMV、WCMV单独侵染的PPO活性之间存在极显著差异，同时，AMV、WCMV单独侵染的本氏烟叶片中PPO活性也呈现先升高后降低的趋势，在接种后相同时间，高于CK、低于AMV和WCMV复合侵染的活性，在接种后第2、4、6、8天两种病毒单独侵染的酶活性之间差异极显著，第10天差异不显著，但是均和对照间差异极显著。

2.4 AMV和WCMV复合侵染对本氏烟叶片中PAL活性影响

由图4可知，AMV和WCMV复合侵染后，本氏烟中PAL活性显著增加，明显高于CK、AMV、WCMV单独侵染，且呈现出先升高后降低的趋势，PAL活性在复合侵染第4天时达到了最大值，为15.42 U/（min·g），分别比健康（CK）植株、AMV、WCMV单独侵染的PAL活性提高了275.18%、48.84%、36.58%；方差分析表明接种后相同时间，两种病毒复合侵染的本氏烟叶片中PAL活性分别与健康植株（CK）、两种病毒单独侵染的PAL活性之间存在极显著差异。同时，AMV、WCMV单独侵染的本氏烟叶片中PAL活性也呈现先升高后降低的趋势，在接种后相同时间，高于CK、低于AMV和WCMV复合侵染的酶活性，在接种后第4、6天两种病毒单独侵染的酶活性之间差异极显著，其余3 d差异不显著，但是均和对照间差异极显著。

2.5 AMV和WCMV复合侵染对本氏烟叶片中CAT活性影响

由图5可知，AMV和WCMV复合侵染后，本氏烟中CAT活性显著增加，明显高于CK、AMV、WCMV单独侵染，且先急速升高后迅速降低，第4~6天时CAT活性缓慢上升，到第8天时CAT活性趋于平稳，在复合侵染后第2天时达到了最大值，为（117.14±1.28） U/（min·g），分别比健康（CK）植株、AMV、WCMV单独侵染的CAT活性提高了215.32%、40.81%、61.13%；方差分析表明接种后相同时间，两种病毒复合侵染的本氏烟叶片中CAT活性分别与健康植株（CK）、两种病毒单独侵染的CAT活性之间存在极显著差异。同时，AMV、WCMV单独侵染的本氏烟叶片中CAT活性也呈现急速升高后缓慢降低的趋势，在接种后相同时间，高于CK、低于AMV和WCMV复合侵染的酶活性，在接种后第2、4、6、8天两种病毒单独侵染的酶活性之间差异极显著，第10天差异不显著，但是均和对照的酶活性之间差异极显著。

3 讨论与结论

据报道，当植物受到逆境胁迫时，会产生对许多生物大分子有破坏作用的活性氧，过量的活性氧积累会破坏植物细胞膜，而CAT和POD是细胞内活性氧代谢调节酶^［22］，主要起到清除细胞内高浓度H₂O₂和防止植物细胞被水解的作用^［23］，PPO可通过合成醌类化合物从而阻止病毒入侵^［24-25］，PAL在植物产生木质素、酚类、类黄酮类等次生物质的过程中扮演着重要角色^［26］。通过症状观察结合DAS-ELISA检测AMV和WCMV（3∶1）混合接种和单独接种本氏烟10 d后叶片中病毒含量，发现混合接种和单独接种的45株本氏烟全部发病，且病毒检测为阳性；对混合接种复合侵染后不同时间本氏烟叶片中抗病相关酶活性测定发现，AMV和WCMV（3∶1）混合接种的本氏烟叶片中POD、PPO、PAL和CAT活性显著增加，明显高于单独接种AMV、WCMV和CK，随着时间延长POD、PPO、PAL活性均呈现出先升高后降低的趋势，而CAT活性在复合侵染第2天时急速升高，然后降低，在第4天时呈现出缓慢上升最后逐渐平稳的趋势，而且在AMV和WCMV（3∶1）复合侵染的本氏烟叶片中POD、PPO、PAL和CAT活性分别在第6、4、4、2天达到最大值，为112.10、8.77、15.42、117.14 U/（min·g），显著高于单独接种AMV、WCMV和健康植株（CK）。

植物在受病毒侵染初期体内会产生一系列复杂的新陈代谢过程，这些过程是基于病毒侵染寄主后打破了寄主体内处于平衡状态的保护酶系统，从而使抗病相关酶活性发生改变^［27］。有研究表明，病毒侵染可使抗病相关酶活性上升，刘学辉等^［28］研究发现，当番茄斑萎病毒侵染百宜辣椒、遵义朝天椒和茄门甜椒后，植株体内POD、PAL、PPO 3种抗病相关酶活性均显著高于未接病毒的健康植株，且3种抗病相关酶活性都呈现出先升高再降低的趋势，最高点出现的时间皆在接种病毒后10 d以内；杨立均等^［29］在研究烟草对烟草花叶病毒的早期防御反应时发现，烟草受病毒侵染后，体内POD、PAL分别在24、12 h达到峰值，随后其酶活性呈逐渐降低的趋势；番木瓜环斑型花叶病毒在侵染不同品种的番木瓜时，其叶片中POD和PPO酶均呈现先升高后降低的趋势，且抗病品种达到峰值时其酶活性远高于感病品种，证明了抗病品种对病毒干扰具有更敏锐的应激反应能力^［30］。本试验也发现在AMV和WCMV（3∶1）复合侵染和两种病毒单独侵染的本氏烟叶片中除了CAT活性在接种后第2天出现显著升高、然后降低再升高的变化趋势外，其余3种酶活性均出现先升高再降低的趋势，只是它们出现峰值的时间不一致，除了PAL为4 d，PPO、POD为6 d，进一步表明4种酶的防病机理不同；而且AMV和WCMV（3∶1）复合侵染可加重病害发生，在与本氏烟互作中，使本氏烟中抗病相关酶被激活，与两种病毒单独侵染相比活性显著升高，为了应对和减轻AMV+WCMV两种病毒复合侵染对它的损伤，本氏烟体内防反应的信号相较于单独侵染更强，致使与抗病反应相关的酶活性增加更为明显^［31］；CAT活性在混合接种复合侵染第4天后缓慢升高的变化趋势与蔚丽珍等^［32］研究认为的黑腐病菌侵染大白菜幼苗叶片时CAT 缓慢升高的变化趋势相一致，至于接种后第2天CAT活性显著增高的原因可能与病毒摩擦接种时加入了金刚砂，对植物叶片造成了损伤有关，有关这个问题以及AMV、WCMV复合侵染后本氏烟中H₂O₂、活性氧的积累和醌类、木质素、酚类、类黄酮等与抗病性相关的化合物的产生等问题尚未涉及，还有待进一步的研究。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31860039)