单宁酸对豌豆蚜细胞色素P450和谷胱甘肽S-转移酶基因表达的影响

Effect of tannic acid on cytochrome P450 and glutathione S-transferase gene expression in Acyrthosiphon pisum

摘要

目的 明确豌豆蚜（Acyrthosiphonpisum）细胞色素P450酶（CYP450）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因在转录水平对植物次生代谢物质单宁酸的响应，为探索CYP450基因和GST基因在豌豆蚜代谢单宁酸中的功能提供前期基础。 方法 采用荧光定量PCR技术，分析了单宁酸处理下豌豆蚜CYP450基因和GST基因的转录变化。 结果 经单宁酸处理后，豌豆蚜多个CYP450基因和GST基因的转录水平都表现出显著上调。其中，CYP450基因CYP4C107、CYP6K109、CYP6A1302、CYP303A1和CYP3077A1分别显著上调1.88、1.67、2.37、2.81和4.46倍；GST基因GST104、GST105、GST108和GST109分别显著上调1.42、2.07、4.89和1.41倍，GSTx1、GSTx4和GSTx6分别显著上调1.77、1.33和1.62倍，GSTm、GSTt、GSTcd和GSTd702分别显著上调1.60、1.44、1.40和4.27倍。 结论 CYP450基因和GST基因可能在豌豆蚜代谢单宁酸中发挥重要的作用。

Abstract

Objective To determine the response of detoxification enzyme genes in A.pisum to tannic acid，which is a plant secondary metabolite，to provide some data to explore the functions of CYP450 and GST genes in tannic acid metabolism in A.pisum. Method The cytochrome P450 （CYP450） and glutathione S-transferases （GSTs） genes in pea aphids were measured by RT-qPCR after feeding on Vicia faba treated with tannic acid. Result The expression of CYP450 and GST genes in A.pisum was significantly up-regulated after treatment with tannic acid.CYP4C107，CYP6K109，CYP6A1302，CYP303A1 and CYP3077A1 were dramatically up-regulated by 1.88-，1.67-，2.37-，2.81- and 4.46-fold，respectively.In addition，GST104，GST105，GST108 and GST109 were up-regulated 1.42-，2.07-，4.89- and 1.41-fold，respectively.In addition，GSTx1，GSTx4 and GSTx6 were up-regulated 1.77-，1.33- and 1.62-fold，respectively.GSTm，GSTt，GSTcd and GSTd702 were up-regulated 1.60-，1.44-，1.40- and 4.27-fold，respectively. Conclusion The CYP450 and GST genes may play an important role in the metabolism of tannic acid in A.pisum.

Graphical abstract

关键词

豌豆蚜 / P450 / GST / 基因表达 / 植物次生代谢物

Key words

Acyrthosiphon pisum / P450 / GST / transcriptional expression / plant secondary metabolites

豌豆蚜Acyrthosiphonpisum属半翅目（Hemiptera）蚜科（Aphididae），以植物的韧皮部汁液为食，传播多种植物病毒病，具有发育历期较短、世代重叠严重、生殖期长等特点，已成为危害苜蓿、蚕豆、豌豆生长最严重的害虫之一^［1］。杀虫剂目前仍是防治蚜虫最常见和有效的方法，但是大量和频繁使用杀虫剂不仅难以取得理想的控制效果，而且易引发昆虫抗性、农药残留和环境污染以及食品安全等一系列问题。植物次生物质在抵御植食性昆虫的取食中发挥重要作用^［2］，其不仅影响昆虫对寄主植物的选择、取食和利用，而且对昆虫的行为及生长发育等方面造成很多不利影响，甚至造成毒杀作用^［3-4］。酚类物质是植物的重要次生代谢物之一，其中主要有单宁酸、黄酮类、木质素等^［5］，可抑制昆虫的取食^［6］。如路康等^［7］研究表明儿茶酚、香豆素植物次生物质对豌豆蚜生长发育具有显著抑制作用。

单宁酸（tannins acid）广泛存在于苜蓿、蚕豆、豌豆等植物体内^［8］，其不仅能够防御植食性昆虫的取食，而且能够抑制昆虫的生长发育^［9-10］。然而研究表明，紫花苜蓿中单宁酸的提取量为2.15 mg/g^［11］，豌豆蚜却可以正常取食含有单宁酸的苜蓿植株^［12-13］，且豌豆蚜取食含有单宁酸的人工饲料后，虽生长发育、繁殖及存活受到抑制，但引起的死亡率较低^［14］，表明豌豆蚜对单宁酸具有一定的解毒代谢能力。

植食性昆虫已经进化出多种复杂的抵抗机制，对植物次生物质进行代谢转运，昆虫体内代谢外源物质的酶主要包括细胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450）、羧酸酯酶（carboxylesterases，CarE）、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases，GST）和UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGT）等^［15］。研究表明，昆虫CYP450基因和GST基因的转录水平响应植物次生物质的处理，参与了昆虫对植物次生物质的代谢^［16］。Wang等通过RNA干扰降低斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫CYP6AB14的转录，导致取食含有香豆素和黄酮的人工饲料的幼虫发育异常，死亡率升高^［17］。RNA干扰CYP6AE14、CYP4L11和CYP6AB9基因的表达，显著增加棉酚对棉铃虫幼虫的毒性^［18-19］，表明这3个细胞色素P450酶基因均参与了棉铃虫对棉酚的代谢。Pan等^［20］证实，干扰CYP6CY3和CYP6CY4的表达，显著增加了烟碱对烟蚜Myzus persicae nicotianae的毒性。双链RNA降低斜纹夜蛾中肠和脂肪体中CYP6AB60的转录水平后，植物次生代谢物质对幼虫生长的抑制作用明显提高^［21］。以上研究均表明细胞色素P450酶基因在昆虫对外源化合物的代谢中具有重要的作用。此外，GST基因在昆虫代谢植物次生物质的过程中同样发挥着关键的作用。例如，沉默褐飞虱Nilaparvata lugens的GST基因NlGSTD1和NlGSTE1，导致取食阿魏酸的褐飞虱若虫死亡率升高^［20］。降低褐飞虱谷胱甘肽S-转移酶基因NlGST1-1转录水平，导致褐飞虱对含有芦竹碱的饲料更加敏感^［22］。进一步转基因研究表明，降低褐飞虱NlGST1-1的转录水平后，若虫的相对增长率和雌虫繁殖力降低^［23］。RNA干扰降低GSTS1的表达，会引起番茄碱对斜纹夜蛾幼虫的毒性增加^［24］。综上所述，CYP450基因和GST基因在昆虫对植物次生物质解毒代谢过程中发挥着重要的作用。

因此，本研究对豌豆蚜CYP450基因和GST基因响应单宁酸处理后转录水平如何变化这一关键问题展开研究，通过利用植物介导单宁酸处理豌豆蚜，使用荧光定量PCR技术明确单宁酸处理后细胞色素P450酶基因和谷胱甘肽S-转移酶基因的转录水平，以期为揭示豌豆蚜耐受单宁酸的分子机理提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试昆虫：豌豆蚜由昆虫生态实验室提供；以单头豌豆蚜在室内盆栽蚕豆上饲养建立种群，豌豆蚜与蚕豆植株均放置在人工气候箱（温度：（24±1）℃，相对湿度：（70±5）%，光周期：16 L∶8 D）内培养。

挑选上述豌豆蚜置于脱脂棉保湿的离体蚕豆叶片上于人工气候箱下饲养12 h，待其产蚜后，剔除成蚜，保留若蚜，待若蚜发育至3龄，用单宁酸处理。

接种处理及样品采集：将蚕豆切苗置于装有1 000 μL单宁酸（1 g/L）的1.5 mL离心管中，然后将3龄若蚜挑取至蚕豆苗上。通过植物介导的方式使豌豆蚜摄入单宁酸72 h后，收集蚜虫，以清水为对照。每个处理30头蚜虫，共3个重复。样品经液氮处理后保存于-80 ℃，以备总RNA提取。

1.2 主要仪器

试验所用仪器见表1。

1.3 主要试剂

试验所用试剂见表2。

1.4 总RNA提取及cDNA合成

参照Trizol使用说明书提取豌豆蚜总RNA，使用超微量分光光度计测定其浓度和纯度，利用RQ1 RNase-Free DNase kit （Promega，USA）试剂盒去除基因组，然后用Prime Script™ RT （TaKaRa，China）和1 μg总RNA按照使用说明合成cDNA第1条链，详细反应体系如下。

1） 去基因组

在200 μL无核酶的PCR管中配制如表3的混合液；将上述混合液置于PCR仪中，37 ℃孵育30 min；然后加入1 μL stop solution，65 ℃ 10 min；将去除基因组DNA的RNA置于-80 ℃冰箱中保存备用。

2） 反转录如表4配制反应混合液。混匀后短暂离心，置于PCR仪中37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反应完后加20 μL无核酶水稀释，震荡混匀离心。取2 μL检测浓度，置于-20 ℃保存。

1.5 引物的设计与合成

根据NCBI数据库中豌豆蚜P450s酶和谷胱甘肽S-转移酶基因序列，利用primer 5.0设计qPCR引物，其由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息参照王文军^［25］。

1.6 RT-qPCR检测

采用RT-qPCR方法，选用Novo Start^® SYBR qPCR Super Mix Plus reaction kit （Novoprotein，China）试剂盒，检测靶基因P450s和GSTs在豌豆蚜体内的表达量，以EF-1α为内参，反应体系如表5。

以上反应液混匀之后，短暂离心，然后用于定量PCR仪中的程序反应。RT-qPCR反应程序：95 °C 2 min，40个循环（95 °C 15 s，60 °C 30 s）。

采用荧光定量PCR技术检测P450s与GSTs对单宁酸的表达动态。每个样品设置4个重复，RT-qPCR结果采用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.7 数据分析

使用Excel 2016软件对数据进行整理。利用SPSS 22.0软件对基因表达量的差异进行显著性检验，方法为Student氏t检验法。

2 结果与分析

2.1 单宁酸处理后豌豆蚜体内细胞色素P450基因的转录模式

对豌豆蚜基因组中51个细胞色素P450基因响应单宁酸处理的转录水平进行定量分析。结果表明，经单宁酸处理后，豌豆蚜不同细胞色素P450基因家族中均有基因的转录水平发生变化。其中，CYP4家族中，CYP4C101、CYP4C1021和CYP4C1504显著下调，CYP4C107显著上调1.88倍（P<0.01，图1）。CYP6A家族中，CYP6A1304和CYP6A1403显著下调，CYP6A1302显著上调2.37倍（P<0.05，图2）。CYP6K家族中，CYP6K109显著上调1.67倍（P<0.01，图3）。其余家族中，CYP314A101、CYP353D1和CYP306A1显著下调，CYP303A1和CYP3077A1分别显著上调2.81和4.46倍（P<0.01，图4）。此外，豌豆蚜CYP315A1上调虽未达到显著水平，但其上调了27.59倍。以上结果表明单宁酸可诱导豌豆蚜多个细胞色素P450酶基因的表达。

2.2 单宁酸处理后豌豆蚜体内谷胱甘肽S-转移酶基因的转录模式

对豌豆蚜基因组中19个谷胱甘肽S-转移酶基因响应单宁酸处理的转录水平进行定量分析。结果表明，单宁酸处理后，豌豆蚜谷胱甘肽S-转移酶基因GST1家族中，GST104、GST105、GST108和GST109分别显著上调1.42（P<0.05）、2.07（P<0.05）、4.89（P<0.01）和1.41倍（P<0.05），GST101显著下调（图5）。GSTx家族中，GSTx1、GSTx4和GSTx6分别显著上调1.77（P<0.05）、1.33（P<0.01）和1.62倍（P<0.05，图6）。GST其他家族中，GSTm、GSTt、GSTcd和GSTd702分别显著上调1.60（P<0.01）、1.44（P<0.01）、1.40（P<0.05）和4.27倍（P<0.05），GSTd6显著下调（图7）。表明多个谷胱甘肽S-转移酶基因响应单宁酸的诱导。

3 讨论

在长期协同进化的过程中，植物通过产生多种次生代谢物质以抵御植食性昆虫的取食。昆虫为了适应这些植物次生代谢物质，会通过多种途径对这些物质进行代谢，如通过增加体内解毒酶基因的转录水平以增加解毒酶的活性，进而加强对外源物质的代谢。而且许多研究发现，代谢植物次生物质的P450酶一般处于不表达或极低水平表达，但能被一个或者有限数量的植物次生物质在一定范围内强烈诱导。如广食性美洲虎纹凤蝶CYP6B4本底转录水平很难检测，但能被花椒毒素诱导312倍^［26］。在茄科专食性昆虫烟草天蛾中，当幼虫开始饲喂烟草，尼古丁的毒性会阻止它们继续取食，直到其体内的P450酶被诱导并开始代谢这些有毒物质^［27］。因此，这种诱导作用，増强了昆虫对植物次生物质的抵御能力。

研究证实，CYP6家族响应植物次生物质的诱导，Huang等人发现亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus细胞色素P450酶的活性和CYP6K1基因的表达量与植物次生化合物的含量呈正相关^［16］。棉铃虫CYP6AE14和CYP6B7的表达^［28］与美洲棉铃虫Helicoverpa zea中CYP6B8的转录本^［29-30］均可以被花椒毒素诱导。取食含有番茄素的人工饲料后，斜纹夜蛾与棉铃虫中CYP6AB60和CYP6B7的转录水平分别显著增加^［28］。本研究通过对豌豆蚜基因组中51个细胞色素P450酶基因响应单宁酸处理的转录水平进行定量分析发现，单宁酸处理后，豌豆蚜体内多个细胞色素P450酶基因的转录水平出现了显著上调。其中CYP6家族中CYP6K109和CYP6A1302显著上调。Zhang等人研究表明棉铃虫CYP315A1基因可被2-十三烷酮显著诱导^［31］。本研究同样发现豌豆蚜CYP315A1的转录水平在单宁酸处理后上调。此外，豌豆蚜CYP4C107和CYP303A1的表达量也被单宁酸诱导，这些上调的细胞色素P450酶基因可能参与了豌豆蚜对单宁酸的代谢。然而，有研究发现，单宁酸处理棉蚜后，引起CYP4CJ1、CYP6CY19、CYP6CY22和CYP6DA1等多个细胞色素P450酶基因上调表达^{［15，32-33］}，而且降低CYP4CJ1的表达，会增加棉蚜对单宁酸的敏感性^［34］。这可能是由于物种不同，豌豆蚜响应单宁酸的细胞色素P450酶基因与棉蚜不同。

昆虫谷胱甘肽S-转移酶基因的转录也同样受到植物次生代谢物质的诱导。如，取食含有番茄碱的人工饲料后，斜纹夜蛾8个GST基因被上调^［24］；取食含有花椒毒素或单宁酸的人工饲料后，斜纹夜蛾SlGSTE1的转录水平显著上调^［35-36］，芥菜或含有吲哚-3-甲醇和烯丙基异硫氰酸酯等人工饲料同样可以诱导斜纹夜蛾SlGSTE1的转录水平上调。抑制幼虫SlGSTE1的转录后，幼虫的增长率和摄食率降低^［36］。本研究结果显示，单宁酸处理后，豌豆蚜GST104、GST105、GST108、GST109、GSTx1、GSTx4、GSTx6、GSTm、GSTt、GSTcd和GSTd702等11个谷胱甘肽S-转移酶基因显著上调。Tang等人发现，取食添加单宁酸的人工饲料后，杨小舟蛾Micromelalopha troglodytaGST基因GSTd2、GSTo1、GSTs1、GSTt1和GSTz1的mRNA水平被显著诱导^［37］。表明谷胱甘肽S-转移酶基因可能在豌豆蚜代谢单宁酸的过程中发挥着更加重要的作用，也可能与昆虫体内产生的活性氧有关^［38］，这些推测还有待进一步的研究。

4 结论

本研究通过荧光定量PCR方法明确了单宁酸处理下豌豆蚜细胞色素P450基因与谷胱甘肽S-转移酶基因的转录水平，为进一步解析CYP450基因和GST基因在豌豆蚜代谢单宁酸中的功能提供了前期基础数据。

参考文献

[1] 马亚玲，刘长仲.蚜虫的生态学特性及其防治［J］.草业科学，2014，31（3）：519-525.

[2] Cui S， Wang L， Ma L，et al.P450-mediated detoxification of botanicals in insects［J］.Phytoparasitica，2016，44（5）：585-599.

[3] 陈澄宇，康志娇，史雪岩，等.昆虫对植物次生物质的代谢适应机制及其对昆虫抗药性的意义［J］.昆虫学报，2015，58（10）：1126-1139.

[4] 黄训兵.亚洲小车蝗食物适应机制研究［D］.北京：中国农业科学院，2018.

[5] Balasundram N， Sundram K， Samman S.Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products：Antioxidant activity，occurrence，and potential uses［J］.Food Chemistry，2006，99（1）：191-203.

[6] 陈巨莲，倪汉祥，孙京瑞.主要次生物质对麦蚜的抗性阈值及交互作用［J］.植物保护学报，2002，29（1）：7-12.

[7] 路康，王森山.儿茶酚、香豆素对豌豆蚜生长发育及繁殖的影响［J］.草地学报，2019，27（1）：145-152.

[8] Macauley B J， Fox L R.Variation in total phenols and condensed tannins in Eucalyptus：leaf phenology and insect grazing［J］.Austral Ecology，2010，5（1）：31-35.

[9] 刘伟，薛超彬，张静静，等.单宁酸对甜菜夜蛾幼虫生长发育及酚氧化酶活性的抑制作用［J］.植物资源与环境学报，2010，19（1）：32-37.

[10] 王予彤，越慧芳，王晓丽，等.外源茉莉酸诱导的青杨生化抗性及其对舞毒蛾幼虫食物利用的影响［J］.昆虫学报，2015，58（6）：673-679.

[11] 张纵圆，李茂华，张涛.新疆紫花苜蓿单宁提取工艺优化探讨［J］.生物技术，2009，19（1）：61-63.

[12] 达丽婷.不同苜蓿品种对豌豆蚜消化吸收的影响［D］.兰州：甘肃农业大学，2015.

[13] 张洪英.苜蓿品种对豌豆蚜抗性及其机理研究［D］.银川：宁夏大学，2015.

[14] 邵娅，王森山，叶超.单宁酸对红、绿色型豌豆蚜生长发育及繁殖的影响［J］.草地学报，2017，25（4）：866-870.

[15] Ma K， Tang Q， Liang P，et al.Toxicity and sublethal effects of two plant allelochemicals on the demographical traits of cotton aphid，Aphis gossypii Glover （Hemiptera：Aphididae）［J］.PLoS ONE，2019，14（11）：e0221646.

[16] Huang X， Ma J， Qin X，et al.Biology，physiology and gene expression of grasshopper Oedaleus asiaticus exposed to diet stress from plant secondary compounds［J］.Scientific Reports，2017，7（1）：8655.

[17] Wang R L， Xia Q Q， Baerson S R，et al.A novel cytochrome P450 CYP6AB14 gene in Spodoptera litura （Lepidoptera：Noctuidae） and its potential role in plant allelochemical detoxification［J］.Journal of Insect Physiology，2015，75：54-62.

[18] Jin M， Liao C， Fu X，et al.Adaptive regulation of detoxification enzymes in Helicoverpa armigera to different host plants［J］.Insect Molecular Biology，2019，28（5）：628-636.

[19] Mao Y B， Cai W J， Wang J W，et al.Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol［J］.Nature biotechnology，2007，25（11）：1307-1313.

[20] Yang J， Yan S Y， Pan W J，et al.Interaction of ferulic acid with glutathione S-transferase and carboxylesterase genes in the brown planthopper，Nilaparvata lugens ［J］.Journal of Chemical Ecology，2017，43（7）：693-702.

[21] Sun Z， Shi Q， Li Q，et al.Identification of a cytochrome P450 CYP6AB60 gene associated with tolerance to multi-plant allelochemicals from a polyphagous caterpillar tobacco cutworm （Spodoptera litura）［J］.Pesticide Biochemistry & Physiology，2018，154：60-66.

[22] Ali M S， Iwanaga M， Kawasaki H.Ecdysone-responsive transcriptional regulation determines the temporal expression of cuticular protein genes in wing discs of Bombyx mori ［J］.Gene，2013，512（2）：337-347.

[23] Yang J， Sun X Q， Zhu-Salzman K，et al.Host-induced gene silencing of brown planthopper glutathione S-transferase gene enhances rice resistance to sap-sucking insect pests［J］.Journal of Pest Science，2021，94（3）：769-781.

[24] Li Q， Sun Z， Shi Q，et al.RNA-Seq analyses of midgut and fat body tissues reveal the molecular mechanism underlying Spodoptera litura resistance to tomatine［J］.Frontiers in Physiology，2019，10：8-11.

[25] 王文军.芥子油苷对豌豆蚜细胞色素P450s和谷胱甘肽S-转移酶诱导表达的影响［D］.兰州：甘肃农业大学，2021.

[26] Li W， Petersen R A. CYP6B cytochrome p450 monooxygenases from Papilio canadensis and Papilio glaucus：potential contributions of sequence divergence to host plant associations［J］.Insect Molecular Biology，2010，11（6）：543-551.

[27] 李芬.棉蚜细胞色素P450基因应答植物次生物质的转录调控［D］.北京：中国农业大学，2019.

[28] Sita T，Manamohan，et al.Cytochrome P450 isoforms transcriptional，larval growth and development responses to host allelochemicals in the generalist herbivore，Helicoverpa armigera （Hubner） （Lepidoptera：Noctuidae）［J］.Current Science：A Fortnightly Journal of Research，2016，111（5）：901-906.

[29] Sasabe M， Wen Z， Berenbaum M R，et al.Molecular analysis of CYP321A1，a novel cytochrome P450 involved in metabolism of plant allelochemicals （furanocoumarins） and insecticides （cypermethrin） in Helicoverpa zea ［J］.Gene，2004，338（2）：163-175.

[30] Zeng R S， Wen Z， Niu G，et al.Allelochemical induction of cytochrome P450 monooxygenases and amelioration of xenobiotic toxicity in Helicoverpa zea ［J］.Journal of Chemical Ecology，2007，33（3）：449-461.

[31] Zhang L， Lu Y， Xiang M，et al.The retardant effect of 2-Tridecanone，mediated by Cytochrome P450，on the Development of Cotton bollworm，Helicoverpa armigera ［J］.Bmc Genomics，2016，17（1）：954.

[32] Li F， Ma K S， Liang P Z，et al.Transcriptional responses of detoxification genes to four plant allelochemicals in Aphis gossypii ［J］.Journal of Economic Entomology，2017（2）：624-631.

[33] Li F， Ma K， Chen X，et al.The regulation of three new members of the cytochrome P450 CYP6 family and their promoters in the cotton aphid Aphis gossypii by plant allelochemicals［J］.Pest Management Science，2018，75（1）：152-159.

[34] Ma K， Li F， Tang Q，et al.CYP4CJ1-mediated gossypol and tannic acid tolerance in Aphis gossypii Glover［J］.Chemosphere，2019，219：961-970.

[35] 黄敏燕，李雪峰.植物次生物质对斜纹夜蛾解毒酶活性的影响［J］.基因组学与应用生物学，2018，37（8）：3495-3502.

[36] Zou X P， Xu Z B， Zou H W，et al.Glutathione S-transferase SlGSTE1 in Spodoptera litura may be associated with feeding adaptation of host plants［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2016，70：32-43.

[37] Tang F， Tu H， Shang Q，et al.Molecular cloning and characterization of five glutathione S-transferase genes and promoters from Micromelalopha troglodyta（Graeser） （Lepidoptera：Notodontidae） and their response to tannic acid stress［J］.Insects，2020，11（6）：339-346.

[38] Liu S， Cao Y， Zhang Y X，et al.Molecular characterization of a delta class glutathione S-transferase gene from the black cutworm Agrotis ipsilon ［J］.Journal of Asia-Pacific Entomology，2017，20（4）：1175-1182.

基金资助

国家自然科学基金项目(31260442)

甘肃省自然科学基金项目(20JR5RA028)