黑果枸杞体外模拟消化及抗氧化研究

In vitro simulation of digestion and antioxidant properties of Lycium ruthenicum

摘要

目的 以黑果枸杞为研究对象，对其进行体外模拟胃肠消化，探讨消化过程中黑果枸杞活性成分和抗氧化性的变化。 方法 采用紫外分光度计对黑果枸杞花色苷、黄酮、多酚含量和抗氧化指标DPPH、ABTS自由基清除率进行测定。 结果 在体外模拟胃、肠消化3 h的过程中，黑果枸杞花色苷分别降低了1.971 mg/g和8.315 mg/g；体外消化2 h时多酚含量分别上升了4.431 mg/g和1.480 mg/g；胃消化使黄酮含量下降5.842 mg/g，而肠消化2 h黄酮含量达到最高值6.004 mg/g。胃、肠体外模拟消化阶段，DPPH自由基清除率分别下降了16.48%和4.99%，ABTS自由基清除率分别下降了8.64%和12.1%。 结论 花色苷、黄酮、多酚含量的变化对抗氧化性有一定作用。

Abstract

Objective The study aimed to investigate the changes in active ingredients and antioxidant properties during the digestion process of Lycium ruthenicum by simulating in vitro gastrointestinal digestion. Method The content of anthocyanosides,flavonoids，polyphenols，the antioxidant indexes DPPH and ABTS free radical scavenging rate were measured by ultraviolet spectrophotometer. Result During the process of in vitro simulation of gastrointestinal digestion lasting for 3 hours，the anthocyanin content in L.ruthenicum decreased by 1.971 mg/g and 8.315 mg/g,respectively;the content of polyphenols increased by 4.431 mg/g and 1.480 mg/g respectively at 2 h after in vitro digestion; gastrointestinal digestion decreased flavonoids content by 5.842 mg/g;the content of flavonoids decreased by 5.842 mg/g after gastric digestion,and reached the highest value of 6.004 mg/g after intestinal digestion for 2 hours.The scavenging rate of DPPH and ABTS decreased by 16.48% and 4.99%,8.64% and 12.1%,respectively during the process of in vitro simulation of gastrointestinal digestion. Conclusion The changes of anthocyanin, flavonoid and polyphenol contents had a certain effect on antioxidation.

Graphical abstract

关键词

黑果枸杞 / 体外模拟消化 / 活性成分 / 抗氧化性

Key words

Lycium ruthenicum Murr. / in vitro simulated digestion / active ingredients / antioxidant properties

当前快节奏生活导致亚健康人群逐渐增多^［1］，人在正常的情况下自身对氧化与抗氧化具有一定的平衡能力，当体内过多的活性氧自由基无法及时清除时，会使细胞膜受到破坏、蛋白质变性、DNA受损，导致各种疾病的发生，使人体处于亚健康状态，从而加速器官的老化^［2］，必须通过补充抗氧化物质来清除体内过剩的自由基，减轻氧化损伤，从而使人体维持健康的状态。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科（Solanceae）枸杞属（Lycium L.）多年生多棘刺灌木，主产于我国西部内陆干旱地区，其含有丰富的天然花色苷、黄酮、多酚等，素有“原花色苷”之王之称^［3］。古代医书《四部医典》《晶珠本草》《维吾尔药志》对黑枸杞的药用价值均有记载，具有抗疲劳、抗氧化、保护视力、缓解视疲劳以及预防慢性疾病的作用^［4-5］，黑果枸杞在医学和食品工业中已有广泛应用，成为功能食品开发的热点^［6］。有研究通过半乳糖果蝇衰老模型，发现黑果枸杞花色苷可以延长果蝇寿命，具有延缓衰老的作用^［7］，有学者对黑果枸杞黄酮含量进行了测定，通过高脂血症模型得出黄酮具有较强的抗氧化和降血脂功能^［5］。

模拟胃肠消化法较真实地模拟了食物在人体内胃肠道消化过程中的pH值和酶环境的变化，已广泛应用于食品、药物在人体消化过程中其含量、性质的变化研究^［8］。在人体消化系统中，食物可能会发生转化、降解、不完全释放等反应，从而影响食物的功效性^［9］。Burgos-Edwards等^［10］和王月华等^［11］分别对南美洲的一种小浆果和蓝靛果进行体外模拟胃肠消化研究，发现模拟消化后可显著降低花色苷含量。Bouayed和Tagliazucchi对苹果和葡萄进行体外消化模拟，发现总多酚和类黄酮在模拟胃液中均被释放^［12］，向卓亚等^［13］在藜麦体外消化中发现抗氧化性与多酚类和黄酮类物质释放量呈显著正相关。楼舒婷等^［14］对黑果枸杞体外消化提取和化学方法提取活性成分进行了比较。但黑果枸杞的活性成分在胃肠道消化过程中随时间的变化，相关研究较少。因此，本研究以黑果枸杞为原材料，以其主要活性成分花色苷、黄酮、多酚为研究对象，通过体外消化模型，探讨其活性成分在体外不同消化阶段主要活性物质及其抗氧化性的变化情况及相关性，为黑果枸杞资源开发及产品深加工提供科技支撑，为开发天然抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞购于玉门市花海镇；胰蛋白酶（酶活1∶500）、胃蛋白酶（酶活1∶15 000）、二苯基苦基苯肼（diphenylpicrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵（ABTS）均购自上海源叶生物科技有限公司；其他试剂的纯度均为分析纯，试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

可见紫外分光光度计DR6000；超声波清洗机KQ-700V；电子天平QUINTIX-224；离心机GL-12B，恒温水浴锅DK-98-Ⅱ，摇床LYZ-1112B。

1.3 体外模拟胃肠消化

体外消化试验参照Miller等^［15］和Qin等^［16］的方法。考虑到黑果枸杞花色苷容易受到光、热和pH 等因素的影响，消化时间过长，受到的干扰就越大，导致试验数据不准确，因此对其胃肠消化均模拟消化3 h，测定其活性成分和抗氧化性。胃消化阶段：将黑果枸杞进行粉碎，用超纯水料液比1∶60进行超声提取，得到其活性成分提取液。用HCl调节pH到2，在其提取液中加入模拟胃液（酶活75 U/mL），对照组为不添加胃蛋白酶pH等于2的活性成分提取液，避光于37 ℃和100 r/min摇床中模拟胃消化培养，每消化1 h进行取样，取样85 ℃灭酶5 min，进行数据测定与分析。

肠消化阶段：模拟肠消化液为胃消化后的消化液用NaHCO₃调节样品组和对照组pH值至7，然后加入模拟肠液（酶活 75 U/mL），对照组为不添加胰酶pH等于7的活性成分提取液，摇晃均匀，继续置于避光于37 ℃和100 r/min摇床中模拟肠消化培养，每消化1 h进行取样，取样85 ℃灭酶5 min，进行数据测定与分析。

1.4 活性成分和抗氧化测定

黄酮含量测定采用NaNO₂-Al（NO）₃比色法^［17］。以芦丁为标准品，得到线性方程为y=9.708x+0.016 2，R²=0.998 3。根据线性方程，计算不同消化阶段样品中的总酚含量；多酚含量以没食子酸为标准品，采用福林酚法测定总酚含量^［18］，得到线性方程为y=1.981 8 x+0.147 1，R²=0.999 2。根据线性方程，计算不同消化阶段样品中的总酚含量；花色苷的测定采用pH示差法^［19］；抗氧化指标DPPH自由基清除率的测定参考王旭等^［20］的方法进行；ABTS自由基清除率的测定参考朱玉昌的方法测定^［21］。

1.5 数据分析

数据采用IBM SPSS Statistics 25.0进行方差分析，采用Origin 2021进行作图。

2 结果与分析

2.1 体外模拟消化过程中活性成分的变化

2.1.1 花色苷含量的变化

如图1所示，胃消化阶段，花色苷含量随着消化时间的延长呈下降趋势，胃消化过程中花色苷含量下降了1.971 mg/g。方差分析结果表明，0~2 h，花色苷含量变化差异显著（P<0.05）。胃液对照除0 h之外，其余时间段内花色苷含量均高于胃消化组花色苷含量且差异显著；肠消化阶段，肠消化组和肠液对照组花色苷含量均呈下降趋势，肠消化过程中花青素含量下降了8.315 mg/g，肠液消化组含量均低于肠液对照组。方差分析表明，各时间段花色苷含量均有显著差异（P<0.05）。

2.1.2 黄酮含量的变化

如图2所示，胃消化阶段，消化组黄酮含量均高于对照组，消化组和对照组黄酮含量随着消化时间的变化，均呈下降趋势，胃消化过程中黄酮含量下降了5.842 mg/g。方差分析结果表明，消化组不同时间段均有显著性差异。对照组，0 h和1 h无显著性差异，其他时间均有显著性差异（P<0.05）；肠消化阶段，消化组和对照组黄酮含量随着消化时间的变化均呈先上升后略微有所下降，肠消化2 h时，黄酮含量达最高值，黄酮含量增加了6.004 mg/g。方差分析结果表明，肠消化组，1 h和3 h无显著性差异，其他时间均有显著性差异。肠对照组，1 h和2 h无显著差异性，其他时间均有显著性差异（P<0.05）。

2.1.3 体外消化对多酚含量的影响

如图3所示，在胃消化阶段，消化组多酚含量随着消化时间的变化呈上升后下降的趋势，在2 h时达最高，多酚含量上升了4.431 mg/g。胃液对照组多酚随着时间的变化呈下降趋势。对照组多酚含量均高于消化组，方差分析结果表明，胃消化组，不同消化时间均有显著性差异，对照组，1 h和2 h有显著性差异（P<0.05）；在肠消化阶段，消化组多酚含量呈先上升后下降的趋势，对照组含量随着消化时间的变化均呈下降趋势，消化组，多酚含量1 h时达最高值，多酚含量上升了1.480 mg/g。方差分析结果表明，肠消化组2 h和3 h无显著性差异，其余时间均有显著性差异，肠液对照组，0、1、2 h有显著性差异（P<0.05）。

2.2 体外模拟消化对抗氧化性的影响

2.2.1 DPPH自由基清除率的变化

如图4所示，在胃消化阶段，DPPH自由基胃消化组和对照组均随着消化时间的变化均呈下降趋势，胃消化过程中DPPH自由基下降了16.48 %。方差分析结果表明，胃消化组，0 h和1、2、3 h均有显著性差异（P<0.05）。肠消化阶段，DPPH自由基清除率消化组和对照组含量随着消化时间的变化，均呈下降趋势。肠消化过程中DPPH自由基下降了4.99 %。方差分析结果表明，肠消化组，0 h和1、2、3 h差异显著（P<0.05）。

2.2.2 ABTS自由基清除率的变化

如图5所示，胃消化阶段，ABTS自由基胃消化组和胃液对照组都随着消化时间的变化呈下降趋势，胃消化组ABTS自由基下降了8.64 %。方差分析结果表明，不同时间，其清除率均有显著性差异（P<0.05）。肠消化阶段，肠消化组ABTS自由基清除率随着消化时间的变化呈先上升后下降趋势，在2 h时，ABTS自由基清除率最高，清除率是92.21%，肠消化过程中ABTS自由基总体下降了12.1 %。方差分析结果表明，0 h和1、2、3 h，ABTS自由基清除率有显著性差异（P<0.05）。肠液对照组ABTS自由基清除率呈下降趋势，方差分析结果表明，1 h和2 h无显著性变化差异，其余0 h、2、3 hABTS自由基清除率有显著性差异（P<0.05）。

3 讨论

3.1 体外模拟消化对黑果枸杞活性成分的影响

花色苷在自然条件下，通常是通过糖苷键与糖类物质结合形成花色苷，或与芳香酸、脂肪酸等通过酯键以酰基化的形式存在，胃肠消化会破坏其结构和存在形式^［22］。胃液对照0~1 h花色苷含量升高，可能是在胃酸提取1 h，使花色苷含量得到释放，且花色苷在pH 2的酸性条件下较为稳定。在胃肠消化过程中，花色苷含量均有所降低，可能是胃肠酶消化导致花色苷的性质不稳定使其转换与分解。花色苷容易受到光、热和pH 等因素的影响，随着时间、消化酶、消化环境等条件的改变，也可能引起了部分花色苷结构的改变，对花色苷的分解起加速作用，可能被消化降解为更具有生物活性、分子量更小的代谢物^［23］。

胃消化过程中黄酮含量均高于胃液对照组，说明胃消化酶可以促进黄酮含量的释放。但随着消化时间的变化黄酮含量逐渐降低，在胃消化环境和胃蛋白酶的作用下，可以使黄酮转化为其他化合物，从而使黄酮含量减少，也可能是一些黄酮类物质与消化酶结合，影响到黄酮类化合物羟基的取代位置及个数，从而使黄酮类物质的活性降低^［24］。肠消化组黄酮含量逐渐升高且高于对照组，表明肠酶的消化作用导致黄酮类物质从基质中释放出来，或是模拟胃肠的蠕动及可以降低食糜的粒径，利于黄酮的释放^［25］。

胃消化过程中胃消化组多酚含量低于对照组，表明胃消化对多酚含量的释放有抑制作用，随着消化时间的推移，多酚含量逐渐升高到2 h略微下降，这可能是胃消化过程中多酚释放完全开始缓慢分解，且在酶的作用下，酚类物质不稳定极易被消化体系中的氧气氧化，随着消化时间的推移，稳定性差的多酚物质转化为其他化合物^［26］，或随着时间的推移被氧化降解，多酚类物质的含量下降；肠消化组多酚含量高于对照组，表明肠酶对其酚类物质的稳定性也有作用。随着消化时间的推移，多酚含量逐渐升高到2 h略微下降，可能随时间延长胃消化导致不稳定的酚类物质的降解。有研究发现pH较低的酸性环境，有利于促进酚类等抗氧化物质的释放，而弱碱性环境下，酚类物质可能会发生降解^［27］。

3.2 体外模拟消化对黑果枸杞抗氧化性的影响

抗氧化剂使自由基失活是基于氢质子转移（HAT）和电子转移（ET）两种机制。ABTS是通过HAT 机制导致体系绿色减退，DPPH法使紫色减退则可能是ET 机制、HAT 机制，或是二者共同作用的结果^［21］。两者抗氧化性的评价都是在反应溶剂中加入抗氧化剂使其溶剂褪色，通过反应体系颜色的改变评价试样抗氧化性。抗氧化指标ABTS和DPPH自由基对各种样品的清除率出现不一致的情况，这可能由于其不同抗氧化指标的作用机制不同而导致。抗氧化性是所有抗氧化物质共同发挥作用的结果，单个活性成分含量高，抗氧化活性不一定强^［28］，活性成分的结构不同，导致活性成分之间可能存在相互协同或拮抗作用。

胃消化过程中花色苷的变化趋势与ABTS变化趋势一致，肠消化过程中ABTS有上升趋势然后逐渐降低可能源于其黄酮含量的释放，黄酮类化合物以黄烷为母核，取代基数量、位置和类型都极大影响抗氧化性，羟基越多抗氧化性越大^［29］。肠消化过程中，ABTS和黄酮含量的变化趋势一致，这可能是ABTS对黄酮作用较为敏感，黄酮的含量和结构可能对ABTS的变化均有一定的影响，随着黄酮含量的上升ABTS有所上升，随着消化时间的变化，活性成分逐渐被氧化降解，抗氧化性降低。

3.3 体外模拟消化体的局限性

体外消化模型在食品和医学方面应用广泛，但体外消化模型不能完全替代人体消化，人体消化系统是一个庞大的系统，受很多因素的影响，如反馈机制、黏膜人体细胞活性等，以及食物的交互作用均无法体现^［30］。本试验对体外消化模拟结果产生显著影响的因素是样品自身特性、酶的活性与种类、pH酸碱度和消化时间，这些因素受人体其他因素的影响，时刻都在发生变化，不能完全在体外环境条件下完全模拟出来^［31］，因此，完全的体外模拟消化需要更先进的科学和技术进行改进和验证。另外，试验过程中通过85 ℃灭酶终止消化反应，这或许对其活性物质的也会产生影响，因此，高温灭酶仍需要其他更加有效且不对抗氧化物质产生影响的技术所替代，确保试验结果的准确性。

4 结论

体外模拟消化对黑果枸杞活性成分和抗氧化性有显著影响。胃消化过程中花色苷和黄酮含量分别降低了1.971 4 mg/g和5.842 mg/g，而多酚含量上升了4.431 mg/g；肠消化过程中花色苷含量降低了8.315 mg/g，而黄酮和多酚含量上升了6.004 mg/g和1.480 mg/g。黑果枸杞有很好的抗氧化、清除自由基的能力，体外模拟消化降低了黑果枸的抗氧化性，胃消化过程DPPH和ABTS分别下降了16.48%和7.2%，肠消化过程DPPH和ABTS分别下降了4.99 %和12.1 %。本试验可为黑果枸杞功能性产品的开发利用提供参考。

参考文献

[1] 郭晓静，许家佗，李勇枝.生物信息技术在亚健康检测与评估中的应用［J］.上海中医药大学学报，2021，35（3）：7-11.

[2] 苏志新.过多的活性氧自由基是万病之源［J］.食品与健康，2002（9）：14-15.

[3] 陈生蓉，史国民，叶广继，等.黑果枸杞不同组织花青苷组分及相对含量研究［J/OL］.食品与发酵工业：1-9［2023-03-27］.

[4] 艾则孜江·艾尔肯，滕亮，刘梦，等.黑果枸杞的花色苷成分和药理作用研究进展［J］.西北药学杂志，2021，36（1）：170-173.

[5] 李淑珍. 黑果枸杞总黄酮制备工艺优化和抗氧化、降血脂活性及成分研究［D］.乌鲁木齐：新疆师范大学，2009.

[6] 闫亚美，罗青，冉林武，等.黑果枸杞功效研究进展及产业发展前景［J］.宁夏农林科技，2015，56（1）：21-24+57.

[7] 阿娃汉，陈瑛，陶大勇.黑果枸杞色素对果蝇性活力及寿命影响的研究［J］.塔里木大学学报，2007（3）：19-20.

[8] 陈责，贾慧.体外消化模型的研究进展［J］.农产品加工，2017（9）：61-64.

[9] 李玉珍，肖怀秋，姜明姣，等.体外人模拟胃肠系统在食物消化行为研究中的应用进展［J］.中国酿造，2017，36（7）：153-156.

[10] Burgos-Edwards A， Jiménez-Aspee F， Thomas-Valdés S，et al. Qualitative and quantitative changes in polyphenol composition and bioactivity of Ribes magellanicum and R.punctatum after in vitro gastrointestinal digestion［J］.Food Chemistry，2017，237：1073-1082.

[11] 王月华，李斌，孟宪军，等.模拟体外消化对蓝靛果提取物花色苷组成及抗氧化能力的影响［J］.食品科学，2016，37（19）：100-105.

[12] 熊云霞. 体外模拟消化对苹果和梨的抗氧化活性及抗癌细胞增殖 活性影响的研究［D］. 广州： 华南理工大学，2013： 13-36.

[13] 向卓亚，邓俊琳，陈建，等.藜麦体外模拟消化过程中酚类物质含量及抗氧化活性的变化［J］.中国食品学报，2021，21（8）：283-290.

[14] 楼舒婷，林雯雯，孙玉敬，等.黑果枸杞中多酚的体外消化及其抗氧化性研究［J］.食品工业科技，2015，36（11）：66-69，74.

[15] Miller D D， Schricker B R， Rasmussen R R，et al. An in vitro method for estimation of iron availability from meals［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1981，34：2248-2256.

[16] Qin Y， Wang L， Liu Y F，et al.Release of phenolics compounds from，Rubus idaeus L.dried fruits and seeds during simulated，in vitro，digestion and their bio-activities［J］.Journal of Functional Foods，2018，46：57-65.

[17] 王梦茹，雷振宏，梁华，等 ．响应面法优化黄芪三种活性成分的闪式提取工艺［J］．山西农业大学学报（自然科学版），2019，39（3）：14-22．

[18] 陈旭，徐楚炎，范露，等.山楂叶多酚提取工艺及其降糖降脂应用研究 ［J］.饲料研究，2022，45（5）：78-83.

[19] 韦婷，杨艳宇，李茓艳，等.pH示差法测定苹果皮花色苷含量［J］.食品与发酵科技，2022，58（2）：130-136.

[20] 王旭，刘妍如，杨建云，等.马鞭草中总黄酮测定方法优化及其对DPPH自由基清除动力学过程［J］.时珍国医国药，2013，24（7）：1543-1546.

[21] 朱玉昌，焦必宁.ABTS法体外测定果蔬类总抗氧化能力的研究进展［J］.食品与发酵工业，2005（8）：77-80.

[22] 王二雷，刘彦君，刘静波. 吡喃型花色苷类化合物的研究进展 ［J］. 食品工业科技，2018，39（12）：325-333.

[23] Cheny，Fuzf，Tuzc，et al.Influence of in vitro gastrointes⁃ tinal digestion on the bioavailability and antioxidant activity of polyphenolsfrom Ipomoea batatas leaves［J］.International Journal of Food Scienceand Technology，2017，52（5）：1131-1137.

[24] 鲁倩茹，邢珂慧，邵佩兰，等.体外模拟消化对红枣色素活性成分和抗氧化活性的影响［J］.食品科技，2020，45（9）：267-272..

[25] Meyer J H.Gastric emptying of ordinary food： effect of antrum on particle size［J］.American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology，1980，239（3）：G133-G135.

[26] 彭梦雪，从彦丽，刘冬.模拟胃肠消化评价苹果多酚、黄酮及抗氧化活性的相关性［J］.现代食品科技，2016，32（1）：122-128+296.

[27] 徐洪宇，蒯宜蕴，詹壮壮，等.果皮中酚类物质含量、抗氧化活性及在体外消化过程中成分的变化［J］.食品科学，2019，40（15）：23-30.

[28] Catherine R E， Nicholas M， George P.Antioxidant properties of phenolic compounds［J］.Trends in Plant Science，1997，2（4）：152-159.

[29] 黄鑫，梁剑平，郝宝成.黄酮类化合物的分子修饰与构效关系的研究［J］.安徽农业科学，2015，43（11）：57-61.

[30] Pan Y，Deng Z Y，Zheng S L，et al.Daily dietary antioxidant interactions are due to not only the quantity but also the ratios of hydrophilic and lipophilic phytochemicals［J］.J Agr Food Chem，2018，66：9107-9120.

[31] Boisen S，Eggum B O.Critical evaluation of invitromethods for estimating digesti bility insimple-stomach animals［J］.Nutrition Research Reviews，1991（4）：141-162.

基金资助

甘肃省高等学校产业支撑项目(2021CYZC-56)