盐生草和白茎盐生草染色体核型分析及盐生草基因组大小预测

Karyotype analysis of Halogeton glomeratus and Halogeton arachnoideus，and genome size prediction of Halogeton glomeratus

摘要

目的 鉴定盐生植物种类、探讨盐生植物亲缘关系、研究植物种质资源遗传多样性提供理论依据；通过流式细胞术估测盐生草基因组大小，为盐生草属其他物种基因组大小测定方法提供参考。 方法 以盐生草属（Halophytes）植物盐生草（Halogeton glomeratus）和白茎盐生草（Halogeton arachnoideus）为材料，通过进行核型分析，常规压片法对盐生草和白茎盐生草根尖细胞进行核型分析，并以盐生草嫩叶为材料，采用流式细胞术估测盐生草基因组大小。 结果 二者均属于二倍体植物（2n=18），核型公式为2n=2x=18=12 m+6 sm（盐生草）、2n=2x=18=16 m+2 sm（白茎盐生草），二者核不对称系数（AS.K%）分别为61.91%和41.91%，核型分别为“2A”型和“1B”型；盐生草基因组大小约为（0.95±0.02）G。 结论 在盐生草属的两个品种中，盐生草属于较为进化的植物，白茎盐生草进化则较为原始；建立了流式细胞术测定盐生草基因组大小的方法，预测了盐生草基因组大小。

Abstract

Objective The objective of this study was to investigate the genetic diversity of plant germplasm resources，with a particular focus on Halogeton glomeratus.Additionally，we aimed to predict the genome size of H.glomeratus using flow cytometry，providing valuable insights for genome size determination in other halophyte species. Method Halogeton glomeratus and Halogeton arachnoideus were selected as materials to establish a theoretical basis for species identification and explore the genetic relationships among halophytes.Chromosome karyotypes were analyzed using the conventional pressing method on root tip cells of H.glomeratus and H.arachnoideus.Furthermore，the genome size of H.glomeratus was predicted through flow cytometry. Result Both H.glomeratus and H.arachnoideus were found to be diploid with a chromosome count of 2n=18.The karyotype formulas for the two cultivars were as follows：H.glomeratus—2 n=2 x=18=12 m+6 sm，H.arachnoideus-2 n=2 x=18=16 m+2 sm.The asymmetrical karyotype coefficients （AS.K%） were 61.91% and 41.91%，respectively.The karyotype symmetries were classified as 2A and 1B types.The estimated genome size of H.glomeratus was approximately （0.95±0.02）G. Conclusion Among the two halophyte varieties studied，H.glomeratus displayed a higher level of evolutionary advancement compared to H.arachnoideus，which appeared to be a relatively original variety.A reliable method for determining the genome size of H.glomeratus using flow cytometry was established，and the genome size of H.glomeratus was successfully predicted.These findings contribute to the understanding of genetic diversity in halophytes and can serve as a reference for genome size determination in other species of halophytes.

Graphical abstract

关键词

盐生草 / 白茎盐生草 / 核型分析 / 流式细胞术 / 基因组大小

Key words

Halogeton glomeratus / Halogeton arachnoideus / karyotype analysis / flow cytometry / genome size

盐生草属（Halogetons）为一年生草本植物，属中央种子目，藜科，其种类稀少，全球范围内共有3种，只在亚洲中部与西部、欧洲南部及非洲北部有分布，我国盐生草属主要包括盐生草（Halogeton glomeratus）和白茎盐生草（Halogeton arachnoideus）两种^［1］。盐生草和白茎盐生草广泛生长于西北地区、华北地区和西藏地区^［2］。盐生草和白茎盐生草的形态特征相似，但又有所区别。其中最明显的区别为白茎盐生草的茎发白且节上有毛，而盐生草是绿色且无毛^［1］。盐生草在防沙固土，改良土壤盐渍化等方面可发挥重要作用^［3］。

染色体是遗传信息的主要载体，而染色体核型分析在细胞遗传学、细胞分类学方面具有重要的研究意义。自进入21世纪以来，基因组学迅速发展，而核型分析是完成高质量基因组研究的基础数据和基本要求，操作简单，且经济实惠，因此到了广泛使用。核型特征在植物种级、属级以及科级水平的分类中均发挥着重要作用^［4］。核型技术出现将近一个世纪以来，虽然染色体压片技术在染色体核型方面取得了一定进展，并在研究植物进化过程中得到了广泛应用，但植物核型技术还存在较大的发展前景^［5-6］。目前，对于植物染色体核型分析主要以研究其染色体的形态为主。在国内，研究植物染色体核型分析的方法主要包括核型图、核型公式计算染色体各项指标及研究染色体核型进化趋势等^［7］。在国外，相关研究者对其进行了更近一步的研究，涉及到染色体核型与DNA之间的关系^［8］。目前，国内外研究者对盐生草属植物主要从盐生草属植物中挖掘抗旱耐盐基因并对其进行功能验证、探究干旱和盐胁迫或重金属等逆境条件下对盐生植物种子萌发特性的影响、以及叶片结构等方面进行研究^［9-11］。而对盐生草和白茎盐生草核型分析方面却鲜有报道。在中国，藜科植物集中分布在西北旱区，对于其核型报道的包括盐地碱蓬（Suaeda salsa）、盐穗木（Halostachys caspica）、盐爪爪（Kalidium foliatum）等。韩淼等^［12］首次研究了盐地碱蓬的染色体核型，结果发现其为二倍体（2 n=16），为“1B”型。阿斯古丽·伊斯马伊力等^［13］研究了盐生植物盐穗木的染色体核型，研究发现盐穗木为二倍体（2 n=18），为“1A”型，属于进化最原始的物种。韩淼等^［14］研究了盐爪爪的染色体数目及核型，结果发现盐爪爪有16条染色体，染色体类型有3种，即M、m以及sm，属于“1B”型，进化较为原始。研究植物的染色体核型不仅能为种间遗传变异、系统演化以及亲缘关系提供证据，还可以为杂交育种选育及杂种后代鉴定等提供理论依据^［15］

基因组大小又称基因组C值，是指生物体的单倍体基因组所含的DNA含量。基因组大小对属间分类、杂种鉴定、生物进化等的研究极其重要^［16］。流式细胞术利用流式细胞仪来分选和检测流体中的粒子 ^［17］。该技术检测速度快、灵敏度高、数据采集量大、节约成本，在细胞生物学、遗传学、药理学及肿瘤学等领域均被广泛应用^［18］。在植物学研究方面主要被应用于鉴定植物倍性和估测基因组大小^［19］。目前，关于盐生草基因组大小尚未见报道。因此，本试验研究盐生草属植物染色体核型及测定盐生草植物基因组大小，对于探究植物种质资源遗传性、分析盐生草属基因组测序及鉴别我国盐生植物的种类、鉴定亲缘关系和研究植物种质资源的多样性等具有重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盐生草和白茎盐生草种子采集于甘肃省会宁县盐碱地，水稻品种日本晴由中国科学院昆明植物研究所提供。

1.2 盐生草和白茎盐生草染色体测定

选择形态饱满的盐生草和白茎盐生草种子分别置于铺有两层湿润滤纸的玻璃培养皿（φ=9 cm），25 ℃过夜萌发，待根尖长度长至0.5~1 cm。上午9∶00左右取材后进行清洗，移入4 ℃冰箱预处理24 h。然后转入卡诺式固定液（将95%乙醇与冰醋酸按体积比为3∶1的比例混合）中，于室温下处理1 d。使用1 mol/L盐酸于60 ℃水浴锅恒温热浴18 min。将酸解后的根尖材料用双重水冲洗30 s，并用卡宝品红染色液^［20］，染色8 min。盖上盖玻片，用解剖针慢慢敲打，并用吸水纸将多余的染色液吸除。制片完成后，使用DM 6 000 B型光学显微镜进行观察。盐生草和白茎盐生草各选择30个染色清晰、扩散良好的细胞进行拍照观察^［21］。

1.3 盐生草基因组大小测定

1.3.1 试验取材

将盐生草和水稻种子分别种于实验室花盆中，待出苗后分别采取盐生草和水稻新鲜叶片作为试验材料。

1.3.2 细胞核悬液制备

取盐生草嫩叶3份，清洗后放入事先预冷好的并添加0.8 mL MG^b解离液（购于上海尚宝生物科技有限公司，pH=7.5）的培养皿中。切碎叶片并使其叶片蘸上解离液于冰上静置10 min，接着将使用400目滤网过滤解离好的样品，备用。用同样的方法制备水稻日本晴的细胞核悬浮液。

1.3.3 DNA特异性染色

将制备好的细胞核悬液置于10 mL离心管中（避光），并加入一定体积的1 mg/L RNase和1 mg/L PI溶液（提前预冷），轻轻混合均匀后立即转移至4 ℃冰箱，避光染色0.5~1 h。

1.3.4 流式细胞仪检测

将盐生草的细胞核悬液和水稻日本晴的细胞核悬液按适当比例混合，使两者细胞核浓度尽可能一致。选用BD FACScalibur型流式细胞仪检测细胞核悬浮液。波长为488 nm，在相同电压条件下，检测PI的发射光荧光强度，每次测定10 000个细胞，实验设置三次生物学重复。变异系数CV≤5%。由公式计算待测样品基因组大小：

待测样品基因组大小=待测样品荧光强度/内参荧光强度×内参植物基因组大小

1.4 试验数据处理及分析

参考Levan等^［22］对染色体的命名规则，核型分类使用李懋学和Baker等^［23］得出的分类法进行，并根据Arano等^［24］提议的计算法则计算核型不对称系数。染色体长度测量、同源染色体的配对及数据处理借助Image J软件、Photoshop与Microsoft Excel软件。流式细胞术测定盐生草基因组大小时的数据处理及分析使用Modifit3.0软件。

2 结果与分析

2.1 盐生草核型分析

通过对盐生草细胞里扩散良好的染色体进行查看与分析，结果表明，盐生草染色体数目是2 n=2 x=18，共有9对染色体，为二倍体。通过Levan等^［22］对着丝点位置的划分标准，可以看出盐生草染色体由3对（3、6、7）近中部着丝点染色体（sm型）和6对（1、2、4、5、8、9）中部着丝点（m型）的染色体组成（图1、图2），核型公式表示为2 n=2 x=18=12m+6sm，相对长度介于7.81%~14.89%之间。染色体平均长度为2.27 µm，臂比值介于1.33~2.18之间，平均臂比值为1.65，核型不对称系数（AS.K%）为61.91%。染色体总长度介于1.60~3.05 µm之间，最长/最短=1.91，臂比值（L/S）>2的有两对四条，占总染色体的22.22%。核型属于“2A”型（表1）。

2.2 白茎盐生草核型分析

选择清晰、扩散度好的中期分裂相，对白茎盐生草细胞的染色体进行观察与统计。结果显示，白茎盐生草的体细胞染色体数目是2 n=2 x=18，共有9对染色体，属于二倍体。根据Levan等^［22］制定的着丝点位置的划分标准，可以看出白茎盐生草染色体主要为中部着丝点染色体（m型），只有第4对为近中部着丝点染色体（sm型）（图3、图4），核型公式表示为2 n=2 x=18=16m+2sm，相对长度的范围为7.50%~15.13%。染色体平均长度为2.00 µm，臂比值介于为1.20~1.80之间，平均臂比值为1.40，核型不对称系数（AS.K%）为41.91%。染色体总长度介于1.35~2.73 µm之间，最长/最短=2.02，臂比值均<2。核型属于“1B”型（表2）。

2.3 盐生草基因组大小的测定

当变异系数<5%时，待测样品与对照样品的离子清晰、明确、集中，并且可以同时检测到混合样品的颗粒簇（图5）。所以，本试验选用的解离液合适。通过对待测样品单样上机，确定出主峰位置，选择水稻日本晴作为内参。根据已报道的内参水稻日本晴参考基因组大小为0.42 G，对水稻日本晴和盐生草的混合细胞核悬液的PI发射荧光强度进行流式测定分析，发现内参与待测样品峰值能完全分开，无重叠峰，区分度良好（图6）。从而保证了实验利用水稻日本晴作为内参估算盐生草基因组大小的准确性和可行性。由表3计算出3次重复试验测得的盐生草基因组大小依次为0.98 G、0.93 G、0.93 G，由此估算出待测样品的基因组大小约为（0.95±0.02）G。

3 讨论

染色体作为生物细胞核中的重要组成成分，其数目、形态、结构和核型通常较为稳定，可以为系统进化关系、物种亲缘关系、染色体变异以及细胞遗传分类的研究提供重要依据^［25］。

理想的染色体制片受到许多因素的影响，如取材的部位、长度、时间对其非常重要。据前人研究，植物染色体制片主要选取茎尖、根尖、愈伤组织^［26］等生长旺盛的部位。在本试验中，根尖为最适宜取材部位。根尖长度一般在1~2 cm时取材，取材时间一般在上午8∶00~11∶00或下午13∶00~15∶00进行，此时细胞分裂旺盛^［27］。经过多次实验，最终发现盐生草和白茎盐生草种子萌发根长至0.5~1 cm，下午19∶00萌发种子，次日9∶00取材效果最佳。此外，材料预处理的方法和解离条件也很重要。预处理和解离条件的选择参考Zhang等^［28］的方法。最终确定预处理时将材料根尖放在装有冰水混合物的离心管中，4 ℃低温处理24 h，使用1 mol/L的盐酸于60 ℃水浴锅热浴18 min得到的图片效果最好。本试验确定的最佳取材部位、时间、预处理方法及解离条件等或许可为藜科其它属植物的染色体核型分析试验提供参考。在本试验中，观察染色体时遇到的最大困难是很难观察到染色体缢缩部位，推测主要原因可能是盐生草和白茎盐生草染色体较小的缘故。因此，选择高规格的显微镜观察极其重要。

核型分析是完成高质量基因组研究的基础数据和基本要求，在天门冬科^［29］、伞形科^［30］、百合科^［31］植物中均有应用，藜科植物中也有一定材料进行了核型分析。张峰等^［32］对盐地碱蓬（Suaeda salsa）的核型进行了分析，结果发现其染色体数目2 n=18，染色体基数为9。孙勃等^［33］对叶用甜菜进行了核型分析，结果发现叶用甜菜的染色体数目同样为2 n=18，染色体基数为9。本研究从细胞学水平对盐生草和白茎盐生草的染色体核型进行了研究。研究结果表明，盐生草和白茎盐生草均为二倍体（2 n=18），染色体基数均为9。这与前人对藜科盐生植物研究出的染色体基数是一致的。盐生草核型公式：2 n=2 x=18=12 m+6 sm，白茎盐生草核型公式：2 n=2 x=18=16 m+2 sm，染色体类型均为m型和sm型，且主要为m型染色体，即大部分着丝点在染色体中部，反映了盐生草属明显的表型特征。Stebbins理论表示，生物进化的趋势是其染色体核型由对称向非对称的演化过程^［34］。盐生草与白茎盐生草核不对称系数（AS.K%）分别为61.91%和41.91%，其核型分别为“2A”和“1B”型。由此可以看出，盐生草为较为进化的物种，白茎盐生草的进化程度则相对原始。

目前测定植物基因组大小的方法有很多，主要包括基因组测序法^［35］、孚耳根微显影法^［36］、流式细胞术法^［37］等。其中基因组测序能准确测出基因组的大小，但成本高、耗时长。使用流式细胞术检测速度快、价格低廉、结果相对准确，并且其结果可用于全基因组测序，因此应用更加广泛^［38］。在流式细胞术分析中，选择合适的解离液是试验成功的关键。黄雄等^［39］使用多种裂解液裂解桫椤叶片时，发现WPB裂解液达到的效果最好。吉平平等^［40］从八种裂解液中筛选出OTTO裂解液作为华细辛叶片细胞核裂解液。本研究也做过多种预实验来确定最佳裂解液，最终发现使用MG^b裂解液时，待测样品与对照样品的离子清晰、明确、集中，并且可以同时检测到混合样品的颗粒簇，裂解效果较好。由此可见，选取的植物或组织不同所用的裂解液未必一样。在本试验中，选取已测得基因序列信息的水稻日本晴为内参，首次测得待测样品盐生草的基因组大小约为（0.95±0.02）G，其数值为盐生草属其它植物基因组大小提供了参考，内参与待测样品峰值能完全分开，无重叠峰，区分度良好，保证了试验的相对准确性和可行性。

本研究确定了盐生草和白茎盐生草的染色体数目和核型以及使用流式细胞术预测了藜科植物盐生草的基因组大小。该研究结果为后续盐生草属种质资源鉴定、系统演化研究及多样性改良提供了基础，为盐生草属其他物种基因组大小测定方法提供了数据参考。

4 结论

盐生草和白茎盐生草均属于二倍体植物（2 n=18），均有两种染色体（m、sm）。盐生草的核型为“2A”型，核型不对称系数（AS.K%）为61.91%；白茎盐生草的核型为“1B”型，核型不对称系数（AS.K%）为41.91%。根据植物进化趋势是对称性向非对称性可知，盐生草属于较为进化的物种，白茎盐生草进化相对原始。首次使用流式细胞术测得了盐生草基因组大小约为（0.95±0.02）G，为盐生草及其他物种基因组大小测定方提供参考。

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基金资助

973计划前期研究专项(2014CB160313)

国家自然科学基金项目(31960072)

国家自然科学基金项目(32001514)

国家自然科学基金项目(31860377)

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系(CARS-05-04B-2)

甘肃省教育厅产业支撑计划项目(2021CYZC-12)

甘肃省自然基金重点项目(20JR10RA507)

甘肃省自然基金重点项目(21JR7RA801)

甘肃农业大学国家级大学生创新创业训练计划重点支持领域项目(202110733001)