粘细菌Myxococcus sp.CYD-1海藻糖合酶基因克隆及酶学特性分析

Cloning，expression and characterization of a trehalose synthase from Myxococcus sp.CYD-1

摘要

目的 海藻糖合酶（trehalose synthase，EC.5.4.99.16） 可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖，该反应仅需一步，且所用原料低廉，在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。本文以粘细菌Myxococcus sp.CYD-1为材料，挖掘新的海藻糖合酶资源。 方法 以菌株CYD-1基因组 DNA 为模板，使用加尾 PCR 的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因MCTs，构建含有组氨酸标签的重组表达载体，并将重组质粒导入大肠杆菌 BL21（DE3）中进行原核表达。重组蛋白经 Ni²⁺-NTA 纯化，以麦芽糖为底物研究其酶学性质，包括最适温度、最适pH、温度和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响。 结果 从菌株CYD-1基因组中克隆到一个编码海藻糖合成酶的基因MCTs。MCTs全长1 659 bp，编码一个552个氨基酸的蛋白，分子量大小为65 kU。氨基酸序列分析表明MCTs与来源于Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶相似性为92.36%，与其他已报道的海藻糖合酶有较大差异。MCTs具有高度保守的基序²⁰²DAVPYL²⁰⁷，²⁴⁴EANQ²⁴⁷和³⁰⁷RNHDEL³¹²，以及活性中心三联体Asp₂₀₂-Glu₂₄₄-Asp₃₁₀，三维建模结果显示MCTs的催化结构域具有典型的（α/β）₈桶状结构，表明MCTs归属于糖苷水解酶GH13家族。重组蛋白在E.coli BL21（DE3）中大量可溶性表达后，通过Ni²⁺-NTA将目的蛋白纯化至电泳纯。重组酶rMCTs最适反应温度为40 ℃，最适反应pH为6.5，最大比活力为105.6 U/mg。重组酶rMCTs 在30 ℃下处理4 h，残留酶活为50%，但在65 ℃下处理1.5 h 活力丧失。重组酶rMCTs在pH 5.0~8.0范围内有活性，在pH 6.0~7.5处理12 h活力稳定。1 mmol/L Ca²⁺对重组酶rMCTs有轻微的激活作用，Co²⁺、Fe ³⁺、Cu²⁺对重组酶rMCTs有抑制作用，其余金属离子对酶活力无影响。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rMCTs有强烈的抑制作用，TritonX-100对rMCTs酶活力无显著影响。 结论 MCTs具有潜在的应用价值，丰富了海藻糖合成酶资源。

Abstract

Objective Trehalose synthase (EC.5.4.99.16),which converts maltose to trehalose，is considered to be a potential biocatalyst for trehalose production.This enzymatic process has the advantage of a simple reaction and uses an inexpensive substrate.We aimed to discover and characterize a trehalose synthase from Myxococcus sp.CYD-1. Method Genomic DNA extracted from strain CYD-1 was used as a template for trehalose synthase gene cloning by PCR reaction.The PCR product was digested with restriction endonucleases Nde I and Hind Ⅲ and then ligated into pET-29a vector.After plasmid transformation into E.coli BL21 (DE3) cells，the recombinant enzyme was expressed by IPTG induction and purified by nickel affinity chromatography (Ni²⁺-NTA).Characterization of recombinant rMCTs，including optimal pH and temperature，metal ion dependence，and inhibitor，was performed using maltose as the substrate.The effect of pH and temperature on the enzyme activity was also measured. Result A trehalose synthase gene (MCTs) isolated from Myxococcus sp.CYD-1，encoding 552 amino acids with a putative molecular size of 65 kU，was expressed and characterized.The amino acid sequence of MCTs shared the highest identity (92.36%) with the trehalose synthase from Myxococcus sp.V11，but it is completely different from other experimentally characterized bacterial trehalose synthases.The results of homology modeling showed that MCTs possess the common trehalose synthase motifs such as ²⁰²DAVPYL²⁰⁷，²⁴⁴EANQ²⁴⁷ and ³⁰⁷RNHDEL³¹².A catalytic triad Asp202-Glu244-Asp330 was shown to be conserved in the MCTs.Three-dimensional modeling results show that MCTs has a typical (α/β)₈-barrel structure，indicating that MCTs belongs to the glycosyl hydrolase family 13.The purified recombinant enzyme had an optimum temperature of 40 ℃ and a pH optimum around 6.5.For the target substrate maltose，the specific enzyme activity of rMCTs was calculated to be approximately 105.6 U/mg protein under the optimal reaction conditions.The rMCTs retained full activity after 4 h of incubation at below 30°C and retained about 50%，but it lost 100% of the original activity after 1.5 h of incubation at 65 ℃.In terms of pH，the rMCTs was active in a narrow range of pH (5.0~8.0) conditions，and the enzyme was stable in the range of pH 6.0~7.5 in treatments at 4 ℃ for 12 h.The enzyme activity was slightly stimulated by Ca²⁺，and strongly inhibited by 1 mmol/L Co²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺.Other metal ions had almost no effect.Recombinant enzyme activity was strongly inhibited by 5 mg/mL SDS，10% acetone，ethanol and acetonitrile and weakly inhibited by 20 mg/mL TritonX-100. Conclusion The results of the characterization showed that it could be a potential novel enzyme in industrial applications.

Graphical abstract

关键词

Myxococcus sp.CYD-1 / 海藻糖合酶 / 基因克隆 / 酶学特性

Key words

Myxococcus sp.CYD-1 / trehalose synthase / cloning / characterization

海藻糖是一种由两个葡萄糖分子以α、α-1、1-糖苷键连接的非还原性双糖，在各种生物体内广泛存在^［1］。2000年，美国FDA认证海藻糖是一种安全的食品药品添加剂，可应用于食品、化妆品和制药行业。海藻糖作为冷冻食品、疫苗和护肤品的防腐剂、稳定剂或保湿剂，因此具有广阔的市场应用前景^［2-3］。

海藻糖的合成有化学合成和生物合成两种途径，在化学合成中，利用2，3，4，6-四-O-乙酰基-Β-D-吡喃葡萄糖和3，4，6-O-三乙酰基-D-葡萄糖烯进行合成，所用底物昂贵且产量低。生物合成途径中，合成的海藻糖可作为细胞内储藏的能源和碳源，作为信号分子诱导或抑制某些代谢途径等功能。海藻糖的生物合成主要通过5种不同的代谢途径^［4］：（1） 海藻糖6-磷酸合成酶（TPS，EC 2.4.1.15）和6-磷酸海藻糖磷酸水解酶（TPP，EC 3.1.3.12）途径；（2） 麦芽寡糖基海藻糖合成酶（TreY，EC 5.4.99.15）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（TreZ，EC 3.2.1.141）途径；（3） 海藻糖合成酶 （TreS）途径；（4）海藻糖磷酸化酶 （TreP，EC2.4.1.64）途径； （5） 海藻糖糖苷转移酶 （TreT）途径。其中，TPS /TPP、TreP、TreT途径都需要以价格昂贵的UDP-葡萄糖为底物，不适用于工业化生产。而TreY-TreZ途径以麦芽糊精为底物，产生的副产物多，难以纯化^［5］。TreS途径则以麦芽糖为底物，在海藻糖合酶的催化下通过底物内的分子重排，将α、α-1、4-糖苷键转换为α、α-1、1-糖苷键，通过一步反应生成海藻糖。这一途径生产流程相对简单，适合大规模的工业生产。此外将麦芽糖转化为具有较高商业价值的二次产品，对该行业具有极大的利益，因此受到广泛关注^［2］。这一途径仅在微生物如Thermus、Pimelobacter、Pseudomonas等中发现^［6］。因此，挖掘酶活力高、得率高的海藻糖合酶，是实现酶法生产海藻糖的关键问题。

粘细菌（Myxococcus sp.）是一类具有独特的子实体发育过程的革兰氏阴性细菌，在生长后期，当外界营养物质被耗尽后，杆状细胞聚集形成子实体，在子实体内，细胞发育成休眠态的球形粘液孢子^［7］。研究表明，在子实体形成阶段，粘细菌细胞内会积累10倍于营养细胞阶段的海藻糖，以提高抗逆性^［8］。Zhao X等^［9］从Myxococcus sp.V11中克隆到一个新的海藻糖合酶TreSI，酶活力高达170 U/mg，表明粘细菌来源的海藻糖合酶具有较高的活性。然而，迄今为止，来源于粘细菌的海藻糖合成酶仅有这一例研究。

前期工作中，本实验室筛选到一株粘细菌菌株Myxococcus sp.CYD-1。通过基因组测序（GenBank：JAKCFI000000000）和生物信息学分析，发现其基因组中存在一个编码海藻糖合成酶的基因（orf5111，GenBank：MCE9671166）。本研究拟对其进行克隆，通过异源表达和纯化后测定其酶学特性，以期开发新的海藻糖合酶资源。

1 材料与方法

1.1 材料

克隆菌株大肠杆菌（E.coli）DH5α，表达宿主菌株E.coli BL21（DE3），pET-29a（+）载体，粘细菌Myxococcus sp.CYD-1均保藏于本实验室。

高保真酶PrimerStar Max Premix、限制性内切酶、核酸分子量标准、低分子量蛋白标准购自北京TaKaRa公司；一步克隆试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；引物合成及核酸测序委托湖南擎科生物科技有限公司；质粒提取试剂盒，凝胶纯化试剂盒，购自北京索莱宝生物科技有限公司。麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物等试剂均为分析纯。

LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10、琼脂20，pH 7.0~7.2。

1.2 仪器

PCR 扩增仪（Biometre T1）、Beckman台式高速冷冻离心机（Allegra X-22R）、DYCP-31DN水平核酸电泳仪、分光光度计、Bio-rad Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳仪等。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的扩增

以高盐法所提取的Myxococcus sp.CYD-1总DNA 为模板，设计引物进行目的扩增。引物序列为（下划线为同源臂序列，斜体为NdeI、XhoI酶切位点）：5111 F：TAAGAA GGAGATATACATATGGACCTGGATCCCCTCTGGTA和5111 R：GTGGTGGTG GTGGTG CTCGAGCGCGGGGCTCCCTCCCGTCT。扩增反应体系（50 μL）：2×PrimerStar Max Premix 25.0 μL；上游引物5111 F和下游引物5111 R各1.0 μL（0.2 μmol/L）；总DNA模板1.0 μL（30 ng/μL）；无菌水补加至50.0 μL。扩增反应条件：变性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 16 s，35个循环。

1.3.2 序列分析

使用NCBI数据库（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行在线比对，以BioEdit 7.0软件进行氨基酸序列分析，用MEGA 5.5软件绘制系统进化树，蛋白三维结构模拟使用Alpha fold2 （https：//cryonet.ai/af2/）在线预测，蛋白三维结构图以PyMol 2.5进行可视化分析^［10］。

1.3.3 表达菌株的构建

将PCR扩增产物通过DNA凝胶纯化试剂盒纯化回收，与经过Nde I/Xho I双酶切pET-29a（+）载体片段通过一步克隆试剂盒ExnaseⅡ构建重组质粒，具体操作步骤见试剂盒说明书^［11］。重组质粒pET-29a（+）–MCTs通过热激转化至E.coli BL21（DE3），构建表达菌株。

1.3.4 重组酶rMCTs的诱导表达与纯化

重组菌株E.coli BL21（DE3） （pET-29a （+）–MCTs）按1%（v/v）比例接种至液体LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃，180 r/min培养至D₆₀₀为0.6，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，16 ℃低温诱导培养24 h，离心收集菌体。菌体以50 mmol/L PBS（pH6.0）重悬，超声破碎后，4 ℃ 12 000 r/min 离心30 min，上清液经 Ni²⁺-NTA亲和层析，以含200 mmol/L 咪唑的PBS缓冲液（pH 6.0）洗脱后，SDS-PAGE分析纯化结果^［12-13］。

1.3.5 重组酶rMCTs功能鉴定

以1%麦芽糖为底物，加入1.13 mg纯酶，40 ℃反应12 h，煮沸终止反应后离心，取0 h和12 h反应产物进行HPLC分析。液相色谱条件：Waters 2695液相色谱仪，Cosmosil Sugar-D糖柱，2414示差折光检测器，流动相：乙腈/水=85/15（v/v），流速：1 mL/min，柱温30 ℃^［6］。

1.3.6 重组酶rMCTs酶活力测定

蛋白含量测定按Bradford方法进行，以牛血清蛋白作为标准蛋白，具体操作见参考文献^［14］。

酶活定义为40 ℃、pH为6.0反应条件下，以0.03%（w/w）麦芽糖为底物，每分钟催化消耗1 μmol 麦芽糖所需的蛋白量（mg）为一个活力单位（U）^［9］。

酶活力＝\frac{\mathrm{葡萄}\mathrm{糖差}\mathrm{值毫}\mathrm{克数}(\mathrm{空白}-\mathrm{酶反}\mathrm{应})\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{6}}}{\mathrm{360.32}\times \mathrm{360}}

1.3.7 重组酶rMCTs最适反应温度及温度稳定性的测定

取28 µg重组酶rMCTs，以0.03% （w/w）麦芽糖为底物进行反应，分别在0、10、20、30、40、50 ℃下反应1 h后，加入1 mol/L DNS试剂1 mL，沸水浴5 min，以蒸镏水稀释2倍测定D₅₄₀^［15］，以rMCTs最适反应温度下的酶活力为100%进行比较，测定酶反应最适温度^［9］。

将2.8 mg重组酶rMCTs分别放置于4、20、30、40、50、60、70 ℃条件保温，定时取样，在40 ℃反应条件下测定酶活。以在0 ℃条件下保藏0 h的酶液为对照（100%），3次重复。测定重组酶的温度稳定性^［9］。

1.3.8 重组酶rMCTs最适反应pH及pH稳定性的测定

配制pH值范围为3.0~9.0的缓冲体系，包括柠檬酸缓冲液（50 mmol/L，pH 3.0~6.0），PBS缓冲液（50 mmol/L，pH 6.0~7.5），Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.5~9.0），在各缓冲体系中加入28 µg重组酶rMCTs，以0.03% （w/w）麦芽糖为底物，40 ℃条件下反应1 h。测定酶反应最适pH，以最适pH条件下的酶活力值为100%^［9］。

取0.28 mg纯酶与不同pH值的缓冲液按1∶2比例混合，4 ℃放置12 h。测定重组酶在不同pH条件下的稳定性^［9］。

1.3.9 金属离子、有机溶剂及螯合剂对重组酶rMCTs酶活的影响

在最适pH的反应缓冲体系中添加终浓度为1 mmol/L 的金属离子，加入28 µg纯酶，以不添加任何金属离子组作为对照（100%），DNS法测定酶活，重复3次，比较不同金属离子对酶活力的影响^［16］。

在最适pH的反应缓冲体系中，分别加入10%的甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈，20 mg/mL的吐温80、TritonX-100，10 mmol/L的EDTA，2 mg/mL的SDS，以不添加溶剂为对照（100%）。加入28 µg纯酶，反应后DNS法测定酶活，重复3次。比较不同有机溶剂、螯合剂对酶活力的影响^［16］。

1.4 数据统计

数据采用统计分析软件SPSS 26.0进行统计学分析，显著性分析结果以字母标记表示。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增与表达载体的构建

以Myxococcus sp.B6-1总DNA为模板，PCR扩增目的片段，0.75%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小为1 600 bp左右，符合预期（图1-A）。以一步克隆试剂盒构建表达载体pET-29a-MCTs，转化至E.coli DH5α，琼脂糖凝胶电泳验证（图1-B），重组质粒送湖南擎科生物科技有限公司测序。重组质粒转化至E.coli BL（DE3）构建表达菌株。

将MCTs氨基酸序列与已报道的海藻糖合酶序列以MEGA 5.5软件进行比较，泊松法1 000次校正，邻接法构建系统发育树。图2显示MCTs与来源于Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶TreSI^［9］相似性为92.36%，与来源于Enterobacter hormaechei的海藻糖合酶相似性为35.63%^［17］，来源于Pseudomonas stutzeri 的海藻糖合酶相似性为19.39%^［18］，与其他来源的海藻糖合酶相似性均在55%~67%。有意思的是，系统发育树显示粘细菌来源的海藻糖合酶与古细菌Picrophilus torridus^［19］，Acidiplasma sp.MBA1^［20］，Thermobaculum terrenum^［21］等的海藻糖合酶亲缘关系更近。来源于Pseudomonas stutzeri的海藻糖合酶在序列上与其他海藻糖合酶则有较大差异，单独归于一个分支。

序列分析结果表明，3个氨基酸残基Asp202-Glu244-Asp310分别位于3个高度保守的序列“DAVPYL” （202-207），“EANQ” （244-247）和“RNHDEL”（307-312）之中，构成活性中心（图3）。

将MCTs的氨基酸序列提交至alpha fold2，进行三维结构的预测，结果见图4。在PDB数据库中下载来源于Deinococcus radiodurans R1的海藻糖合酶DrTs（PDB.4TVU）^［22］的pdb文件，以PyMol软件进行比较。MCTs具有3个结构域，分别由Domain A（T107-P178）、Domain B（Q179-E481）和Domain C（G482-A551）构成。其中Domain B是催化结构域，具有和DrTs一样的典型的糖苷水解酶GH13家族的（α/β）₈桶状结构域（图4-A），活性中心3个氨基酸残基Asp202-Glu244-Asp310位于桶状结构域内（图4-B）。

2.2 重组酶诱导表达

将测序正确的重组质粒热激转化至E.coli BL21（DE3），表达菌株经0.2 mmol/L IPTG在16 ℃条件下诱导表达后，6 000 r/min离心10 min，收集菌体，以50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.5）重悬，超声破碎，12 000 r/min离心10 min，取5 μL上清液（约20 μg蛋白），进行SDS-PAGE电泳（图5）。图5显示经IPTG诱导表达后，重组酶rMCTs在E.coli BL21（DE3）内以可溶蛋白的形式大量表达。经Ni²⁺-NTA亲和层析，以含200 mmol/L 咪唑的PBS缓冲液（pH 7.5）洗脱后，重组酶rMCTs达到电泳纯标准，分子量在65 kU左右，经ExPasy在线软件预测，其等电点为5.48。

2.2 重组酶rMCTs的功能鉴定

以终浓度为1%的麦芽糖为底物，加入重组酶rMCTs充分反应12 h后，通过HPLC法鉴定反应产物成分，结果见图6。反应之前（图6-A）底物麦芽糖的保留时间为21.454 min，由于所购试剂纯度的不足，底物麦芽糖中含有部分葡萄糖（保留时间19.363 min）。反应12 h之后（图6-B），底物麦芽糖（保留时间19.243 min）的峰面积显著下降，同时出现一个保留时间为23.375 min的新峰，经与标准品对照，证实该峰为海藻糖。

2.3 重组酶rMCTs的催化特性

以麦芽糖为底物，对重组酶rMCTs的催化特性进行测定，结果见图7。重组酶rMCTs的最适反应pH为6.5（图7-A）；在pH为6.5条件下保存12 h稳定，在pH为6.0和pH为7.5条件下，残留酶活为最适pH保存条件的94%和97%，当pH为5.0和pH为8.0时，残留酶活分别为最适pH保存条件的63%和61%（图7-B）；重组酶rMCTs的最适反应温度为40 ℃，在35 ℃和45 ℃条件下反应，测得的酶活力分别为最大酶活力的80%和90%。在20 ℃条件下反应时，酶活力为40 ℃条件下反应的20%，在65 ℃条件下反应时，未检测到酶活（图7-C）；在pH6.5和40 ℃反应条件下时，测得的单位酶活力为105.6 U/（min·mg）。重组酶rMCTs对温度条件敏感，在60 ℃条件下保存1.5 h酶活力丧失，在30 ℃条件下保存4 h残留酶活为50%（图7-D）。

2.4 金属离子和化学试剂对重组酶rMCTs的影响

为了考察金属离子和化学试剂对重组酶rMCTs酶活的影响，在反应体系中加入不同的金属离子和化学试剂，以不添加任何试剂的反应组为对照，测定相对酶活，结果见表1。重组酶rMCTs活性受到Fe³⁺、Co²⁺、Cu²⁺的强烈抑制，在添加1 mmol/L这3种离子的情况下，酶活力仅为61.72%、48.09%和28.92%。Ca²⁺对酶活有轻微的激活作用，其相对酶活为113.43%，其余金属离子则对酶活无显著影响。

有机溶剂甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇等对重组酶rMCTs活性都有较强的抑制作用，SDS完全抑制海藻糖合酶rMCTs的活性，在加入EDTA的处理组中，残留酶活仅为25.66%。

3 讨论

海藻糖合成酶是一种很有前途的生物催化剂，可用于执行海藻糖的一步反应。海藻糖合成酶具有高的底物特异性和简单的麦芽糖转化反应，在海藻糖生产中有着广泛的应用。然而目前报道的海藻糖合酶数量有限，因此挖掘新的高活性高纯度产物的海藻糖合酶资源是实现工业化酶法制备海藻糖的重要策略。本研究从粘细菌Myxococcus sp.CYD-1基因组中鉴定了一个新的海藻糖合成酶基因（mCTs），并进行了基因克隆、异源表达和生化鉴定。

序列分析表明，MCTs与NCBI公共数据库中其他来源的海藻糖合酶序列相似性在19%~67%。MCTs与古细菌Picrophilus torridus，Acidiplasma sp.MBA1，Thermobaculum terrenum来源的海藻糖合成酶进化关系较为密切，与粘细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合成酶亲缘关系最近。然而，迄今为止，就我们所知，粘细菌来源的海藻糖合酶仅有一种被报道（TreSI）。氨基酸序列分析显示MCTs具有与其他来源的海藻糖合酶高度保守的基序“DAVPYL” （202-207），“EANQ” （244-247）和“RNHDEL”（307-312）以及三联体催化中心Asp202-Glu244-Asp310。蛋白质三维结构模拟显示MCTs具有3个结构域DomainA、DomainB和DomainC，其中催化结构域DomainB具有 （α/β）₈桶状结构域，是糖苷水解酶GH13的典型特征，这一特征也与已报道的海藻糖合酶结构相同。重组表达和纯化蛋白的SDS-PAGE分析确定了MCTs的分子量为65 ku，其大小与已报道的海藻糖合酶相似，均在61~66 ku范围之内。

本研究得到的重组酶rMCTs最适反应温度为40 ℃，且对热敏感，在已报道的海藻糖合酶中，除了来源于Thermus thermophilus ATCC33923 的海藻糖合酶TtTs最适反应温度为65 ℃外^［23］，其余的海藻糖合酶的最适反应温度均低于50 ℃。Zhu Y等^［23］研究表明，TtTs的C端比其他来源的海藻糖合酶多出500个氨基酸序列，C端的结构域对维持TtTs的热稳定性有较大影响。重组酶rMCTs和TreSI的序列相似性较高，但rMCTs的最适反应pH为6.5，而TreSI的最适反应pH为6.0，两者略有差异。rMCTs的比活力为105.6 U/mg，仅低于TreSI（170 U/mg）和TtTs（134 U/mg），远高于其他来源的海藻糖合酶如Enterobacter hormaechei（18.5 U/mg）^［17］，Deinococcus radioduransATCC 13939（82.5 U/mg）^［22］，Meiothermus ruber CBS-01（80 U/mg）^［24］，Corynebacterium glutamicum ATCC 13032（68 U/mg）^［25］等。在已报道的海藻糖合酶中，大多数的海藻糖合酶在催化反应的过程中，会产生副产物葡萄糖，对后期海藻糖纯化过程带来一定的困难^［9］。除TreSI和来源于Pseudomonas stutzeri CJ 38的海藻糖合酶外，其他的海藻糖合酶均有不同产量的葡萄糖生成^［9，18］。而本研究中，对酶反应产物的HPLC分析结果显示MCTs并未使葡萄糖的含量显著提高，说明MCTs的催化过程中，也不产生葡萄糖，预示着MCTs具有较高的应用潜力。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31560031)

江西省教育厅科学技术研究重点项目(GJJ2207001)