秦巴硒菇多糖（FA-2-b-β）联合表阿霉素对骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移及凋亡的影响

Effects of Agaricus blazei Murrill polysaccharide （FA-2-b-β） in combination with epirubicin on proliferation，migration and apoptosis of osteosarcoma MG63 cells

摘要

目的 探讨秦巴硒菇多糖（FA-2-b-β）联合盐酸表阿霉素（Epirubicin Hydrochloride，EPI）对骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移及凋亡的影响。 方法 采用MTT法测定FA-2-b-β、EPI和二者联合用药时对MG63细胞的抑制率，并根据金氏公式判断两药的协同效应，同时在倒置显微镜下观察细胞形态；划痕实验检测细胞增殖；DAPI染色及流式细胞术检测细胞凋亡；JC-1染色检测线粒体膜电位的变化；蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）和qPCR检测各组细胞PI3K、AKT、mTOR、Bax、Bcl-2、Capase-3的表达。 结果 FA-2-b-β、EPI及二者联合用药对MG63细胞的增殖均有抑制作用，联合用药组的增殖抑制作用更显著，具有协同效应；倒置显微镜可见联合用药组存活细胞数量减少，体积变大；与单一用药相比，联合用药时诱导MG63细胞凋亡、抑制细胞迁移和降低细胞线粒体膜电位的作用均更显著（P<0.05）；FA-2-b-β、EPI和二者联用给药均可上调Bax、Capase-3的表达（P<0.05），下调Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR的表达（P<0.05），联合用药组的作用更为显著（P<0.05）。 结论 FA-2-b-β联合EPI可协同抑制骨肉瘤MG63的增殖和迁移，并诱导凋亡，该作用可能与负向调控骨肉瘤MG63细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of Agaricus blazei Murrill polysaccharide (FA-2-b-β) combined with epirubicin (EPI) on the migration and apoptosis of osteosarcoma MG63 cells. Method The effects of FA-2-b-β and EPI on the proliferation of MG63 cells were determined by MTT colorimetric method，the synergistic effect of the two drugs was judged according to King's formula，and cell morphology was observed under an inverted microscope; scratch experiments to detect cell proliferation; DAPI staining and flow cytometry to detect apoptosis; JC-1 staining was used to detect the change of mitochondrial membrane potential; qPCR to detect the expression of PI3K，AKT，mTOR，Bax，Bcl-2，Capase-3 genes in each group; detection of the expression of PI3K，AKT，mTOR，Bax，Bcl-2，Capase-3 protein by Western blot. Result FA-2-b-β and EPI could significantly inhibit the proliferation of MG63 cells in a dose-dependent manner，the inhibitory effect of the combined drug group was more significant and had a synergistic effect. The inverted microscope showed that the number of surviving cells in the combined drug treatment decreased and the volume increased.The combined administration of FA-2-b-β and EPI could significantly induce apoptosis of MG63 cells，inhibit cell migration，and reduce the mitochondrial membrane potential of cells.FA-2-b-β，EPI and combined administration all groups upregulated the expressions of Bax and Capase-3 (P<0.05) and downregulated the expressions of Bcl-2，PI3K，AKT and mTOR (P<0.05)，and the effect of the combined administration group was more significant (P<0.05). Conclusion FA-2-b-β combined with EPI can synergistically inhibit the proliferation and migration of osteosarcoma MG63 cells and induce apoptosis，which may be related to the negative regulation of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in osteosarcoma MG63 cells.

Graphical abstract

关键词

骨肉瘤 / FA-2-b-β / 表阿霉素 / 凋亡 / 联合用药 / PI3K/AKT/mTOR通路

Key words

osteosarcoma / FA-2-b-β / epirubicin / apoptosis / combination therapy / PI3K/AKT/mTOR pathway

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是最常见的原发性骨肿瘤，好发于青少年，目前该病的治疗多以手术、化疗和放疗为主^［1］。EPI是骨肉瘤常用的化疗药物之一，但其应用往往受剂量相关毒性的限制^［2］，因此，在不降低疗效的前提下，减少化疗药物用量以降低其毒副作用，成了探索OS治疗的新方向。

近年来，联合化疗已被证明可以提高肿瘤治疗效果和减少副作用^［3］。天然多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝血和免疫刺激等广泛的生物学活性^［4-5］，有研究显示，与天然多糖联合可以提高环磷酰胺对肝癌和宫颈癌的治疗效果，并减少化疗引起的不良反应^［6-7］。FA-2-b-β来源于蘑菇科药食同源的食用菌秦巴硒菇，是一种具有生物学活性的蛋白多糖复合物^［8］，课题组前期研究发现FA-2-b-β不仅具有抗肿瘤活性^［9-10］，而且对叠氮胸苷的抗肿瘤活性有增敏作用^［11］，但FA-2-b-β与EPI联合抗肿瘤的作用目前相关研究及报道较少，因此，本研究主要探讨FA-2-b-β联合EPI对骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移和凋亡的影响，旨在为进一步开发新型的化疗辅助药物提供理论依据，同时为骨肉瘤的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人骨肉瘤MG63细胞购自上海富衡生物科技有限公司细胞库。秦巴硒菇多糖（FA-2-b-β）购自北京同仁堂科技发展成都有限公司；盐酸表阿霉素（EPI）、线粒体膜电位检测试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒、PVDF膜均购自北京索莱宝生物科技有限公司；DMEM培养基、0.25% Trypsin-EDTA购自美国gibco公司；Annexin V-APC/7-ADD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒购自中国Elabscience公司；TRIgent试剂购自中国Mei5bio公司；SYBY Green Pro Tar HS预混型试剂盒Ⅱ、Evo M-MLV反转录试剂盒及引物PI3K、AKT、mTOR、Bax、Bcl-2、Caspase-3、GAPDH购自艾科瑞生物科技有限公司；山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司；β-Actin、鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt购自美国Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组

MG63细胞常规复苏后，于37 ℃、5% CO₂培养箱孵育培养，2~3 d传代1次，取对数生长期细胞用于试验。根据课题组前期MTT筛选所测浓度，将试验分为Control、FA-2-b-β（2 mg/mL）、EPI（1 μg/mL）、FA-2-b-β（2 mg/mL）+EPI（0.5 μg/mL）共4组。

1.2.2 MTT试验

将对数生长期的MG63细胞（按3×10⁴个/孔）接种在96孔板中常规培养24 h，待细胞贴壁后，按照实验分组分别处理细胞，48 h后每孔加入100 μL MTT试剂，4 h后弃去MTT再加入100 μL DMSO试剂，避光震荡10 min，全自动酶标仪检测490 nm处各孔吸光度（A）值，每组设6个复孔。细胞存活率（%）=（试验组A₄₉₀值-空白对照组A₄₉₀值）/（阴性对照组A₄₉₀值-空白对照组A₄₉₀值）×100%；并根据金氏公式^［12］计算q值：q=E（A+B）/（EA+EA-EA×EB），其中EA、EB为各药单用时的抑制率，E（A+B）为两药联合时的抑制率，当q<0.85表示拮抗作用，q=0.8~1.15表示相加作用，q>1.15表示协同作用。试验独立重复3次。

1.2.3 划痕试验

将对数生长期的MG63细胞（按5×10⁵个/mL）接种到6孔板中，37 ℃、5% CO₂培养过夜，待细胞达到80%至90%后，弃去旧培养基，用干净的微量枪头垂直于板底部划痕，每孔至少穿过3条横线，用PBS清洗3次以去除划下的细胞，继续培养0、6、12、24、48 h时取样并在倒置显微镜下观察拍照。试验独立重复3次

1.2.4 DAPI染色试验

将对数生长期的MG63细胞（按3×10⁴个/孔）接种在96孔板中，37 ℃、5% CO₂培养过夜。按试验分组分别处理细胞48 h，用4%的多聚甲醛固定20 min，每孔加入DAPI染液100 μL，染色5 min后在荧光显微镜下观察并拍照。试验独立重复3次

1.2.5 流式细胞术

将各组细胞用磷酸盐缓冲液洗涤并重悬，1 500 r/ min离心5 min后，用AnnexinV -APC /7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒将细胞在室温、避光条件下染色15 min，并在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率，试验独立重复3次。计算总凋亡率（%）=早期凋亡（%）+晚期凋亡（%）。

1.2.6 JC-1染色试验

将对数生长期的MG63细胞（按5×10⁵个/mL）接种在6孔板中，培养24 h，按试验分组处理细胞48 h后，每孔加入JC-1染液250 μL并放置在37 ℃、5% CO₂下染色，20 min后在荧光显微镜观察并拍照。试验独立重复3次

1.2.7 qPCR试验

用TRIzol根据试剂说明从细胞中提取总RNA，使用Evo M-MLV反转录试剂盒将RNA逆转转录为互补cDNA；使用SYBR Green Pro Taq HS预混行qPCR试剂盒进行实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析，GAPDH作为目的基因的内参，采用2^-ΔΔCt方法检测mRNA（归一化为GAPDH）的相对表达水平，试验独立重复3次。试验所用引物序列见表1。

1.2.8 免疫印迹试验

根据实验分组处理细胞后，利用RIPA裂解液提取各组MG63细胞总蛋白，用BCA检测试剂盒对蛋白进行定量检测，用SDS-PAGE凝胶对蛋白进行分离，并转到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h后加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍，加入对应的二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，PBS洗3遍，最后用ECL化学发光特超敏试剂盒通过凝胶成像仪检测蛋白的表达水平，试验独立重复3次。密度测量值归一化到β-Actin水平，并使用ImageJ 1.48v软件进行分析。

1.3 统计分析

应用 SPSS 21.0软件进行统计分析，数据表示为\overline{x}\pm s，各组数据采用单因素方差分析，组间数据比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 FA-2-b-β和EPI联合抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖

用MTT法分别检测了FA-2-b-β、EPI及联合用药对MG63细胞的增殖抑制作用，结果如图1所示，与对照组相比，FA-2-b-β、EPI及联合用药处理后细胞存活率明显下降（P<0.05），其中联合用药组细胞存活率下降较单一用药更明显（P<0.05），当FA-2-b-β 2 mg/mL联合EPI 0.5 μg/mL作用48 h时，q值为1.18，表现为协同作用。

2.2 FA-2-b-β联合EPI对骨肉瘤MG63细胞形态和数量的影响

在显微镜下观察FA-2-b-β、EPI及联合用药处理48 h后MG63细胞的形态与数量变化，如图2所示，与对照组相比，FA-2-b-β、EPI及联合用药均使存活细胞数量减少，且细胞形态不同程度的发生了收缩、变圆、形状不均等变化，其中联合用药组变化更显著。

2.3 FA-2-b-β联合EPI抑制骨肉瘤MG63细胞的迁移

通过细胞划痕试验检测联合用药对MG63细胞迁移能力的影响，如图3所示，随着培养时间的增加，与对照组相比，FA-2-b-β和EPI组划痕愈合缓慢，与单独用药组相比，FA-2-b-β联合EPI组的划痕愈合速度最慢，划痕区域保持一定的宽度。

2.4 FA-2-b-β联合EPI降低骨肉瘤MG63细胞的线粒体膜电位

细胞凋亡的早期表现为线粒体膜电位的下降，在正常细胞中，JC-1以聚合物形式存在，产生红色荧光，线粒体膜电位降低后，JC-1成为单体，产生绿色荧光。如图4所示，对照组线粒体膜电位无明显变化，表现为红色荧光，与对照组相比，FA-2-b-β、EPI和联合用药组表现为红色荧光减弱，绿色荧光增强，且联合用药组变化最为显著，表明联合用药可显著降低MG63细胞的线粒体膜电位。

2.5 FA-2-b-β联合EPI促进骨肉瘤MG63细胞的凋亡

DAPI染色显示（图5-A），空白对照组细胞核染色较浅，亮度较低，呈现低浓度浅蓝色荧光，与对照组相比，EPI、FA-2-b-β及联合用药组均能不同程度引起细胞调亡，凋亡细胞的细胞核呈现高亮度的蓝色荧光，破碎严重，流式细胞仪定量验证（图5-B），FA-2-b-β、EPI及联合用药组的细胞凋亡率分别为46.0%、62.4%、92.7%。

2.6 FA-2-b-β联合EPI调控MG63细胞中PI3K/AKT/mTOR通路相关基因和凋亡相关基因的表达

PCR结果显示（图6），与对照组相比，FA-2-b-β、EPI和联合用药组均上调了Bax和Caspase-3基因的相对表达（P<0.05），下调了Bcl-2、PI3K、AKT和mTOR基因的相对表达（P<0.05），与单独给药组比较，联合给药组作用更显著（P<0.05）。

2.7 FA-2-b-β联合EPI调控MG63细胞中PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达

蛋白免疫印迹试验结果显示（图7），与对照组相比，FA-2-b-β、EPI和联合用药组均上调了Bax和Caspase-3蛋白的相对表达（P<0.05），下调了Bcl-2、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白的相对表达（P<0.05），使Bax/Bcl-2比值增大；与单药组相比，联合用药组作用更显著（P<0.05）。

3 讨论

骨肉瘤确诊时80%的患者已有微小转移灶，致死率和致残率极高，传统的化疗药物在缓解疾病的同时有较严重的毒副作用，长期使用容易产生耐药性^［13-14］，因此探索有效且低毒性的治疗方案是十分必要的。秦巴硒菇多糖作为一种功能性食品的天然产物，本身具有安全和毒性小的优势，因此其可成为肿瘤联合治疗的候选药物之一，课题组前期已经探讨了其多糖复合物FA-2-b-β的抗肿瘤药效学与分子生物学机理^［11］，也研究证明了FA-2-b-β对非小细胞肺癌A549细胞和白血病K562细胞的增殖具有明显的抑制作用^［15-16］，同时本研究也发现FA-2-b-β联合EPI组可显著抑制MG63细胞的增殖，显微镜下观察到FA-2-b-β联合EPI组存活细胞数量明显减少，且细胞收缩、变圆、形状不均等形态变化最显著，细胞划痕愈合速度也明显比单独用药缓慢。此外，研究显示线粒体膜电位的下降是线粒体损伤的标志，也是细胞发生凋亡的早期表现^［17］，本研究发现联合用药组MG63细胞的线粒体膜电位比单独用药组下降更明显，表明线粒体损伤更严重。以上研究结果均表明，FA-2-b-β联合EPI可抑制MG63细胞的增殖与迁移，并诱导其凋亡。

凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，主要有线粒体依赖和非线粒体依赖两种途径^［18］，Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的重要调控因子，包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2，线粒体依赖途径的凋亡主要是在Bcl-2和Bax的参与下改变线粒体膜的通透性，释放细胞色素C，从而诱导半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的活化并激活下游的效应分子引起细胞的凋亡，所以Bax/Bcl-2比值的变化反应了凋亡的程度^［19］，另外，半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，活化的Caspase-3有助于线粒体依赖凋亡通路的激活^［20］。本研究结果显示，联合用药可上调MG63细胞Bax和Caspase-3蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达，使Bax/Bcl-2比值升高，表明细胞凋亡作用增强。综上，EPI联合FA-2-b-β可通过激活线粒体依赖凋亡通路进一步诱导MG63细胞的凋亡。

PI3K/AKT/mTOR通路作为人体中重要的信号通路之一，可通过调控下游蛋白的表达，参与细胞的增殖和凋亡^［21］。在PI3K/AKT/mTOR级联反应中，AKT被PI3K激活后进一步增加mTOR的磷酸化水平，促进肿瘤细胞增殖和恶性转化，抑制肿瘤细胞凋亡^［22］，据报道，PI3K/AKT/mTOR信号通路在骨肉瘤中被反复过度激活，并与肿瘤细胞的发生、增殖、侵袭和进展等紧密相关^［23-24］。为了进一步验证EPI联合FA-2-b-β诱导MG63细胞凋亡与PI3K/AKT/mTOR信号通路的联系，本研究检测了PI3K/AKT/mTOR通路相关基因和蛋白的表达，结果显示，EPI与FA-2-b-β联合用药可显著下调MG63细胞PI3K、AKT和mTOR基因及p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白的表达水平，这表明联合用药时MG63细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制作用更明显，进而抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡的作用也更显著。

4 结论

综上所述，EPI联合FA-2-b-β具有协同抗肿瘤效应，初步探讨其机制可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而进一步抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，因此FA-2-b-β有可能成为与EPI联合治疗骨肉瘤的理想辅助药物之一，但其具体机制仍需进一步研究。

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基金资助

甘肃省自然科学基金项目(20JR10RA393)

甘肃省自然科学基金项目(20JR10RA376)

甘肃省卫生行业科研计划资助项目(GSWSKY-2019-23)