BTH诱导马铃薯块茎愈伤早期活性氧的产生

The elicitation of reactive oxygen species by BTH at early stage of wound healing of potato tubers

摘要

目的 研究苯丙噻二唑（BTH）处理对马铃薯愈伤早期活性氧产生的影响。 方法 用100 mg/L BTH处理模拟损伤的大西洋马铃薯块茎，测定BTH处理后不同时间块茎伤口处胞内钙离子浓度、活性氧产生关键酶的基因表达量和活性及超氧阴离子和过氧化氢含量。 结果 BTH处理增加了愈伤早期马铃薯块茎伤口处组织的胞内Ca²⁺浓度，促进了StCDPK14的表达，提高了CDPK活性。BTH显著上调了Strbohs家族成员的表达，StrbohA在4 h时达到峰值，StrbohB、StrbohC、StrbohD和StrbohH在8 h时达到峰值。BTH还显著上调了StSODs家族成员的表达，StCSD1表达量随着处理时间的延长而升高，其余成员在8 h时达到峰值。由于Strbohs和StSODs的上调表达，明显促进了块茎伤口处O₂^·-和H₂O₂的产生。 结论 BTH可通过提高胞内钙浓度来激活CDPK，CDPK进一步激活Strbohs和StSODs促进活性氧的产生。

Abstract

Objective The study aimed to explore the effect of benzo （1，2，3）-thiadiazole-7-carbothioic acid （BTH） treatment on reactive oxygen species （ROS） production at wounds of potato tubers during early stage of healing. Method The wounded potato tubers （cv.Atlantic） were treated with 100 mg/L BTH，followed by determining intracellular calcium ion concentration，gene expression and activities of key enzymes for reactive oxygen species production，and superoxide anion and hydrogen peroxide content in the tuber wounds at different time after BTH treatment. Result The concentration of intracellular Ca²⁺ increased after BTH treatment.Meanwhile，BTH promoted the expression of StCDPK14 and enhanced the calcium-dependent protein kinases （CDPK） activity in the wounds of potato tubers.BTH significantly upregulated the expression of Strbohs family members，StrbohA peaked in 4 h after treatment，and StrbohB，StrbohC，StrbohD and StrbohH peaked in 8 h.BTH also significantly upregulated the expression of StSODs family members，and the expression of StCSD1 increasing with the extension of BTH treatment time，and the rest members peaked in 8 h after treatment.The upregulated expression of Strbohs and StSODs led to a remarkable increase in the contents of O₂^·- and H₂O₂ in the wounds. Conclusion BTH treatment could activate CDPK activity by increasing intracellular calcium concentration，which further upregulated Strbohs and StSODs expressions，promoting reactive oxygen species production at early stage of healing.

Graphical abstract

关键词

马铃薯块茎 / 苯丙噻二唑 / 钙依依赖蛋白激酶 / Strbohs / StSODs

Key words

potato tubers / benzo-（1，2，3）-thiadiazole-7-carbothioic acid / CDPK / Strbohs / StSODs

过氧化氢（H₂O₂）在马铃薯愈伤中具有重要作用，早期产生的H₂O₂作为信号分子调控与愈伤相关的反应，中后期产生的H₂O₂则主要参与愈伤组织形成的氧化交联^［1］。马铃薯愈伤期间所需的H₂O₂主要来源于NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）^［2］。NOX的上游元件钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPK）先感受钙信号，通过磷酸化NOX产生超氧阴离子（O₂^·-），后者被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）歧化为较为稳定的H₂O₂^［3］。苯并噻二唑（Benzo （1，2，3）-thiadiazole-7-carbothioic acid，BTH）是水杨酸（SA）类似物，也是第一个人工合成的化学诱抗剂，BTH诱导的果蔬采后抗病性与其促进H₂O₂的产生密切相关^［4］。BTH可显著上调火龙果果实的HuSOD1表达，增加SOD活性，提高贮藏初期的H₂O₂水平^［5］。BTH还可促进芒果果实O₂^·- 和H₂O₂的积累^［6］。BTH通过提高桃和草莓果实的SOD活性，促进H₂O₂的积累^［7-8］。BTH可提高蓝莓果实贮藏早期的SOD活性，显著增加H₂O₂的含量^［9］。前期研究发现，BTH可提高愈伤期间甜瓜果实的 NOX和SOD活性，并促进O₂^·-及H₂O₂的积累，使用NOX的专一性抑制剂二苯碘处理会抑制伤口处O₂^·-和H₂O₂的产生^［10］。BTH还可增加马铃薯块茎愈伤期间的NOX和SOD活性以及H₂O₂含量^［2］。近期发现，BTH显著上调了马铃薯块茎愈伤14 d内StCDPKs家族成员的表达，处理4 h与72 h时伤口处胞内钙离子的荧光强度显著增强^［11］。尽管已有BTH提高块茎愈伤期间伤口处胞内钙离子浓度，上调StCDPKs各家族成员表达的报道，但BTH处理对马铃薯块茎愈伤早期（24 h内）胞内钙浓度和CDPK活性，以及StRbohs和StSODs成员表达和O₂^·- 及H₂O₂积累的影响还未见报道。本研究用BTH处理模拟损伤的大西洋马铃薯块茎，测定愈伤早期块茎伤口处组织钙离子浓度，分析StCDPK14表达量和CDPK活性，以及Strbohs和StSODs家族成员基因表达水平，测定H₂O₂和O₂^·- 含量，结果可丰富马铃薯块茎愈伤早期的活性氧产生机理。

1 材料与方法

1.1 材料

供试大西洋马铃薯（Solanum tuberosum L.cv.Atlantic）块茎购自甘肃省定西市渭源县爱兰马铃薯种业有限公司。选取外观良好、大小一致、无病虫害且无机械损伤的马铃薯块茎装入网袋，24 h内运至实验室后于室温下（20~25 ℃，RH 70%~80%）贮藏待用。苯丙噻二唑（BTH）购自Sigma公司，有效浓度为98%。用蒸馏水配制成100 mg/L的BTH溶液待用。

1.2 方法

1.2.1 人工损伤及BTH处理

块茎经清水清洗后，用2%的次氯酸钠浸泡3 min，晾干后用不锈钢刀对半切开。用 100 mg/L BTH浸泡已损伤块茎3 min，取出自然晾干后于常温（20~25 ℃，RH70%~80%）黑暗条件下贮藏^［12］。以蒸馏水处理作对照。

1.2.2 取样

在BTH处理后的第0、4、8、12和24小时，用不锈钢刀片垂直块茎伤口表面取2~3 mm深的伤口组织，液氮冷冻后立即用研磨机（IKA A11 basic型，德国）研成粉末，装入50 mL的离心管中，于-80 ℃下保存待用^［12］。 每个马铃薯块茎取样2个伤口，每个伤口取样0.3 g，共用150个块茎。

1.2.3 胞内Ca²⁺浓度测定

参照上海铭博生物科技有限公司Fluo-3-AM试剂盒说明书进行测定。取1 g 冷冻粉末，加1 mL预冷的裂解液，研成匀浆，在4 ℃，5 000 g下离心10 min，小心移出上清液待测。设置样品孔、标准孔、空白对照孔于黑色96孔板，分别加入100 μL上清液、100 μL标准液和100 μL阴性液。在所有孔中加入100 μL含有特异性 Ca²⁺ 酯化型探针 Fluo-3-AM（5 μmol/L）的反应液，室温（22 ℃）下避光孵育30 min后立即使用多功能酶标仪（Bio Tek Synergy^TM H1型，美国）检测钙离子相对荧光强度（relative fluorescence unit，RFU）变化，激发波长和发射波长分别为485 nm和520 nm。Ca²⁺ 浓度以 μmol/L表示。

1.2.4 活性氧产生关键基因表达量分析

Rboh相关基因的选择依据Jiang等^［11］在损伤马铃薯块茎中，Strbohs 6个成员上调表达的结果。SOD基因的选择依据任映月等^［13］在损伤马铃薯块茎中，StSODs家族成员鉴定的结果。

1.2.4.1 RNA的提取

取100 mg冷冻粉末于1.5 mL离心管中，依照TIANGAN 生物科技公司TRNZOL法提取。

1.2.4.2 cDNA合成与引物设计

以提取的总 RNA 为模板，通过 cDNA 合成试剂盒（美国MCE生物科技公司）进行第一链 cDNA 的合成。在RNase-free PCR管中依次加入：2 μL 5×gDNA digester Buffer，1 μL gDNA digester，1 ng总RNA，加RNase-free dd H₂O₂至10 μL，42 ℃孵育（恒温培养箱，SPX-30085H-II 型，上海新苗医疗器械制造有限公司，中国）5 min。然后再加入10 μL 2× Super RT Mix，用移液器轻轻吹打混匀，之后置于 PCR 扩增仪（BIO-RAD S 1000型，上海奥陆生物科技有限公司，中国）中，在25 ℃孵育5 min，42 ℃孵育42 min，再85 ℃孵育2 min 后终止反应。反应结束后置冰上冷却，于-20 ℃保存。引物设计如表1所示。

1.2.4.3 实时荧光定量PCR

将cDNA模板稀释100倍进行检测。在冰浴条件下建立PCR体系：10 μL 终浓度为1×的2×SYBR Green Mix （Low Rox），0.4 μL 终浓度为 0.2 μmol/L的Forward Primer（10 μmol/L） 0.4 μL 终浓度为 0.2 μmol/L 的 Reverse Primer（10 μmol/L），2 μL cDNA模板，7.2 μL RNase-free ddH₂O。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 cycle；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1 cycle。完成上述操作后，将样品加入 96 孔板放在 LightCycler®96 SW 1.1 中进行反应。基因相对表达量的计算根据公式 2^{-△△C（T）}进行^［14］。

1.2.5 CDPK活性测定

钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPK）活性测定采用上海古朵生物科技有限公司的酶联免疫吸附（ELISA）法。往预先包被钙CDPK抗体的包被微孔中，依次加入样本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤后用酶标仪（1510型，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司，中国）在450 nm 波长下测定吸光度，以每分钟450 nm 处吸光度值变化0.01为1个酶活力单位（U），CDPK活性表示为U/mg prot。

1.2.6 O₂·^-和H₂O₂含量测定

超氧阴离子（O₂·^-）和H₂O₂ 含量的测定分别参照Wu等^［15］和Zhang等^［16］的方法并作一定修改。分别在530 nm和410 nm下测定吸光度值，O₂·^- 和H₂O₂含量均以 μmol/g FW表示。

1.3 数据统计

上述所有基因表达分析和生化测定至少重复3次，用Microsoft Excel 2010 计算平均值和标准误（±SE）。用SPSS19.0进行Duncan’s 多重差异显著性分析（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 BTH处理提高了愈伤早期块茎伤口处组织的胞内Ca²⁺浓度

Ca²⁺是植物体内重要的第二信使，同时也是CDPK的激活剂^［17］。愈伤早期，BTH处理后块茎伤口处组织的胞内Ca²⁺浓度迅速升高，4 h时达到峰值后逐渐降低，12 h后又再次升高。对照块茎伤口处组织的胞内Ca²⁺浓度呈单峰型变化，4 h时达到峰值。处理块茎的胞内Ca²⁺浓度显著高于对照（图1）。上述结果表明，BTH处理显著提高了愈伤早期马铃薯块茎伤口处组织的胞内Ca²⁺浓度。

2.2 BTH处理提高了愈伤早期块茎伤口处StCDPK14表达量及CDPK活性

CDPK是一种丝氨酸/苏氨酸特性的蛋白激酶，可直接被Ca²⁺激活^［18］。愈伤早期，BTH处理和对照伤口处的StCDPK14表达量先迅速升高，8 h时达到峰值，后急速降低，12 h后再升高。除12 h外，处理块茎的表达量显著高于对照，在8 h和24 h时分别高出对照31.3%和73.2%（图2-A）。愈伤早期，处理和对照块茎伤口处的CDPK活性变化与StCDPK14的变化趋势基本一致，处理块茎的CDPK活性显著高于对照，8 h和24 h时分别高出对照31.1%和12.6%（图2-B）。上述结果表明，BTH处理上调了愈伤早期块茎伤口处的StCDPK14的表达水平，显著提高了CDPK活性。

2.3 BTH处理上调了愈伤早期块茎伤口处StRbohs的表达量

Rboh 是CDPK的下游元件，参与O₂·^- 的产生，马铃薯StRbohs共有6个成员。愈伤早期，BTH处理和对照块茎伤口处StrbohA和StrbohB的表达量均呈双峰型变化，除12 h外，处理块茎StrbohA和StrbohB的表达量均显著高于对照（图3-A，3-B）。处理和对照块茎伤口处的StrbohC和StrbohD表达量均呈单峰型变化，峰值均出现在8 h，处理块茎的StrbohC和StrbohD表达量显著高于对照，8 h时分别高出对照43.3%和10.5%（图3-C，3-D）。处理和对照块茎伤口处的StrbohE 和StrbohH的表达量均迅速升高至8 h后急速降低，除4 h处理块茎的StrbohE高出对照外，其他时间点处理与对照块茎间无显著差异（图3-E）。处理块茎的StrbohH在4 h和8 h处显著高于对照（图3-F）。上述结果表明，BTH处理上调了马铃薯块茎愈伤早期的Strbohs表达，其中对StrbohA、StrbohC和StrbohH的上调作用更为明显。

2.4 BTH处理上调了愈伤早期块茎伤口处StSODs的表达量

SOD是唯一可将O₂^·- 歧化为H₂O₂的酶，马铃薯StSODs共有8个成员。愈伤早期，BTH处理和对照块茎的StCSD1表达量均逐渐升高，除24 h外，处理块茎的StCSD1表达量均显著高于对照（图4-A）。处理和对照块茎的StCSD2表达量先升高后迅速降低再略有升高，除12 h外，处理块茎的StCSD2表达量均显著高于对照，8 h时处理高出对照20.5%（图4-B）。处理和对照块茎的StCSD3、StFSD1和StMSD的表达均呈单峰型变化，峰值出现在8 h。除24 h外，处理的表达量显著高于对照，峰值时分别高出对照26.3%、65.4%和39%（图4-C，4-E，4-H）。处理和对照块茎伤口处的StCCS和StFSD3均呈先升高后降低的趋势，均在愈伤前8 h有显著表达，且8 h时达到峰值（图4-D，4-G）。此外，处理和对照块茎伤口处StFSD2的表达呈单峰型变化，且在愈伤8 h和12 h时显著高于对照（图4-F）。上述结果表明，BTH处理可上调愈伤早期StSODs家族成员的表达，其中对StCSD1、StCSD2 、StFSD1和StMSD表达的上调作用更为显著。

2.5 BTH处理提高了愈伤早期块茎伤口处O₂·^-和H₂O₂的含量

O₂·^- 由NOX转移电子产生，而产生的O₂·^- 很快被SOD歧化为H₂O₂。愈伤早期，处理和对照块茎伤口处的O₂·^-含量先迅速升高，后下降再上升，处理显著高于对照（图5-A）。处理和对照块茎伤口处的H₂O₂含量均逐渐升高，处理的H₂O₂含量显著高于对照，24 h高出对照63.05%（图5-B）。上述结果表明，BTH促进了愈伤早期马铃薯块茎伤口处O₂·^-和H₂O₂的积累。

3 讨论

Ca²⁺ 信号作为第二信使，在植物生长发育和响应逆境胁迫方面扮演着重要角色^［17］。机械损伤、干旱及盐胁迫均会引发植物细胞产生Ca²⁺信号，随后激活胞内各种钙离子传感器（Ca²⁺ sensors），使其对外界刺激产生的特异性 Ca²⁺信号进行识别，诱导H₂O₂产生并引起下游的一系列防卫反应^［19］。当植物细胞受到各种生物或非生物胁迫时，胞外Ca²⁺可通过细胞膜上的Ca²⁺通道内流进入细胞质^［20］，从而使胞质内Ca²⁺浓度升高。1，4，5-三磷酸肌醇（IP₃）途径是植物细胞内钙信号产生的主要途径，它通过与细胞内质膜上依赖 IP3 的钙通道蛋白结合而打开钙通道，促进Ca²⁺内流^［21］。本研究发现，BTH处理后马铃薯块茎伤口处Ca²⁺浓度显著升高（图1），该结果与BTH处理马铃薯块茎导致胞质中Ca²⁺荧光强度迅速增加的结果类似^［11］。研究表明，ATP可通过G蛋白偶联途径激活IP₃，且ATP水平越高，IP₃越容易被激活^［22］。由于BTH可提高苹果果实的ATP水平^［23］，因此，推测BTH可能通过提高ATP水平来激活IP₃，从而导致胞内Ca²⁺浓度升高。CDPK是钙调节信号级联反应的关键枢纽，具有钙离子结合蛋白共有的EF-hand 结构域，其活性可在结合钙离子后被激活^［18-24］。本研究发现，BTH处理后，马铃薯块茎伤口处StCDPK14在愈伤早期的表达量显著升高，同时CDPK的活性也显著增加（图2），该结果与BTH处理上调马铃薯块茎伤口处StCDPKs表达的结果类似^［11］。研究发现，钙的内流可激活其下游CDPK活性，CDPK进一步磷酸化下游转录因子^［25］。据此认为，BTH处理通过增加块茎伤口处胞内钙浓度来激活CDPK。

NOX也可称为呼吸爆发氧化酶同系物 （Respiratory burst oxidase homologue，Rboh） ，是植物产生活性氧的关键酶系^［26］。Rbohs是CDPK的下游调控元件，马铃薯CDPK可直接磷酸化Rbohs，导致O₂^·-的产生^［3］。本研究发现，BTH处理后，块茎伤口处Strbohs各成员迅速上调表达（图3）。有研究表明，定位于细胞质膜的Strboh A可通过氧化爆发诱导的伤口愈合来提高马铃薯块茎的抗性，它介导了块茎损伤后O₂·^- 的最初生成，当Strboh A基因缺失时，块茎的愈伤形成能力会下降^［27］。此外，过表达StrbohC可促进O₂·^- 的积累，提高马铃薯块茎对非生物胁迫的抗性^［28］。本研究结果显示，BTH显著提高O₂^·- 的含量（图5-A），该结果与前期在马铃薯愈伤7 d内观察到的结果类似。因此认为，BTH激活的CDPK通过与Rbohs磷酸化促进了O₂·^-的产生。

SOD是一种H₂O₂合酶，在植物中促进O₂·^- 催化转化为H₂O₂^［29］。本研究发现，BTH处理后马铃薯块茎伤口处组织的H₂O₂含量升高（图5-B），同时StSOD家族成员明显上调（图4），该结果与BTH处理火龙果果实的研究结果类似^［5］。StSODs启动子区富含ABA响应元件^［13］，表明StSOD基因可能是ABA信号通路中直接受关键转录因子调控的下游基因^［30-31］。转录组结果显示，BTH还可促进愈伤早期ABA的合成，ABA可上调ABA信号通路下游ABF转录因子来直接与SOD基因启动子序列结合，从而促进SOD的基因表达^［32］。因此，推测BTH可能通过促进ABA的合成和信号传导来上调StSODs，导致了伤口处H₂O₂含量的提高。

4 结论

BTH处理增加了愈伤早期（24 h内）马铃薯块茎伤口处组织的胞内Ca²⁺浓度，促进了StCDPK14的表达，提高了CDPK活性。BTH还显著上调了Strbohs和StSODs家族成员的表达，促进了O₂·^-和H₂O₂的形成。BTH对马铃薯块茎愈伤早期活性氧产生的显著作用，可为今后研究BTH诱导其他作物活性氧产生所借鉴。

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基金资助

国家自然科学基金中以国际合作与交流项目(31861143046)