不同高温天频率对截形叶螨体内糖类物质含量变化的影响

Effect of different frequencies of high-temperature days on saccharides content in Tetranychustruncatus

摘要

目的 明确截形叶螨不同品系应对高温时的生理机制。 方法 采用生理生化法，研究不同高温天频率（高温天数∶常温天数）1 d∶3 d、2 d∶2 d、3 d∶1 d胁迫后，截形叶螨敏感品系（SS）和抗哒螨灵品系（Py-R）不同发育阶段体内糖类物质含量的变化。 结果 经历不同高温频率后，随着高温天数的增加，截形叶螨抗哒螨灵品系（Py-R）在卵期和成螨期体内可溶性糖含量呈现先上升后下降的趋势，在若螨期一直呈下降趋势，而敏感品系正好与之相反；但是两个品系的海藻糖含量呈上升趋势。而且，在卵期阶段，糖类物质的增幅和降幅最大，成螨期最小，若螨期介于二者之间，但抗哒螨灵品系在成螨期的增幅最小，变化最为平缓。此外，抗哒螨灵品系（Py-R）体内的糖物质含量上升速率显著高于敏感品系（SS）。 结论 截形叶螨在高温胁迫下，通过积累其体内的含糖物质，提高了自身的耐热性，且抗哒螨灵品系对高温的适应性要高于敏感品系。

Abstract

Objective The study was conducted to clarify the physiological mechanism of different strains of Tetranychustruncatus to cope with high temperature. Method After the stress of different frequencies of high-temperature days，that is，the high-temperature days：normal days were 1 d∶3 d，2 d∶2 d，and 3 d∶1 d，the changes of carbohydrates contents in the T.truncates-sensitive strains （SS） and pyridaben-resistant strains （Py-R） at different developmental stages was determined by using the physiological and biochemical methods. Result After different high-temperature stress，the soluble sugar content of pyridaben-resistant strains were increased firstly and then decreased at egg and adult stages with the increased high-temperature days，but decreased all the time at nymphs stage，while it was the opposite for the sensitive strain.The trehalose content of both strains showed an upforward trend.Moreover，the change of the content of carbohydrates was the largest at the egg stage，the least at the adult stage，and medium at the nymph stage.The pyridaben-resistant strain had the smallest increase at the adult stage and the change was most gently.In addition，the rate of glucose content increase in the pyridaben-resistant strain（Py-R） was significantly faster than that in the sensitive strain（SS）. Conclusion Under high temperature stress，T.truncatus could improve its own heat tolerance by accumulating sugar-containing substances in its body，and the adaptability of pyridaben-resistant strains to high temperature was higher than the sensitive strains.

Graphical abstract

关键词

截形叶螨 / 高温频率 / 可溶性糖 / 糖原 / 海藻糖

Key words

Tetranychustruncates / frequency of high temperature / soluble sugar / glycogen / trehalose

截形叶螨（Tetranychustruncatus Ehara），又称棉红蜘蛛、棉叶螨，属叶螨科（Tetranychidae），是农业上一类重要的害螨^［1］。发生面积广、发生速度快、危害时间长。其寄主广泛，主要在玉米、蔬菜、豆类、棉花、甘薯、果树以及花卉上为害^［2-3］。甘肃省张掖地区是全国最大的杂交玉米生产基地，夏季昼夜温差大，截形叶螨已成为主要害螨，对玉米的质量和产量造成了很大损失。目前，截形叶螨的防治主要以化学防治为主，但是截形叶螨对目前市面上多数常用杀虫剂已产生抗性。

叶螨属于变温动物，环境温度的变化直接影响叶螨的新陈代谢速度，从而对其生长、发育、生殖、遗传、分布和行为起重要作用。当温度起伏过大时，超过或低于叶螨生长的适宜温度，昆虫的生命特征以及活动迹象就会受到严重的影响。杨帅等^［4］研究发现，土耳其斯坦叶螨和截形叶螨在受到高温逆境的影响后，两种叶螨的卵和幼螨在38~46 ℃下处理2~6 h，其存活率随着温度和处理时间的增加而降低，后续发育历期随着温度和处理时间的增加而延长。杨丽红等^［5］研究了高温胁迫对柑橘全爪螨存活及生殖的影响，随着胁迫温度的升高和胁迫时间的延长，雌成螨的寿命显著缩短，产卵量显著下降。

目前，大多数研究仍以揭示不同恒温下不同种类的昆虫生长发育、繁殖和存活等生命表参数变化为主。但生物在自然环境中很少经历这种恒温的作用。自然界温度具有在时间上和空间上的高度规律性变化，如温度的昼夜节律性变化和季节的周期性变化^［6］。而气候变暖导致极端天气发生频率升高、高温天数延长和日最高温度升高^［7-8］。那么生活在自然环境中的昆虫必然会受到周期性重复发生的高温天变化的影响，并且随周期性连续高温天数增多，许多昆虫的生殖率、存活率以及体内物质会随之变化。

在高温胁迫下，昆虫一般通过增加体内抗逆物质的含量以提高自身对温度的耐受力。糖类物质作为昆虫体内主要的能源物质之一，具有广泛的生物活性。随着温度变化，昆虫体内的糖物质也会经历一系列降解而释放大量的能量，供昆虫生命活动的需要。可溶性糖是高温胁迫诱导的小分子溶质之一，其种类主要包括葡萄糖、蔗糖等。这些可溶性糖能减缓由胁迫造成的生理代谢不平衡，细胞大量积累一些小分子有机化合物，可以通过渗透调节来维持细胞的正常生理功能。而昆虫体内的糖类大多数以多糖（糖原和海藻糖）的形式存在。糖原主要存在于骨骼肌和肝脏，通过激素和底物的控制来进行贮存和消耗，调节酶的活性使其参与合成及降解的过程。当酶失去活性后，糖原代谢不正常，会造成昆虫行为活动降低等现象。而海藻糖主要存在于血淋巴中，具有稳定蛋白的功能^［9-10］。当昆虫受到高低温胁迫时，海藻糖不仅可以作为蛋白质稳定剂起到保护作用^［11］；同时细胞内的海藻糖含量有不同程度的上升^［12-13］，能提高细胞的耐热性，增强对逆境的适应能力。

实验室前期研究发现，不同高温天频率和短时高温，对截形叶螨抗药性品系（Py-R）和敏感品系（SS）不同螨态的发育历期、成螨期的产卵量和繁殖力有显著影响，且抗性品系对高温的耐受性显著高于敏感品系，即叶螨抗性品系存在高温适合度优势现象。因此本文在前期研究基础上，测定了不同高温天频率对截形叶螨抗性和敏感两个品系体内可溶性糖、糖原、海藻糖等抗逆物质含量的影响，研究截形叶螨不同品系在高温胁迫下的生理变化规律，为后续探究截形叶螨适应高温的生理机制奠定一定的理论基础，并为截形叶螨的有效治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

截形叶螨（Tetranychustruncatus Ehara）：敏感品系（SS）：从未接触农药的玉米地采集后，饲养在实验室新鲜的菜豆苗上（温度25 ℃、湿度70%）；抗哒螨灵品系（Py-R）：从敏感品系中分出截形叶螨一部分，然后用哒螨灵药剂进行汰选，浓度保持在杀死种群70%左右个体的剂量，抗性指数（resistant index RI）达到17.81，视为抗哒螨灵品系（温度25 ℃、湿度70%）。

1.2 日最高和最低温度设计

结合截形叶螨为害季节的温度情况，进行人工模拟温度研究。根据中国气象数据共享服务网http：//cdc.cma.gov.cn/home.do下载的2015~2021年张掖地区（E 100°26′，N 38°55′）夏季（7~8）月的日平均温度与日最高和最低温度数据，选择38 ℃和18 ℃作为高温天最高和最低温度，选择25 ℃和18 ℃为常温天气的日最高和最低温度。参考农田温度变化情况，将每天最高温时间选定为下午14点，最低温时间选定在每天凌晨3点。然后按照以上温度方案，采用渐变温度模式，使用正弦曲线设定每日内每小时的温度变化。试验过程中，采用两个人工气候箱分别模拟高温和常温的变温过程。室内的相对湿度控制在40%~60%。光周期设置为14 L∶10 D，每天05∶00~19∶00为光照阶段，19∶00~05∶00为黑暗阶段。

1.3 高温天频率模式设计

本研究是基于中期时间尺度下高温的变化^［14］，考虑到截形叶螨不同螨态的发育历期，所以周期天数设定为4 d，并选用了周期天数相同，高温天数增加、正常天数相应减少的自然界可能存在的模式进行研究。表1是基于上述温度模式下，高温天连续天数和正常天连续天数可能的组成比例。以18~25 ℃为对照。分别对各螨态进行1∶3、2∶2、3∶1 3个频率的处理，每个处理循环一次。

为保证试螨龄期的一致性，挑取一批雌成螨让其产卵24 h后，挑出雌成螨，从卵期采用叶碟法进行饲养。

1.4 糖类物质含量测定

可溶性糖和海藻糖含量测定参照郭苏帆^［15］的方法，糖原含量测定参照仵均祥等^［16］的方法，部分进行了修改，具体步骤如下。

1.4.1 样品处理

把截形叶螨敏感品系SS和抗性品系Py-R不同螨态分别放在不同高温天频率1∶3、2∶2、3∶1中处理挑取160头处理过的卵、若螨、雌成螨放入1.5 mL离心管中称质量，加入50 μL 10%三氯乙酸后，用研磨棒充分研磨至匀浆，后用700 μL 10%三氯乙酸分2次冲洗研磨棒，在离心机上4 ℃ 10 000 r/min离心15 min，得到待测上清液样品。

1.4.2 可溶性糖含量测定

取200 μL待测液放入1.5 mL的离心管中，加入800 μL 0.2%的蒽酮试剂，摇晃均匀，置于沸水浴中10 min，后流水下至冷却放入25 ℃的恒温箱中20 min。最后取200 μL待测液放入96孔酶标板，在全波酶标仪（BioTek Instruments，Inc）上测定波长为630 nm的D值，每个处理重复3次，根据葡萄糖标准曲线计算该样品的可溶性糖含量。

1.4.3 糖原含量测定

将1.4.1的上清液转移到另一个离心管中，用50 μL 10%三氯乙酸提取1次剩下的沉淀后，合并上清液最后加入1 mL的无水乙醇，放在4 ℃冰箱中保存17 h，次日在4 ℃离心机上10 000 r/min下离心20 min，（此时的上清液用于海藻糖测定），再次使用500 μL的蒸馏水使沉淀得到充分溶解。重复1.4.2的步骤。

1.4.4 海藻糖含量测定

从1.4.3取50 μL海藻糖上清液与1.5 mL的离心管中，先后加入1% H₂SO₄ 50 μL，摇晃均匀后，置于90 ℃的水浴锅中10 min，冰水浴3 min；再次加入50 μL 30% KOH，充分摇匀后90 ℃水浴锅10 min，冰水浴3 min；各待测样品最后加入1 000 μL 0.2%蒽酮试剂，最后一次放入90 ℃水浴锅10 min，冰水浴冷却3 min。将200 μL待测液转入96孔酶标板中，在全波酶标仪（BioTek Instruments，Inc）上测定波长为630 nm的D值，每个处理重复3次，根据海藻糖标准曲线计算该样品的海藻糖含量。

1.5 糖标准曲线制作

1.5.1 葡萄糖标准曲线

取6支1.5 mL的离心管，先加入100 μg/mL葡萄糖标准溶液0、40、80、120、160和200 μL，然后加入200、160、120、80、40和0 μL的10% 三氯乙酸，体积不足1 000 μL，再次加入0.2%蒽酮试剂800 μL。混合均匀，放在沸水浴中10 min，流水冷却，置于25 ℃下20 min。将待测液转入96孔酶标板中，在全波酶标仪（BioTek Instruments，Inc）上测定630 nm波长下的D值。重复3次，最后得到葡萄糖标准曲线为y=4.095 2x+0.167 5（R²=0.982 6）。

1.5.2 海藻糖标准曲线

取6支1.5 mL的离心管，先加入100 μg/mL海藻糖标准溶液0、10、20、30、40和50 μL。然后加入1% H₂SO₄ 50、40、30、20、10和0 μL。置于90 ℃的水浴锅中10 min，冰水浴3 min，再次加入30% KOH 50、40、30、20、10和0 μL。90 ℃水浴锅10 min，冰水浴3 min。各试剂最后加入1 000 μL 0.2%蒽酮试剂，90 ℃水浴锅10 min，冰水浴3 min。将待测液转入96孔酶标板中，在全波酶标仪（BioTek Instruments，Inc）上测定630 nm波长下的OD值。重复3次，最后得到海藻糖糖标准曲线为y=0.077 6x+0.291 2（R²=0.991 4）。

1.6 统计分析

根据标准曲线得出的糖含量，按此公式计算得出实际含量，进行的数据处理。虫体含糖量（μg/mg）=［从标准曲线查得的糖含量（μg/mL）×样品稀释倍数］/虫质量（mg）。采用SPSS 23.0软件进行，使用独立方差T检验和单因素ANOVA检验分析显著性。

2 结果与分析

2.1 高温频率对截形叶螨不同发育阶段体内糖类物质含量的测定

2.1.1 不同高温频率对叶螨不同发育阶段体内可溶性糖含量的影响

如图1所示，在经历不同高温频率处理后，随着高温天数的增加，截形叶螨敏感品系和抗哒螨灵品系体内的可溶性糖含量呈先上升后降低的趋势；3∶1的高温频率下，敏感品系可溶性糖含量出现了骤降，卵期、若螨期和成螨期的可溶性糖含量明显低于对照组，分别为0.21、0.13和0.59 μg/mg；相反抗哒螨灵品系不同螨态的含糖量则略高于对照组。此外，敏感品系和抗哒螨灵品系的可溶性糖含量在不同高温频率下，卵期的增幅或降幅最大，敏感品系成螨期降幅较小，若螨期介于二者之间，但抗哒螨灵品系在成螨期的变化最为平缓。

2.1.2 不同高温频率对叶螨不同发育阶段体内糖原含量的影响

图2显示，在经过不同高温频率后，截形叶螨两个品系在不同发育阶段，其体内的糖原含量变化整体趋势与可溶性糖一致，即先升高后下降，并且在卵期的变化最为激烈。但抗哒螨灵品系在成螨期变化更为平缓。在高温天∶常温天为2∶2的频率下，卵期、若螨期和成螨期的含量均达到最高。

2.1.3 不同高温频率对叶螨不同发育阶段体内海藻糖含量的影响

图3表明，截形叶螨两个品系在经过不同高温频率处理后，体内的海藻糖含量总体都呈上升趋势。从不同发育阶段看，敏感品系和抗哒螨灵品系的成螨期的海藻糖含量一直明显高于卵期和若螨期，在3∶1频率下，海藻糖含量达到了最高，分别为24.30和33.46 μg/mg。

2.2 不同高温频率对截形叶螨不同品系成螨期体内糖含量的影响

从图4~6可知，在受到不同高温频率处理后，抗哒螨灵品系的可溶性糖、糖原、海藻糖含量均高于敏感品系。除了在1∶3频率下，两个品系的可溶性糖含量之间无显著差异外，在2∶2和3∶1两个高温频率下，敏感品系和抗哒螨灵品系之间糖类物质的含量均存在极显著的差异。说明在不同高温频率影响下，不同品系之间应对高温的能力存在明显差异。

3 讨论

昆虫受到外界不良环境影响后，体温会随之变化，外表呈现出不同的状态，体内也同样发生着一系列生理生化反应。高温会导致昆虫体内含水量降低、破坏昆虫表皮结构组织、导致细胞内微环境改变、诱导热激蛋白的产生、导致渗透压增加、甚至改变某些脂类代谢和糖代谢以及离子失衡等^［17］。

糖类物质作为昆虫体内主要的能源物质之一，除了糖原、葡萄糖和丙糖外，海藻糖的含量是非常丰富的。海藻糖又被称为昆虫的“血糖”^［18］，是一种应激代谢产物，当受到不良因素胁迫（高温、低温、冷冻、有毒试剂等）后，对昆虫起到了良好的保护作用。本研究结果表明，随着高温频率的增加，截形叶螨抗哒螨灵品系体内的可溶性糖含量和糖原含量均呈先上升后降低的趋势；但两个品系的海藻糖含量呈上升趋势。并在高温天数最大，即3∶1频率下达到最高，猜测海藻糖对高温响应的较快；通过与糖原和其他糖类的相互转化，积累量达到最大，从而提高自身的耐热能力。每日的昼夜温差变化让叶螨有时间存储和保持较高的海藻糖含量，延缓了高温暴露对截形叶螨的损害。

而且，本研究发现，不同高温频率下，截形叶螨抗哒螨灵品系的可溶性糖、糖原和海藻糖含量整体均高于敏感品系，表明抗哒螨灵品系应对高温的能力高于敏感品系，这与实验室前期结果相一致。截形叶螨不同发育阶段，在不同高温频率下，糖类物质的含量在卵期的增幅和降幅最大，成螨期最小，若螨期介于二者之间，尤其是抗哒螨灵品系成螨期的变化最为平缓。其具体原因还需进一步深入研究。

此外，本研究只设置了周期天数相同，高温天连续增加的这一种模式，并未涉及高温天同正常天连续天数比例相同等其他模式的模拟，如1∶1、2∶2、3∶3等，而自然界中，温度的周期性变化是频繁且复杂的，而且同种昆虫发生季节及发生区域的不同也会导致其经历的高温周期性变化的不同。另外，本试验设计了高温天先开始、而未测定常温天先开始的模拟试验，而自然界高温天可能发生在昆虫的不同生活史阶段。因此，在后续的研究中还应结合研究对象所在自然环境设计更符合农田实际的及更为丰富的温度模式，为掌握农业害虫的变化规律和有效防治提供更加精准的数据基础。

4 结论

不同高温天频率下，随着高温天数的增加，截形叶螨抗哒螨灵品系在卵期和成螨期体内可溶性糖含量呈现先上升后下降的趋势，在若螨期一直呈下降趋势，而敏感品系正好与之相反；但是两个品系的海藻糖含量总体呈上升趋势。并且截形叶螨抗哒螨灵品系体内的糖含量显著高于敏感品系。说明通过积累糖物质含量，有助于提高截形叶螨的耐热性，且抗哒螨灵品系应对高温的能力高于敏感品系，截形叶螨对药剂产生抗性后高温也产生了交互抗性。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31860503)

甘肃农业大学科技创新基金项目(GAU-XKJS-2018-152)