宰后LND处理对藏羊肉线粒体通路细胞凋亡与嫩度的影响

Effects of LND treatment on postmortem mitochondrial apoptosis and tenderness of Tibetan mutton

摘要

目的 明确宰后LND处理对藏羊肉成熟过程中线粒体通路细胞凋亡以及肌肉嫩度的影响。 方法 选用甘南欧拉藏羊后腿肉为试验材料，用100 μmol/L氯尼达明（Lonidamine，LND）（处理组）和蒸馏水（对照组）以肉液比（m/v）1∶1注射，4 ℃成熟0、12、24、72、120、168 h，对不同成熟期线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP）开放程度、线粒体膜电位、胞浆Cyt-c氧化还原状态、Caspase-9活性、Caspase-3活性以及肌原纤维小片化指数（MFI）、剪切力指标进行了测定。 结果 在成熟168 h时，LND处理组的吸光值、线粒体膜电位、胞浆Cyt-c还原水平及剪切力值较对照组分别低26.4%（P<0.05）、21.63%、28.4%和15.3%。Caspase-9、Caspase-3活性、MFI值较对照组分别高30.9%、25.1%、6.5%。 结论 研究结果可为宰后藏羊肉的成熟嫩化提供依据。

Abstract

Objective To determine the effect of LND treatment on mitochondrial pathway apoptosis and muscle tenderness during postmortem aging of Tibetan mutton. Method The hind leg meat of Gannan Oula Tibetan sheep was selected as the test material, and 100 μmol/L lonidamine (LND) (treatment group) and distilled water (control group) were injected at a meat-to-liquid ratio (m/v) 1∶1, and the degree of MPTP opening, mitochondrial membrane potential, redox state of cytoplasmic Cyt-c, caspase-3 activity, caspase-9 activity,MFI and shear force were measured after aging for 0,12,24,72,120,168 h at 4°C. Result After 168 hours of aging, the absorbance, mitochondrial membrane potential,cytoplasmic Cyt-c reduction level,and shear force value of the LND-treated group were 26.4%(P<0.05),21.63%,28.4%,and 15.3% lower than those of the control group, respectively.The activity of caspase-9,caspase-3,and MFI were 30.9%,25.1%,and 6.5% higher,respectively, than that of the control group. Conclusion The results provided a basis for postmortem aging and tendering of Tibetan mutton.

Graphical abstract

关键词

藏羊肉 / 线粒体 / 嫩度

Key words

Tibetan lamb / apoptosis / tenderness

甘南欧拉藏羊肉能量和蛋白质含量高，脂肪和胆固醇含量低，氨基酸和矿物质含量丰富^［1］，但是欧拉藏羊肉的嫩度、口感相对较差，改善欧拉藏羊肉嫩度已成亟待解决的问题。

宰后成熟过程中，肌原纤维骨架蛋白被内源蛋白酶有限降解后能够导致肌肉嫩化，其中最为关键的就是细胞凋亡效应酶对肌原纤维蛋白进行降解^［2］，从而改善肉的嫩度。

宰后肌肉由于缺乏氧气和营养基质会发生应激反应，从而导致肌细胞凋亡^［3］。细胞凋亡发生的途径包括内源线粒体信号途径、死亡受体信号途径和外源内质网信号途径^［4］。内源线粒体信号途径能够引起细胞凋亡的发生，而激活的细胞凋亡酶能够使肌原纤维蛋白发生降解，进一步对肉的嫩化产生影响。

MPTP是线粒体的内膜和外膜之间的一种复合孔道，具有非特异性的特征^［3］。MPTP的3种开放状态分别是完全关闭状态、正常的低通透性开放状态、不可逆的高通透性开放状态。在一般情况下，MPTP规律性开放的趋势能够维持线粒体状态的稳定，MPTP不可逆高通透性的开放能够在线粒体中促凋亡蛋白释放，导致凋亡的发生^［6］。

LND是一种吲哚羧酸的衍生物，与MPTP的腺嘌呤转换子相互作用，从而对MPTP的开放产生促进作用，进而诱导凋亡过程的发生^［7］。Deniaud A等^［8］研究发现MPTP的改变受LND的干预，从而对凋亡的发生产生积极作用。董煜^［9］通过以LND作为MPTP的开放剂对雄性大鼠生殖细胞进行干预后，发现LND可以调控MPTP的异常开放，膜电位降低，从而引发线粒体通路生殖细胞凋亡的发生。

综上所述，LND对细胞凋亡影响的研究主要集中在医学领域，然而，关于LND对宰后藏羊肉线粒体通路细胞凋亡的影响尚未报道。为此，本试验以甘南欧拉藏羊后腿肉为试验材料，研究LND处理对藏羊肉宰后成熟过程中线粒体通路细胞凋亡的发生及嫩度的影响，以期为宰后藏羊肉品质改善奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4~5岁去势欧拉藏羊6只后腿，采自甘肃省甘南州。

氯尼达明（Lonidamine，LND）购于上海源叶生物科技有限公司；蔗糖和甘露醇等购于天津市光复科技发展有限公司；3-（N-吗啡啉）丙磺酸购于上海麦克林生化科技有限公司；Hepes、Caspase-9、Caspase-3活性检测试剂盒（48T）等购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计（T6新世纪型，北京普析通用仪器设备有限责任公司）；高速台式冷冻离心机（TGL-16M型，湖南湘怡离心机仪器有限公司）；酶标仪（Spectramax M2型，美国美谷分子仪器有限公司）；荧光分光光度计（RF 5301-PC型，日本岛津公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

取腿肉，剔除表面脂肪和结缔组织，将肉样随机分成两组，一组注射100 μmol/L LND（肉样∶处理液=1∶1，m/v）作为处理组，另一组以注射蒸馏水（肉样∶处理液=1∶1，m/v）作为对照组，均置于4 ℃成熟0、12、24、72、120、168 h。剪切力取样后，其余肉样-80 ℃保存备用。

1.3.2 线粒体提取

参照王琳琳^［10］方法。称取10 g剪碎肉样加入100 mL线粒体分离液［0.005 mol/L 3-（N-吗啡啉）丙磺酸、0.2 mol/L甘露醇、0.002 mol/L EDTA、0.7 mol/L蔗糖、0.5%牛血清白蛋白，pH 7.4］中，匀浆后离心10 min（4 ℃，1 000 g），取上清液离心10 min（4℃，1 000 g），再次取上清液离心20 min（4 ℃，8 000 g），取沉淀物。

1.3.3 MPTP开放程度测定

参照1.3.2，取适量的缓冲液（0.01 mol/L Tris-HCl，0.25 mol/L蔗糖，pH 7.4）加入线粒体沉淀中重新悬浮线粒体，悬浮液蛋白浓度用双缩脲法测定。取3 mL 测试介质（0.07 mol/L蔗糖、0.23 mol/L甘露醇、0.003 mol/L Hepes，pH 7.4）加到1 mL蛋白质量浓度调为0.3 mg/mL的线粒体溶液中混合均匀，540 nm处测吸光度值^［11-12］。

1.3.4 线粒体膜电位测定

参照试剂盒方法和王琳琳^［10］方法。0.1 mL线粒体溶液（质量浓度为0.1 mg/mL）中加0.9 mL JC-1染色工作液（5倍稀释）后孵育20 min，荧光光度计测定荧光值（测定JC-1单体：激发波长为490 nm、发射波长为530 nm；测定JC-1聚合物：激发波长为525 nm、发射波长为590 nm）。用红绿荧光强度的比值来反映线粒体膜电位水平。

1.3.5 胞浆Cyt-c氧化还原状态测定

胞浆悬液参照1.3.2的方法制备（上清液），分别在550 nm和535 nm处测定吸光度，用550 nm处的吸光度减去535 nm处的吸光度，并归一化为所使用的胞浆悬液的总蛋白浓度，用不同波长下的吸光值之差与蛋白浓度的比值来表示胞浆Cyt-c的还原水平^［13］。

1.3.6 Caspase活性测定

Caspase-3、Caspase-9的活性参照相应的试剂盒进行测定。

1.3.7 MFI测定

MFI值测定参照WANG等^［14］的方法。称取2 g碎肉置于离心管，加入18 mL MFI缓冲液（1 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L NaN₃，0.01 mol/L KCl，0.02 mol/L K₃PO₄，pH 7.1）进行匀浆后，离心15 min（4 ℃、1 000 g），沉淀物加18 mL缓冲液重复离心1次，加10 mL缓冲液混匀，立即用尼龙筛网（200目）过滤，得到肌原纤维蛋白溶液，用双缩脲法测其蛋白浓度。MFI值为540 nm（蛋白浓度调至0.5 mg/mL）吸光度值乘以200。

1.3.8 剪切力测定

剪切力测定参照TIAN等^［15］的方法。

1.4 数据统计与分析

利用Microsoft Office Excel 2013进行数据处理，并利用Origin 2017软件作图。用IBM SPSS Statistics 26.0对数据进行统计分析，数据平行测定3 次，并通过单因素方差分析（ANOVA）和多重比较（Duncan法）进行数据间的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 LND处理对线粒体MPTP开放程度的影响

MPTP开放程度通常由吸光度值表示，吸光值越小，MPTP开放程度越大。图1表明，对照组与LND处理组吸光值在宰后成熟过程中整体呈下降趋势，即宰后欧拉藏羊肉MPTP开放程度整体呈现增加的趋势，并且LND处理组显著高于对照组（P<0.05）。在成熟168 h时，LND处理组吸光值较对照组低26.4%，即MPTP开放剂LND处理能够增加MPTP的开放程度。表明，100 μmol/L LND处理可使藏羊肉成熟过程中MPTP开放程度增大，膜通透性显著增大。

2.2 LND处理对线粒体膜电位的影响

图2可知，对照组与LND处理组线粒体膜电位变化在宰后成熟过程中整体呈下降趋势，并且LND处理组显著小于对照组（P<0.05）。在成熟168 h时，LND处理组线粒体膜电位较对照组低21.63%。表明，100 μmol/L LND处理可使藏羊肉成熟过程中线粒体膜电位下降。

2.3 LND处理对胞浆Cyt-c氧化还原的影响

Cyt-c在线粒体凋亡途径中扮演着重要的角色，氧化型Cyt-c能够结合其他凋亡因子形成凋亡小体，而还原状态下的 Cyt-c不能形成凋亡小体，即不能够诱导后续的凋亡过程^［10］。图3可知，对照组和LND处理组Cyt-c还原水平在宰后成熟过程中整体呈先上升后下降趋势，并且LND处理组显著低于对照组（P<0.05），在成熟168 h时，LND处理组Cyt-c还原水平较对照组低28.4%。表明，100 μmol/L LND处理可使藏羊肉成熟过程中的胞浆Cyt-c还原水平下降。

2.4 LND处理对细胞凋亡酶活性的影响

图4表明，对照组和LND处理组Caspase-9活性在宰后成熟过程中整体呈先上升后下降趋势，在12 h达到最大值，并且LND处理组显著高于对照组（P<0.05），在成熟168 h时，LND处理组较对照组高30.9%。图5表明，对照组和LND处理组Caspase-3活性在宰后成熟过程中整体呈先上升后下降趋势，在24 h达到最大值，并且LND处理组显著高于对照组（P<0.05），在成熟168 h时，LND处理组较对照组高25.1%。表明，100 μmol/L LND处理可使藏羊肉成熟过程中的Caspase-3、Caspase-9活性增大。

2.5 LND处理对MFI的影响

MFI是通过对肌原纤维内部结构的破坏进行映射来表征肉的嫩化程度的指标^［16］。图6可知，对照组和LND处理组MFI值在宰后成熟过程中整体呈上升趋势，说明肌肉骨架蛋白随着宰后藏羊肉成熟过程的进行发生持续的降解，并且LND处理组显著高于对照组（P<0.05），在成熟168 h时，LND处理组较对照组高6.5%。表明，100 μmol/L LND处理可使藏羊肉成熟过程中的MFI值增大，肉嫩度得到改善。

2.6 LND处理对剪切力的影响

剪切力的大小能够反映肉嫩度的好坏，是评定肉嫩度的主要指标之一^［16］。图7可知，对照组和LND处理组剪切力值在宰后成熟过程中整体呈先增大后减小趋势，并且LND处理组显著低于对照组（P<0.05），在成熟168 h时，LND处理组较对照组低15.3%。表明，100 μmol/L LND处理可使藏羊肉成熟过程中的剪切力值降低，即肉嫩度得到改善。

3 讨论

线粒体调控凋亡发生的一个关键部分是MPTP开放程度^［17］。MPTP主要由腺苷酸转移酶、亲环蛋白D、电压依赖性阴离子通道及其他的调节激酶，如己糖激酶、Bcl-2家族等组成^［18］。MPTP开放、线粒体膜电位下降等是宰后肌肉发生线粒体损伤时出现的典型特征^［19］。线粒体膜上的个别蛋白分子在特定条件下形成的通道是造成线粒体膜通透性被破坏的原因之一^［20］。线粒体膜通透性的增大或减小可以对线粒体膜电位的变化形成重要的影响，同时线粒体膜电位的下降也导致了不可逆的细胞凋亡的发生。

赵佳瑞等^［21］研究发现，MPTP开放程度的变化能够使线粒体膜通透性发生变化，进而导致线粒体发生肿胀。研究发现LND对线粒体膜蛋白复合物进行直接作用^［22］，使得MPTP开放程度增大。本研究表明，LND处理使宰后欧拉藏羊肉MPTP开放程度增大，膜通透性显著增大。该研究结果与董煜等^［9］用LND对雄性大鼠生殖细胞干预后MPTP异常开放的结果相似。陈齐^［23］研究发现线粒体膜通透性的增大是由于MPTP高水平的开放引起的。研究发现MPTP高度开放破坏了线粒体内Ca²⁺浓度的平衡，进而对线粒体内的电化学平衡及稳定状态造成破坏，质子跨膜转运减少，线粒体膜电位降低^［9］。本研究发现，LND处理使宰后欧拉藏羊肉的线粒体膜电位下降。本研究结果与杨春^［24］研究发现在两种绒癌细胞系中加入LND后线粒体膜电位下降的结果相似。

Cyt-c是细胞凋亡过程中关键的调控因子，能够参与细胞凋亡的启动^［17］。研究发现MPTP开放程度增大，线粒体膜电位下降，释放Cyt-c，使线粒体损伤水平增大，进而导致胞浆Cyt-c还原水平降低。本试验结果表明，LND处理使宰后欧拉藏羊肉的胞浆Cyt-c还原水平降低。本研究结果与李春晓等^［25］研究的H₂O₂作用于心肌细胞使其增殖活性降低，从而引起心肌细胞发生凋亡，导致线粒体膜电位降低，胞浆中 Cyt-c含量增加，进而降低胞浆Cyt-c还原水平的结果相似。

Caspase是程序性凋亡的重要介导因子^［26］。HUANG等^［27］研究结果表明，线粒体中释放Cyt-c到胞浆，进而与凋亡相关因子结合产生多聚体，再与pro-caspase-9结合从而产生凋亡小体，并导致上游的Caspase-9激活，再进而对下游Caspase-3 活化，最终引起了细胞凋亡的发生。本试验结果发现，LND处理使宰后欧拉藏羊肉的Caspase-3、 Caspase-9活性增大。本研究结果与王晶^［28］研究的糖尿病胃轻瘫（DGP）大鼠组织中Cyt-c表达量增加，导致DGP大鼠组织中Caspase-9和Caspase-3活性均有上升的结果相似。

嫩度是反映肉的食用价值和商品价值的重要指标^［29］。MFI是肉成熟嫩化的重要指标^［30］。宰后肌肉嫩度改善的原因之一可能是因为肌原纤维蛋白的有限降解^［19］。线粒体细胞凋亡级联反应的发生，caspase-3的活化对肌细胞骨架蛋白进行降解，改善了肉嫩度，进一步说明线粒体凋亡途径对肌肉嫩度的改善产生了积极影响。DING 等^［31］在研究牛肉肌原纤维蛋白与Caspase-3体外孵化时发现，Caspase-3能够降解Troponin-T和Titin，进而改善肉嫩度。师希雄等^［32］研究发现H₂O₂能够促进ROS的生成，并激活Caspase-9、Caspase-3，使得肌原纤维蛋白被降解，MFI增大，肉嫩度得到改善。本研究表明，LND处理使宰后欧拉藏羊肉的MFI增大，嫩度得到改善。

剪切力是决定肉嫩度的重要指标，剪切力值越低，说明肌肉嫩度越好^［17］。线粒体损伤加剧能够促进线粒体通路细胞凋亡的发生，进而加速藏羊肉的嫩化。本研究表明，LND处理使宰后欧拉藏羊肉的剪切力值降低。本研究结果与魏起超^［19］研究发现苍术苷通过促进MPTP开放，使线粒体在宰后牛肉成熟过程中损伤加剧，进而改善宰后牛肉嫩度的结果相似。

4 结论

采用100 μmol/L LND （MPTP开放剂）处理宰后藏羊肉，可使MPTP开放程度与线粒体膜通透性显著增大，线粒体膜电位显著下降。因增大了线粒体损伤水平，激活了Caspase-9，进一步活化了Caspase-3，加速了线粒体通路凋亡的发生，从而对肉嫩度的改善产生了积极作用。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(31760436)

甘肃省重点研发计划(20YF3NA014)

甘肃省高等学校创新能力提升项目(2020A-049)