贯叶金丝桃提取物对急性缺氧大鼠肝肾损伤的改善作用

Ameliorative Effect of Hypericum perforatum Extract on Acute Hypoxia Rats with Injury of Liver and Kidney

摘要

目的 研究贯叶金丝桃提取物（Hypericum perforatum extract，HPE）对急性缺氧大鼠肝肾损伤的改善作用。 方法 通过小鼠常压密闭实验模型初步筛选HPE（20%乙醇提取物、70%乙醇提取物和95%乙醇提取物）的抗缺氧活性组分。进一步建立大鼠低压低氧肝、肾损伤模型：将80只健康大鼠随机分为8组，分别为常氧空白组（NG），缺氧模型组（HG），HPE低、中、高剂量组（HPE-L、HPE-M、HPE-H，100、200、400 mg/kg），金丝桃苷低、高剂量组（HYP-L、HYP-H，50、100 mg/kg）和醋酸地塞米松组（DXM，4 mg/kg）。观察HPE对急性缺氧大鼠肝、肾组织病理学变化的影响，并测定其中氧化应激指标和相关炎症因子的变化。 结果 与模型组比较，给予HPE干预后的大鼠肝、肾组织中丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量下降（P<0.01，P<0.05），谷胱甘肽（GSH）含量增加（P<0.01，P<0.05），总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力有所提高（P<0.01，P<0.05）。同时，大鼠肝、肾组织中炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和血管内皮生长因子（VEGF）的释放均被抑制（P<0.01，P<0.05）。 结论 HPE对急性缺氧大鼠肝、肾损伤具有一定程度的改善作用。

Abstract

Objective This study aimed to investigate the potential ameliorative effects of Hypericum perforatum L.extract (HPE) on liver and kidney injury in acute hypoxia rats. Method The anti-hypoxic active components of HPE，including 20% ethanol extract，70% ethanol extract，and 95% ethanol extract，were initially screened using a normobaric hypoxia model in mice.Subsequently，a hypobaric hypoxia injury model was established using 80 rats.The rats were randomly divided into various groups: normoxia control group (NG)，hypoxia model group (HG)，HPE low，medium，and high dose groups (HPE-L，HPE-M，HPE-H，100，200，400 mg/kg)，hyperoside low and high dose groups (HYP-L，HYP-H，50，100 mg/kg)，and dexamethasone group (DXM，4 mg/kg).The effects of HPE on the histopathological changes of the liver and kidney in acute hypoxia rats were observed，and related inflammatory factors and oxidative stress indexes were measured. Result Compared with the model group，rats treated with HPE showed decreased levels of malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2) (P<0.01，P<0.05)，and increased levels of glutathione (GSH)，total superoxide dismutase (T-SOD)，and catalase (CAT) activities (P<0.01，P<0.05).Furthermore，the release of inflammatory factors interleukin-1β (IL-1β)，interleukin-6 (IL-6)，tumor necrosis factor-α (TNF-α)，and vascular endothelial growth factor (VEGF) was inhibited in rats treated with HPE (P<0.01,P<0.05). Conclusion HPE demonstrated a certain degree of ameliorative effect on liver and kidney injury in rats with acute hypoxia.

Graphical abstract

关键词

贯叶金丝桃 / 缺氧 / 肝肾损伤 / 氧化应激 / 炎症

Key words

Hypericum perforatum L. / hypoxia / liver and kidney injury / oxidative stress / inflammation

Author summay

郑一丹，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

高原缺氧导致的机体损伤是西部高原国防建设和经济发展的主要影响因素之一。其中，急进高原对机体肝、肾组织会产生严重损伤，具体表现在氧自由基的增加继而产生炎症反应等方面^［1-2］。研究报道表明，肝脏对缺氧环境极为敏感，急进高原人群多表现为肝功能急剧下降，破坏肝脏氧稳态与多种肝病发病机制相关^［3-4］。同时，肾脏也极易受到缺氧胁迫，出现肾功能不全而发生急性肾损伤，甚至危及生命^［5］。目前抗缺氧损伤的药物有乙酰唑胺、地塞米松^［6-7］、丹红注射液^［8］、通心络胶囊以及利舒康胶囊等^［9］，相较于西药，中药疗效显著，如丹参、当归、人参、黄芪、红景天等，其副作用相对较小但其种质资源有限^［10］。因此，寻找和开发新型抗缺氧损伤的天然药物具有重要意义。

金丝桃属植物在我国分布广泛，有30余种相关的药用产品，经济产值极高，贯叶金丝桃（Hypericum perforatum L．）是藤黄科金丝桃属多年生草本植物，可全草入药，是其中最具研究价值的中草药之一^［11］，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理学活性^［12-13］。本课题组前期研究表明^［14-15］，贯叶金丝桃提取物（Hypericum perforatum extract，HPE）对缺氧大鼠高原脑水肿有良好的的缓解作用。为了丰富HPE针对高原病防治的实验依据，本研究采用小鼠常压密闭实验模型和大鼠低压低氧实验模型，以探讨HPE对模拟高原缺氧大鼠肝、肾组织的保护作用，为高原病患者相关肝病和急性肾损伤防治提供了实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

SPF级 BALB/C 雄性小鼠，体质量（18±2）g，购于中国农业科学院兰州兽医研究所，生产许可证号：SCXK（甘）2018-0001；SPF级Wistar 雄性大鼠，体质量（180±20）ｇ，由联勤保障部队第九四○医院实验动物科提供，许可证号：SCXK（军）2017-0023。以上试验流程经联勤保障部队第九四○医院动物伦理委员会批准后进行，审批编号：2020KYLL064。

1.2.1 药物与试剂

HPE^{［14，16］}（由本课题组自制，其中有效成分以金丝桃苷和金丝桃素为主，纯度分别为47.01%和1.70%）；

金丝桃苷对照品（Hyperoside，HYP，江苏永健医药科技有限公司，纯度：99.07%，批号：CX0012）；地塞米松（Dexamethasone，DXM，浙江仙琚制药股份有限公司，规格：0.75 mg/片，批号：200402）；总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒、CAT试剂盒、MDA试剂盒、过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A001-1-2、A006-1-1、A007-1-1、A003-1-1、A064-1-1）；BCA试剂盒、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）试剂盒、白介素-6（interleukin-6，IL-6）试剂盒、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）试剂盒、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20200602、SEKR-0002、SEKR-0005、SEKR-0032、SEKR-0009）。

1.3.1 试验仪器

DYC-9070型模拟高原低压低氧动物实验舱群（贵州风雷航空军械有限责任公司）；Sigma 3K15高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；SpectraMax® i3型全自动荧光酶标仪（美国Molecular 公司）；BX40型正置显微镜（甘肃嘉瑞贸易有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 小鼠常压密闭缺氧试验

50只SPF级小鼠随机分为缺氧组（hypoxia group，HG，0.5% CMC-Na，10 mL/kg），70 %乙醇提取物（HPE-1，280 mg/kg），20%乙醇提取物（HPE-2，280 mg/kg），95%乙醇提取物（HPE-3，280 mg/kg）和DXM（4 mg/kg）5组，每组10只。连续灌胃给药5 d，于末次给药1 h后，将小鼠逐个放入250 mL广口瓶（内含5 g钠石灰）中，盖紧瓶盖后即为小鼠开始缺氧，同时观察小鼠的神情及精神状态，并记录每只小鼠的死亡时间（以小鼠最后一次大喘气为死亡时间）。

1.2.2 急性缺氧大鼠损伤模型的建立^［17］

80只SPF级大鼠随机分为常氧空白组（NG，10 mL/kg），缺氧模型组（HG，10 mL/kg），贯叶金丝桃提取物低、中、高剂量组（HPE-L、HPE-M、HPE-H，100、200、400 mg/kg），金丝桃苷低、高剂量组（HYP-L、HYP-H，50、100 mg·kg^-1）和DXM（4 mg/kg）8组，每组10只，共连续灌胃给药7 d。全程将NG置于普通动物饲养房（海拔：1 500 m，大气压力：86.3 kPa）。前4 d将剩余7组置于普通动物饲养房，后3 d将其置于高原低压低氧动物模拟舱（海拔：7 500 m，舱内大气压力：35.9 kPa，氧分压：8.0 kPa）。以上各组均于最后1 d末次给药1 h后断头处死大鼠，摘取肝、肾组织。

1.2.3 氧化应激指标的测定

取大鼠肝和肾组织约0.2 g并加入9倍体积的预冷生理盐水，制成10 %组织匀浆。将制备好的组织匀浆于高速冷冻离心机4 000 r/min离心15 min，BCA法测定组织匀浆液中的蛋白质含量，根据各试剂盒说明书测定各组MDA、GSH和H₂O₂的含量以及T-SOD和CAT的活力。

1.2.4 炎症因子含量的测定

同“2.1”项制备10%组织匀浆，于4 ℃，4 000 r/min离心15 min。采用ELISA法在450 nm处测定样品D值，计算各组IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α的浓度。

1.2.5 HE染色观察缺氧大鼠肝肾组织的病理状态

经包埋、切片、HE染色后，于光学显微镜下采集图像，观察比对肝、肾组织病理学特征变化。

1.3 统计学分析

数据分析结果均以\overline{x}\pm s表示，采用SPSS 20.0软件的单因素方差分析和t检验进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 HPE抗缺氧活性组分的筛选及安全性考察

灌胃给药后，各组小鼠体质量缓慢增加，行为精神状态等均表现正常，无死亡现象，表明HPE各组分安全性良好（图1）。

与HG相比，其余各组对小鼠常压密闭缺氧环境下的存活时间均有一定提高，其中HPE-3和DXM的抗缺氧效果最为显著（P<0.05）（表1），且HPE-3的延长率高于DXM。因此，综合考量选用HPE-3进行后续试验。

2.2 各组肝组织氧化应激指标比较

由图2可知。HG中MDA和H₂O₂含量显著升高（P<0.01），GSH含量、T-SOD和CAT活力显著降低（P<0.01）。给予各组药物干预后，与HG相比，HPE-M、HPE-H、HYP-H和DXM中MDA、H₂O₂含量下降（P<0.01，P<0.05），T-SOD、CAT活力上升（P<0.01，P<0.05）；HPE-H、HYP-L、HYP-H和DXM中GSH含量显著增加（P<0.01）。

2.3 各组肾组织氧化应激指标比较

与NG相比，HG中MDA和H₂O₂含量升高（P<0.01，P<0.05），GSH含量、T-SOD和CAT活力显著降低（P<0.01）（图3）。与HG相比，各组MDA、H₂O₂含量降低（P<0.01，P<0.05），除HPE-L外，其余各组GSH含量，T-SOD、CAT活力有所升高（P<0.01，P<0.05）。

2.4 各组肝组织炎症因子的变化比较

与NG相比，HG中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量显著升高（P<0.01）。与HG相比，药物干预后各组IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α均有一定的下调（P<0.01，P<0.05）（图4）。

2.5 各组肾组织炎症因子变化比较

与NG相比，HG中IL-1β含量增加（P<0.05）。与HG相比，各组VEGF含量在给药后降低，其中，HPE-M、HPE-H、HYP-L、HYP-H和DXM降低最为明显（P<0.01，P<0.05）；给予药物干预各组IL-6、IL-1β含量均有所下调，其中，HPE-H和HYP-H降低最为明显（P<0.01，P<0.05）（图5）。

2.6 肝组织病理学检查

由图6可知，NG大鼠肝组织细胞形态结构清晰完整，以中央静脉为中心呈放射状整齐、紧密排列，无病理学损伤。HG大鼠肝细胞肿胀、排列疏松不紧密，肝小叶结构异常，中央静脉紊乱，有炎细胞浸润，纤维组织增生。与HG相比，HPE、HYP及DXM干预后，大鼠肝组织病理结构有一定的改善，肝细胞排列整齐，趋于正常，同时伴有轻度颗粒变性。其中，HPE-M、HPE-H、HYP-H及DXM改善较为明显。

2.7 肾组织病理学检查

由图7可知，NG大鼠肾组织细胞清晰、结构整齐，肾小球形状规则。在HG中，大鼠肾小球结构紊乱，出现明显的肾小球基底膜增生、细胞间质充血并肿胀，炎症细胞浸润。与HG相比，给与HPE、HYP及DXM干预后，结构排列有序，细胞肿胀减轻，肾小球基底膜增生得到缓解。其中，以HPE-M、HPE-H、HYP-H及DXM病理损伤减轻较为明显。

3 讨论

初入高原，机体可触发代偿性反应以适应变化，但持续的低氧会诱发氧化应激反应，破坏细胞内的氧化还原平衡，使得MDA和H₂O₂含量上升，SOD等抗氧化酶活力下降^［18-19］。保护系统的瓦解预示机体稳态的破坏，细胞更易受到各种外界不利因素的攻击。MDA是机体内细胞膜脂质过氧化的终产物，其含量可间接反映细胞的损伤程度^［20］。H₂O₂是细胞受到内外环境变化而产生的一种活性氧分子，主要是O^2-在SOD的催化作用下产生的，可由CAT和GSH清除^［21］。SOD、CAT和GSH作为细胞内三种主要的抗氧化物质，其活力变化体现了机体对外界氧化应激所作出的反应^［19］。

研究表明，持续低压缺氧会对大鼠肝、肾组织造成一定程度的损伤^［5，22］。其中，肝组织代谢需要充足的氧气供应，缺氧可能通过介导慢性炎症参与肝纤维化的发生发展^［23］。机体获得低氧习服后可提高细胞对氧摄取率，而这一过程主要由肝、肾所介导，其对外界氧水平的变化较为敏感^［24］，在低氧反应中对机体维稳至关重要。本试验数据表明，急性缺氧处理后的大鼠肝肾组织显示出了各种损伤，包括氧化应激和细胞因子风暴等。在此期间，由于DNA损伤、线粒体功能障碍和脂质过氧化，可触发机体炎症，释放一系列细胞因子，如促炎因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）、趋化因子（VEGF）等共同参与全身的炎症反应^［25-26］。IL-6可促进TNF-α的释放，使得炎症程度不断加深。缺氧通路与炎症过程存在多种联系，在高原极端环境下机体氧化还原系统被破坏，进而诱发产生炎症^［27-28］。本研究中的贯叶金丝桃提取物各剂量组均能不同程度的平衡缺氧大鼠氧化应激微环境，下调各炎症因子的突增，改善肝肾组织病理状态，并且HPE中、高剂量组与阳性对照HYP或DXM治疗效果相当。由于高原低氧环境下肝肾组织的氧化应激损伤与炎症反应损伤亟待研究和解决，而天然产物结构新颖，活性成分丰富，在抗缺氧药物治疗中扮演着重要的角色，见图8。Zheng等^［29］研究表明，红景天苷通过阻断肝肾细胞中HIF-1α蛋白降解，达到预防缺氧、治疗高原病的效果。贯叶金丝桃中的主要成分是间苯三酚衍生物、萘骈二蒽酮类和黄酮类物质，其中，金丝桃苷的含量约为1.05%~1.80%^［30］，是主要药理学活性成分之一。Shi^［31］等人的研究表明金丝桃苷可通过抑制氧化应激与细胞凋亡治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤。本研究中金丝桃苷为HPE的主要成分，其含量高达47.01%，提示金丝桃苷可能是贯叶金丝桃提取物保护急性缺氧大鼠肝肾损伤的关键因素。

4 结论

小鼠常压密闭试验模型表明HPE各组分安全性良好，且初步筛选出了HPE-3为抗缺氧效果最佳的组分，为后续试验奠定了基础。急性缺氧损伤模型中，通过HPE干预，大鼠肝、肾组织的MDA、H₂O₂、IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF含量下降，提高了GSH含量、T-SOD和CAT活力。综上所述，贯叶金丝桃提取物可通过改善氧化应激、炎症反应、组织病理状态三个方面达到保护急性缺氧损伤大鼠肝肾的效果。

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基金资助

中央高校基本科研业务费专项资金项目(31920200010)

甘肃省自然科学基金项目(20JR5RA594)