红三叶异黄酮对去卵巢大鼠钙磷代谢及VDR和CaBP-9k mRNA表达的影响

Effects of isoflavones from red clover on calcium/phosphorus metabolisms and on VDR/Cabp-9k mRNA expressions in ovariectomized rats

摘要

目的 研究岷山红三叶（Trifolium pratense cv.Minshan）异黄酮（isoflavone，ISO）调节动物钙、磷吸收与代谢的作用。 方法 选择80只SD（Sprague-Dawley）雌性大鼠（50~60日龄），随机分为8组（每组10只），其中1~7组为去卵巢（ovariectomized，OVX）+红三叶异黄酮组，分别按320、160、80、40、20、10和0 mg/（kg·d）的量灌胃红三叶异黄酮，第8组为假手术组，灌服等量生理盐水，试验期60 d。 结果 40~320 mg/（kg·d）的灌服量可提高去卵巢大鼠血清钙含量，大鼠胫骨灰分、胫骨钙含量和钙磷比均随灌服量上升而增高；20~40 mg/（kg·d）灌服量上调大鼠小肠VDR mRNA及CaBP-9K mRNA的表达促进小肠对钙的吸收，160~320 mg/（kg·d）灌服量上调大鼠肾脏VDR mRNA的表达促进肾小管对钙、磷的重吸收。 结论 岷山红三叶异黄酮对去卵巢大鼠小肠钙吸收和肾脏钙重吸收及骨的生长、矿化有一定促进作用。

Abstract

Objective The study aimed to explore the effect of isoflavones from Minshan red clover on the absorption and metabolism of calcium and phosphorus in animals and the underlying mechanisms. Method We selected 80 Sprague-Dawley female rats (50~60 days old) and divided them into 8 groups (10 rats in each group) randomly.Among them,1-7 groups were ovariectomized and intragastrically administrated with red clover isoflavones，the doses of which were 320，160，80，40，20，10 and 0 mg/(kg·d)，respectively，and the group 8 was a sham operation group，which was perfused with the same amount of normal saline for 60 days. Result The doses of 40~320 mg/(kg·d) could increase the serum calcium content of the ovariectomized rats，and the tibial ash content，tibial calcium content and calcium phosphorus ratio of rats increased with the dose increasing.The dose of 20~40 mg/(kg·d) could up-regulate the expression of VDR mRNA and CaBP-9K mRNA in small intestine of rats and promoted the absorption of calcium in small intestine，and the doses of 160~320 mg/（kg·d） could upregulate the expression of VDR mRNA in rat kidney and promote the reabsorption of calcium and phosphorus in renal tubules. Conclusion The isoflavones from Minshan red clover can promote calcium absorption in small intestine，reabsorption in kidney，and bone growth and mineralization of the ovariectomized rats.

Graphical abstract

关键词

岷山红三叶，异黄酮 / 去卵巢大鼠 / 钙磷代谢 / VDR / CaBP-9K

Key words

Minshan red clover / Isoflavone / ovariectomized Rats / calcium-phosphorus metabolism，VDR，CaBP-9K

Author summay

马爱霞，高级畜牧师，草种选育及草产品开发。E-mail：

岷山红三叶是在甘肃省高寒阴湿地区育成的具有地域特点的优良豆科牧草，不仅抗寒耐湿、优质高产，且富含异黄酮^［1-2］。岷山红三叶牧草总异黄酮含量1%~2.6%，以芒柄花素（formonetin）和鹰嘴豆芽素A（biochanin A）含量较高（占干重的0.10%~0.90%），染料木素（genistin）和大豆黄素（daidzin）含量较低^［1-5］。岷山红三叶是多年生作物，播种一次可收益4~5 a，一个生长季可收草2~3茬，加之其产草量和牧草异黄酮含量远高于一年生作物大豆籽粒（异黄酮含量是大豆籽粒的8~10倍^{［1，6-7］}），开发利用岷山红三叶异黄酮具有更大优势。

异黄酮类物质具有雌二醇（estradiol，E₂）相似的杂环酚羟基结构，能与哺乳动物雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合，发挥弱的雌激素作用^［1］，具有抗癌、抗氧化、预防骨质疏松、延缓女性更年期症状等方面的作用^［7-8］，尤其将其作为植物雌激素预防骨质疏松的研究报道较多^{［2，9-16］}，相关的组织培养、细胞培养和动物实验结果认为，异黄酮能促进成骨细胞蛋白质的合成和成骨细胞增殖，抑制破骨细胞增殖，促进骨生成、抑制骨吸收，从而提高骨组织钙磷含量，增加骨密度^{［8，10-13，16］}。

钙、磷是动物骨骼重要的组成部分。肠道中钙的吸收受食物钙与磷的含量及比例、类固醇激素、活性维生素D₃ （1，25-（OH）₂D₃） 等因素影响，体内钙、磷代谢受甲状旁腺素（Parathormone，PTH）、降钙素（Calcitonin，CT）、1，25-（OH）₂D₃和雌激素（Estradiol，E₂）等调节^［17］。研究表明，小肠吸收钙的功能随体内雌激素水平降低而下降^［18-20］，日粮补充异黄酮类植物雌激素能有效防治去卵巢大鼠骨丢失^{［2，8，10-13，15-16，21］}，但其对肠道钙吸收及肾脏钙重吸收的影响报道甚少，尤其红三叶异黄酮等植物雌激素调节动物肠道钙磷吸收和肾脏钙磷重吸收的作用及机理研究尚未见报道。一般认为，雌激素通过增强肝、肾羟化酶活性，提高1，25-（OH）₂D₃水平来促进小肠细胞对钙的吸收^［22-27］。而Liel等研究认为，雌激素可上调去卵巢大鼠十二指肠维生素D受体（VDR），升高VDR功能相关钙结合蛋白（CaBP-9k）mRNA的水平，对实验动物血1，25（OH）₂D₃和PTH水平无影响^［28］，推测雌激素可能直接调节VDR mRNA表达，并非通过影响PTH和1，25（OH）₂D₃的水平间接调节VDR。

本试验立足岷山红三叶资源优势及其异黄酮的潜在开发应用价值，研究岷山红三叶异黄酮调节动物钙磷代谢的作用以及对小肠和肾脏VDR mRNA 及 CaBP-9K mRNA 表达量的影响，探讨肠道钙吸收及肾脏钙重吸收的作用，旨在为岷山红三叶异黄酮及其饲料添加剂的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验处理

采用单因素随机分组试验设计，选择80只CL级（clean grade）SD雌性大鼠随机分为8组（表1），每组10只；其中1~7组去卵巢（ovariectomized，OVX），分别灌服不同剂量的岷山红三叶异黄酮（以下简称红三叶异黄酮），第8组为假手术组（sham），只切除双侧卵巢周围少量脂肪组织，不切除卵巢。

1.2 试验动物与试验期

50~60日龄CL级SD雌性大鼠（实验动物许可证：SCYXK（甘）2015-0002，甘中医药大学动物试验中心提供），体质量（185.43±17.09）g。试验前用 3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（剂量按45 mg/kg 计）后，沿腹中线切口（长约1 cm），切除两侧卵巢（假手术组只切除卵巢周围少量脂肪组织）。5 d后开始试验，其中预试期6 d，每日灌胃1次，灌服1 mL/100 g BW的生理盐水，正试期60 d，开始时空腹称体质量。试验于2019年12月7日~2020年2月11日在甘肃中医药大学动物实验中心进行。

1.3 红三叶异黄酮来源及主要组分

试验用岷山红三叶异黄酮由岷州集团岷海制药有限公司提取，总异黄酮含量10%，其中芒柄花素（Formononetin） 5.10%，鹰嘴豆芽素A （Biochanin A） 4.10%，大豆苷元（Daidzein） 0.05%，染料木素（Genistein） 0.03%。

1.4 试验动物饲养与红三叶异黄酮灌服方法

各组均饲以CL级大鼠专用颗粒饲料，日投料量5 g/100 g；将同组大鼠置同一笼中饲养（群饲），日饲喂2次，自由采食和饮水。

用0.5%羧甲基纤维素钠配制成浓度为32、16、8、4、2、1和0 g/100 mL的红三叶异黄酮悬液，正试期分别给1~7组大鼠灌胃，1次/d，每日8∶20~9∶00灌胃，灌服量为1 mL/100 g；第8组每日1次灌服等量生理盐水。

1.5 试验动物样品采集

试验结束次日，早晨称大鼠空腹个体质量；腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，股动脉采血，分离血清置-20 ℃冰箱备用。股动脉放血处死大鼠后，立即分离肾脏并从十二指肠起始端剪下长约2 cm小肠，置于预冷的生理盐水中清洗干净，立即放入液氮中保存；分离左胫骨，冷冻保存。

1.6 相关指标测定

1.6.1 血清钙、磷和碱性磷酸酶的测定

血清钙（Ca）：采用邻甲酚酞络合酮比色法；血清磷（P）：采用钼兰法；碱性磷酸酶（ALP）：采用对硝基苯磷酸盐法。均按试剂盒说明进行操作。

1.6.2 胫骨灰分及钙、磷含量测定

左胫骨置沸水中煮30 min，沥水、冷却、剥去肌肉与筋腱，完整地取出胫骨及软骨帽。用骨钳从中间夹断胫骨、包以脱脂滤纸，依次用无水乙醇脱水24 h、乙醚抽提脱脂24 h、105 ℃干燥2 h并恒质量（A）、550~600 ℃灼烧至骨变为白色并恒质量（B）。结果表示为脱水脱脂胫骨的灰分含量（%）。

脂骨灰分含量（%）=灰分质量（B）/脱脂胫骨干质量（A）×100%

胫骨灰钙测定采用高锰酸钾法；胫骨灰磷测定采用钒钼酸比色法。

1.7 VDR和CaBP-9K mRNA 表达量测定

各处理分别取 8 只大鼠肾脏和小肠样品，提取总RNA，反转录后采用SYBR Green I染料法，利用 ABI-7300 实时荧光定量 PCR 仪进行定量分析；各样品均设4个平行样，选择 β-actin 作为内参基因，对目的基因进行均一化处理。

根据Gen Bank中大鼠VDR、CaBP-9K以及β-Actin基因序列，分别在相对保守的区域设计两对PCR特异引物，引物序列见表 2。

PCR反应体系：采用25 μL荧光定量PCR反应体系，反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，70 ℃ 30 s，共 35 个循环。VDR、CaBP-9K及β-actin的融解曲线分别在84.5 ℃、82.5 ℃和85 ℃附近出现单一峰，无引物二聚体形成。扩增产物2.0%琼脂糖凝胶电泳检测（以500 bp DNA ladder为标准品对照，电压100 V，时间25 min）分别在200 bp、180 bp和115 bp附近检测到明显条带，与设计扩增目的片段结果相符（图1）。

1.8 数据分析

试验数据均以平均数±标准差表示。采用SPSS 19.0 进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较；VDR mRNA和CaBP-9K mRNA相对表达量采用2^-ΔΔCt法^［19］进行分析。

2 结果与分析

2.1 岷山红三叶异黄酮对血清钙磷及ALP浓度的影响

由表3可知，去卵巢且未灌服红三叶异黄酮组（7组）大鼠血清钙浓度是假手术组（8组）的91.01%（P>0.05）；灌服红三叶异黄酮 10、20 mg/（kg·d）组（6 和 5 组）血清钙浓度与假手术组的水平相近（P>0.05），灌服80和320 mg/（kg·d）组（3 和 1 组）显著高于7组（P<0.05），而160和40 mg/（kg·d）组（2和4组）与7组之间差异不显著（P>0.05）。血清磷浓度介于1.12~1.22 mmol/L之间，各组间差异均不显著（P>0.05）。除1和8组之间血清ALP活性差异不显著外（P>0.05），2~7 组血清ALP活性均显著高于8组（P<0.05），1~7组之间差异不显著（P>0.05）；各去卵巢组血清ALP活性（y，U/L）随灌服量（x，mg/（kg·d））增大而降低，其线性关系为：y=-0.115x+206.182（R²=0.878，P=0.002）。

2.2 岷山红三叶异黄酮对胫骨灰分及钙、磷含量的影响

由表4可知，7组胫骨相对重显著低于8组（P<0.01），去卵巢大鼠灌服红三叶异黄酮10~40 mg/（kg·d）未使该指标提高（P>0.05），灌服80与160 mg/（kg·d）组有所提高（P>0.05），仅1组（320 mg/（kg·d）灌服组）达到与8组相近水平（P>0.05），1和8 组显著高于2、4、5、6、7组（P<0.01）和3组（P<0.05）。胫骨灰分含量7组与8组相近（P>0.05），1、3组（P<0.01）和4、5组（P<0.05）显著高于7组，1组也显著高于2、4、6组（P<0.05）和8组（P<0.01）。胫骨钙含量5、6、7组与8组相近（P>0.05），1~4组有所升高，但仅1组显著高于5组与7组（P<0.05）。胫骨磷含量7组与8组接近（P>0.05），1~6组与7、8组间无显著差异（P>0.05），灌服量最高的1组最低，显著低于3组和5组（P<0.05）。胫骨钙磷比7、8组仅显著低于1组（P<0.05），1组还显著高于5组（P<0.01）、3组和6组（P<0.05），4组也高于5组（P<0.05）；胫骨钙磷比（y）与红三叶异黄酮灌服量（x，mg/（kg·d））间存在线性关系：y=0.000 9x+1.674（R²=0.749，P=0.026）。血清钙浓度与胫骨灰分（r=0.861 4，P=0.003）和胫骨钙（r=0.678 7，P=0.004）含量之间存在正相关。

2.3 岷山红三叶异黄酮对VDR和CaBP-9k mRNA相对表达量的影响

2.3.1 小肠VDR mRNA的相对表达量

如图2所示，8组大鼠小肠VDR mRNA的相对表达量显著高于7组（P<0.01），但与1~6组之间无显著差异（P>0.05）；1~6组大鼠小肠VDR mRNA的相对表达量均高于7组（P<0.01，P<0.05），4组也显著高于2和3组（P<0.05），5组显著高于2组（P<0.05）；4组即灌服红三叶异黄酮剂量为40 mg/（kg·d）时，小肠VDR mRNA的表达量最高。

2.3.2 小肠CaBP-9K mRNA的相对表达量

如图3所示，大鼠小肠CaBP-9K mRNA相对表达量8组极显著高于7组（P<0.01），显著高于6组（P<0.05），与1~5组差异不显著（P>0.05）；1~5组极显著高于7组（P<0.01），1、2和4、5组也显著高于6组（P<0.01，P<0.05），6和7组之间差异不显著（P>0.05）。当红三叶异黄酮灌服量为20 mg/（kg·d）时，CaBP-9K mRNA的相对表达量达到假手术组相近的水平（P>0.05），进一步提高灌服量并未使该指标显著提高（P>0.05）。

2.3.3 肾脏VDR mRNA的相对表达量

如图4所示，大鼠肾脏VDR mRNA的相对表达量7组与假手术组及10~80 mg/（kg·d）灌服量各组之间差异均不显著（P>0.05），只有当红三叶异黄酮灌服量达到160 mg/（kg·d）后，大鼠肾脏VDR mRNA的相对表达量才显著提高（P<0.05，P<0.01），且随灌服量增加而升高；1和2组极显著高于4、5、6、7、8组（P<0.01），也显著高于3组（P<0.01，P<0.05）。

3 讨论

肠钙吸收主要包括两个平行的过程：即主动跨细胞转运过程，以及被动扩散过程。在正常的膳食条件下，主动吸收主要发生于十二指肠，而被动扩散则发生于整个小肠。由于本试验采用钙平衡日粮，胫骨灰分、胫骨钙含量和钙磷比随红三叶异黄酮灌服量上升而增高，灌服量在40~320 mg/（kg·d）范围内均高于假手术组，推测灌服中、高剂量岷山红三叶异黄酮通过加强肠道对钙的被动扩散作用提高血清钙含量，从而增加了钙沉积，提高了胫骨灰分含量。马勇^［9］、朱宁旌^［15］等研究也取得一致结果，灌胃红三叶异黄酮可提高大鼠血清钙和磷含量，王元生在产蛋后期母鸡日粮中添加岷山红三叶异黄酮的试验也取得一致结果，得出岷山红三叶异黄酮可使血清钙含量和胫骨灰分含量提高的结论^［2］，表明红三叶异黄酮对钙磷代谢及骨的生长、矿化有一定的促进作用。本试验去卵巢使脱脂干胫骨相对质量显著下降，灌服80~320 mg/（kg·d）的岷山红三叶异黄酮胫骨相对质量增大，灌服320 mg/（kg·d）达到假手术组相近水平，似说明雌激素也影响骨有机基质的增长，刘胜平^［10］的研究也显示，低、中、高剂量红三叶异黄酮组大鼠骨体积/组织体积百分比、骨小梁数目、骨小梁厚度均增加，骨小梁间距减小，且呈剂量依赖性。综合岷山红三叶异黄酮对血清和胫骨中钙磷代谢相关指标的影响，似以灌服40~320 mg/（kg·d）有利于骨钙沉积，320 mg/（kg·d）最高。

一般认为，雌激素通过增强肝、肾羟化酶活性，提高1，25-（OH）₂D₃水平促进小肠对钙的吸收，VDR与1，25（OH）₂D₃ 在靶细胞结合形成激素-受体复合物，该复合物作用于靶基因的特定DNA序列，对基因（如CaBP）的表达产生调节作用，从而发挥其生物学作用^［29-30］。位于肠道的VDR可增加小肠对钙、磷的吸收^［31-33］，位于肾脏的VDR可增加肾小管对钙、磷的重吸收^［32-33］。余晓丹等^［32］研究表明，雌激素能直接调节VDR表达，而不是通过PTH和1，25（OH）₂D₃间接调节VDR。也有研究发现雌激素替代疗法可以改善去卵巢大鼠对钙的利用能力，尤其在病理状态，补充大豆甙元等植物雌激素可以改善肠道对食物Ca、P的吸收^{［18-19，34］}。本研究结果表明，去卵巢未影响大鼠肾脏VDR mRNA相对表达量，给去卵巢大鼠灌服岷山红三叶异黄酮的量达到160 mg/（kg·d）时，肾脏VDR mRNA的相对表达量极显著的高于假手术组，因此推断内源性雌激素的缺乏对大鼠肾脏VDR mRNA表达无显著影响，当添加一定剂量的红三叶异黄酮时，能显著上调去卵巢大鼠肾脏VDR基因的表达，进而促进肾小管对钙、磷的重吸收。去卵巢使大鼠小肠VDR mRNA和CaBP-9K mRNA的表达量显著下降，但灌服岷山红三叶异黄酮后，检测到小肠VDR mRNA和CaBP-9K mRNA的表达量显著上升，达到甚至超过正常水平，显示红三叶异黄酮对内源性雌激素缺乏引起的小肠VDR mRNA和CaBP-9K mRNA表达量下降具有显著的上调作用。本研究结果与雌二醇上调去卵巢大鼠肾脏VDR mRNA的表达^［35］，抑制去卵巢引起的小肠VDR mRNA 表达下降^［36］及上调CaBP-9k mRNA表达^［37］的试验结果一致。

各异黄酮灌服组血清钙含量以大于40 mg/（kg·d）的中、高剂量灌服组较高，而灌服20~40 mg/（kg·d）岷山红三叶异黄酮具有较明显的上调小肠VDR mRNA及CaBP-9K mRNA表达的作用，可能是高剂量添加组血清高钙反馈抑制了小肠中VDR mRNA及CaBP-9K mRNA的表达，同时也可推测，高剂量灌服组可能通过加强小肠被动扩散过程提高血清钙含量，而20~40 mg/（kg·d）异黄酮灌服组通过增强十二指肠的主动跨细胞转运促进对钙的吸收。

4 结论

1） 灌服40~320 mg/（kg·d）的岷山红三叶异黄酮可提高去卵巢大鼠血清钙含量，大鼠胫骨灰分、胫骨钙含量和钙磷比随红三叶异黄酮灌服量上升而增高。大鼠血清钙浓度与胫骨灰分和钙含量之间存在正相关（r=0.861 4，P=0.003；r=0.678 7，P=0.004）。

2） 灌服20~40 mg/（kg·d）的岷山红三叶异黄酮可上调去卵巢大鼠小肠VDR mRNA及CaBP⁃9K mRNA的表达增强肠道（十二指肠）对钙的吸收，灌服160~320 mg/（kg·d）可上调大鼠肾脏VDR mRNA的表达促进肾脏（肾小管）对钙的重吸收。

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基金资助

高寒草原植被恢复本土野生牧草品种种质资源保护及驯化选育项目(21YF5NA033)