大鼻吻鮈胚胎发育特征和初孵仔鱼形态观察

Embryonic development and morphologic observations of newly-hatched Rhinogobio nasutus Larvae

摘要

目的 为建立大鼻吻鮈（Rhinogobio nasutus）规模化人工繁育技术，并为其生产性育苗工艺和种质资源保护等提供科学依据。 方法 采用野生的大鼻吻鮈经人工催产获得受精卵，记录并分析其胚胎及仔鱼发育各时期的形态特征。 结果 大鼻吻鮈成熟卵呈圆球形，浅绿色，为漂流性卵，卵径（0.60±0.08） mm，受精卵吸水充分膨胀后卵径（0.76±0.08） mm。在水温（23.2±1.0） ℃，pH 8.71~8.86条件下，受精卵3.67 h发育至囊胚期，5.95 h发育至原肠期，9.55 h胚体形成，13.38 h器官开始形成，19.98 h出现肌肉效应情况，24.05 h心跳出现，40.43 h完成出膜，至仔鱼期。大鼻吻鮈初孵仔鱼全长3.00~4.00 mm，心跳101~132次/min；在水温26 ℃条件下，仔鱼2 d全部吸收完卵黄，部分泄殖孔已开，3 d全部开口摄食。 结论 利用人工催产的方法记录、分析和描述了大鼻吻鮈的胚胎发育过程，并且成功获得了大鼻吻鮈初孵仔鱼，其胚胎发育过程经历胚盘期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期及孵化出膜7个阶段，每个发育阶段又有若干个发育时期。

Abstract

Objective The aim of this study was to establish large-scale artificial breeding technology and provide a scientific basis for the establishment of productive seedling and the protection of germplasm resources for Rhinogobio nasutus. Method Fertilized eggs of Rhinogobio nasutus were obtained through artificially-induced spawning，and the morphological characteristics of embryo and larval development were recorded and analyzed at a constant water temperature of (23.2±1.0) °C. Result The unfertilized mature eggs were spherical，light green，and drifting，with a diameter of (0.60±0.08) mm.After fertilization and hydration，the fully swollen eggs became translucent，with a diameter of (0.76±0.08) mm.Under the conditions of water temperature (23.2±1.0) °C and pH 8.71~8.86，the fertilized eggs developed into the blastula stage in 3.67 hours，the gastrula stage in 5.95 hours，embryo body formation in 9.55 hours，organ formation in 13.38 hours，muscle effect in 19.98 hours，and heartbeat in 24.05 hours.After 40.43 hours，embryo development was completed，and the larval stage was reached.The overall length of newly hatched larvae ranged from about 3.00 to 4.00 mm，with a heartbeat of 101~132 beats per minute.The yolk of the larvae was completely absorbed within 2 days，and in some larvae，the cloaca was opened.All larvae started ingestion 3 days after hatching，under the condition of a water temperature of 26 ℃. Conclusion This study recorded，analyzed，and described the process of embryonic development of the big-nosed minnow using artificial labor induction.Hatching larvae of Rhinogobio nasutus were successfully obtained.The embryonic development process went through seven stages，including the embryo dish stage，cleavage stage，blastocyst stage，gastrula stage，neuroembryonic stage，organ formation stage，and hatching out of the membrane.Each development stage consisted of several phases.

Graphical abstract

关键词

大鼻吻鮈 / 胚胎发育 / 仔鱼 / 形态特征

Key words

Rhinogobio nasutus / embryonic development / larval / morphological characteristics

Author summay

杨瑞兰，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

大鼻吻鮈（Rhinogobio nasutus），属辐鳍鱼纲、鲤形目、鲤科、鮈亚科、吻鮈属。大鼻吻鮈体长，前段呈圆筒形，后端侧扁；生活于水体底层，喜流水；在天然水域中以底栖动物、藻类等为食。为我国特有物种，分布于黄河中上游。是甘肃省和宁夏自治区重点保护野生动物之一。2021年大鼻吻鮈被列为国家二级水生野生保护动物。为保护这一珍稀物种，恢复其种群数量，农业部于2007年12月12日批准在黄河青石段建立大鼻吻鮈国家级水产种质资源保护区^［1］。近年来，大鼻吻鮈资源保护工作受到重视，宁夏自治区将大鼻吻鮈列为黄河增殖放流重点鱼类，但目前其规模化人工繁育技术尚不成熟。国内外关于大鼻吻鮈的相关研究极少，仅对其含肉率及肌肉营养成分^［2］、脂肪酸组成^［3］等有少量研究。同亚科鱼类胚胎发育的研究报道有长鳍吻鮈（Rhinogobio ventralis）^［4］和唇䱻（hemibarbus labeo）^［5］等，但有关大鼻吻鮈胚胎发育尚无报道。本试验在人工繁殖技术获得成功的基础上，利用显微镜观察并分析了人工繁殖的大鼻吻鮈胚胎和仔鱼发育过程，描述了其发育各时期的形态特征，旨在探索大鼻吻鮈生物学特性及胚胎发育规律，为大鼻吻鮈规模化人工繁育奠定基础，并为大鼻吻鮈资源保护、种群恢复及其相关研究提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源与人工催产

试验于2022年6~9月在宁夏水产研究所科研基地进行，大鼻吻鮈成熟亲鱼采捕于黄河宁夏段，暂养于1.60 m×0.90 m×0.60 m循环水缸内，控温24 ℃左右，微流水饲养，不间断充气增氧。

选取性成熟度好（雌鱼腹部膨大且柔软；雄鱼轻压腹部有精液从泄殖孔流出且在水中易散开）、体表无伤的雌雄鱼各1尾，其中雌性亲鱼体质量0.14 kg，全长26.70 cm，体长22.90 cm，雄性亲鱼体质量0.13 kg，全长24.70 cm，体长20.80 cm。

催产所用药物为促黄体素释放激素类似物LRH-A₂。大鼻吻鮈雌性亲鱼注射量按照每千克鱼体质量注射LRH-A₂ 5 µg，雄性亲鱼可直接挤出精液未注射催产剂。采用干法人工授精^［6］获得受精卵。将受精卵转移进实验室充气的孵化框内静水孵化，避免阳光照射。同时，在3个培养皿内各随机取样100粒，并每30 min更换1次曝气水直至破膜，计算其平均孵化率。胚胎发育条件：孵化水温（21.9~24.2）℃，溶解氧>6.90 mg/L，pH 8.71~8.86，氨氮0.30~0.64 mg/L，亚硝酸盐0.06~0.25 mg/L。出膜后仔鱼转入室内鱼苗箱培育，培育箱为0.8 m×0.6 m×0.5 m的白色亚克力箱，箱内水温26 ℃，氨氮0.02~0.23 mg/L，亚硝酸盐0.01~0.05 mg/L，培育用水为曝气24 h以上的自来水与黄河水1∶1配成，水深约0.4 m，全过程保证氧气充足供给。

1.2 胚胎及仔鱼发育观察

受精后24 h内，随机选取60粒受精卵置于培养皿内，在4倍光学显微镜下连续观察并拍照记录，期间及时挑出死卵并补卵，随后每1 h观察1次，每次随机选取约30粒受精卵置于培养皿内，记录其不同发育时期形态特征及发育时间，同时记录水温，直至出膜。观察的样本中以半数胚胎发生形态变化时作为判定进入下一发育时期的依据，该阶段的持续发育时间为前一个发育阶段至下一个发育阶段的时间间隔。发育过程分期参考鱼类胚胎发育相关文献^{［7］-［16］}。出膜后每隔24 h取3尾仔鱼置于培养皿内，记录其特征。

1.3 数据分析

记录试验获得的受精卵数量、各阶段胚胎发育时间及温度。受精率、孵化率及积温采用以下公式计算：

受精率（%）=（原肠胚期后正常受精卵数/卵子总数）×100%；

孵化率（%）=（n₁+n₂+n₃/300）×100%

n₁、n₂、n₃为3组培养皿中孵化出的仔鱼数量；胚胎发育各阶段的积温（℃·h）=此阶段胚胎发育时间（h）×水温（℃）。照片使用Adobe Photoshop 2020软件处理后，作为大鼻吻鮈胚胎发育不同阶段的特征模版照片。受精卵卵径使用Motic显微镜内置程序（Motic Images Plus 3.0）测量，出膜仔鱼长度使用游标卡尺测量。

2 结果与分析

2.1 大鼻吻鮈胚胎发育时序及形态特征

本试验共计采卵1 335粒，受精率为86.0%，孵化率为98.7%。大鼻吻鮈的成熟卵子饱满且呈浅绿色，卵圆球形，为漂流性卵，卵径（0.60±0.08）mm。受精卵吸水膨胀后，卵径（0.76±0.08）mm。在水温22.1~24.2 ℃下，大鼻吻鮈胚胎发育历时40 h 26 min，经历胚盘期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期及孵化出膜7个阶段，每个发育阶段又有若干个发育时期，胚胎发育过程见图1。胚胎发育各时期的发育特征如下。

2.1.1 受精卵阶段

受精后卵膜吸水膨胀。受精卵逐渐转为灰白色，原生质向动物极积累，形成深色隆起的胚盘。

2.1.2 卵裂阶段

受精后0.85、1.58、1.87、1.92、2.15、3.05 h，积温分别达到43.97、44.43、45.62、51.05、72.29、86.92 ℃·h，本阶段0.85~3.67 h，历时2.82 h。

２细胞期：受精后51 min，水温23.6 ℃，胚盘第1次卵裂，形成2个大小基本相同的分裂球（图 1-A）。

４细胞期：受精后1 h 34 min，水温23.8 ℃，胚盘第2次卵裂，形成4个前后排列，相对独立且大小基本相同的2×2排列的分裂球（图 1-B）。

8细胞期：受精后1 h 52 min，水温23.8 ℃，胚盘第3次卵裂，形成２排呈前后排列大小略有差异的8个2×4排列的卵裂球（图1-C）。

16细胞期：受精后1 h 55 min，水温23.8 ℃，胚盘第4次卵裂，形成4行4列大小略有差异的16个4×4排列的卵裂球（图1-D）。

32细胞期：受精后2 h 9 min，水温23.8 ℃，胚盘第5次卵裂，形成排列不整齐大小略有差异的32个4×8排列的卵裂球，胚胎逐渐侧偏（图1-E）。

多细胞期：受精后3 h 3 min，水温23.6 ℃，胚盘经过多次卵裂，分裂球增多，体积变小，排列重叠程度增大，细胞界限模糊但仍可分辨（图1-F）。

2.1.3 囊胚阶段

受精后3.67、4.47、5.50 h，积温分别达到105.8、129.2、139.55 ℃·h，进入囊胚早期、囊胚中期和囊胚晚期。本阶段3.67~5.95 h，历时2.28 h。

囊胚早期：受精后3 h 40 min，水温23.6 ℃，随着细胞分裂，体积逐渐变小，已看不清细胞界限，囊胚层外层凸出，胚盘隆起达到最高（图1-G）。

囊胚中期：受精后4 h 28 min，水温23.3 ℃，细胞继续分裂，胚层高度有所下降，已无细胞界限（图1-H）。

囊胚晚期：受精后5 h 30 min，水温23.3 ℃，囊胚细胞进一步扩散，胚盘边缘细胞沿卵细胞表面向植物极扩散，逐渐包围卵黄（图1-I）。

2.1.4 原肠胚阶段

受精后5.95、8.22、8.75 h，积温分别达到191.76、203.95、222.27 ℃·h，进入原肠早期、原肠中期和原肠晚期。本阶段5.95~9.55 h，历时3.60 h。

原肠早期：受精后5 h 57 min，水温23.0 ℃，细胞不断分裂且分裂球移动位置，胚层下包至卵黄直径的1/3处（图1-J）。

原肠中期：受精后8 h 13 min，水温23.0 ℃，胚层继续下包至卵黄直径的1/2~2/3时，形成胚盾（图1-K）。

原肠晚期：受精后8 h 45 min，水温23.0 ℃，胚盾扩大伸长，胚层下包至卵黄直径的2/3~4/5，胚盾延伸至动物极外，胚盾前端扩展并隆起，形成脑泡原基（图1-L）。

2.1.5 神经胚阶段

受精后9.55、11.85 h，积温分别达到274.71、308.91 ℃·h，进入神经胚期和胚孔封闭期。本阶段9.55~13.38 h，历时3.83 h。

神经胚期：受精后9 h 33 min，水温22.9 ℃，胚层下包至卵黄直径的4/5~5/6，胚环缩小，胚体延长，胚体背部形成神经板，出现卵黄栓（图1-M）。

胚孔封闭期：受精后11 h 51 min，水温22.8 ℃，胚层进一步下包并逐渐覆盖卵黄，卵黄栓消失，在卵黄栓末端形成圆形的胚孔，胚孔收缩直至闭合，胚体延长（图1-N）。

2.1.6 器官形成阶段

受精后13.38、14.33、15.10、16.17、18.20 h，积温分别达到329.21、346.23、370.73、417.63、424.1 ℃·h，肌节、眼基、眼囊、尾芽和尾鳍依次形成，18.48 h眼晶体出现，19.98 h进入肌肉效应期，21.53 h耳石出现，24.05 h进入心脏搏动期。本阶段13.38~40.43 h，历时27.05 h，积温达到945.11 ℃·h。

肌节出现期：受精后13 h 23 min，水温22.3 ℃，头部前端增大，胚体略圆，胚体中段形成多个体节且随时间的增长而增加（图1-O）。

眼基出现期：受精后14 h 20 min，水温22.1℃，胚体头部前端比尾部略高，头部中央两侧出现一对肾状突起形成眼基（图1-P）。

眼囊形成期：受精后15 h 6 min，水温22.9 ℃，胚体头尾部继续延伸，头尾更接近，卵黄体接近圆形，胚体眼囊清晰，前端两侧呈长椭圆形，脊索清晰（图1-Q）。

尾芽出现期：受精后16 h 10 min，水温23.1 ℃，胚体增大，尾部与卵黄囊分离，后腹部出现尾芽，胚体与卵黄囊被尾芽部的一层膜状结构隔开（图1-R）。

尾鳍出现期：受精后18 h 12 min，水温23.1 ℃，尾芽突出卵黄体形成尾鳍，肢体轻微扭动，头尾部更加接近（图1-S）。

眼晶体形成期：受精后18 h 29 min，水温23.1 ℃，胚体继续延伸，脊索非常清晰，眼囊内部可见晶体轮廓（图1-T）。

肌肉效应期：受精后19 h 59 min，水温23.1 ℃，胚体继续伸长，尾部边缘呈皱褶状，胚体进行无规律的间歇性颤动（图1-U）。

耳石出现期：受精后21 h 32 min，水温23.7 ℃，脊索前端上方有小泡状耳囊，眼囊凹陷，尾鳍延长，肌肉收缩加强，眼前方有一对浅的凹陷，耳囊内出现细小石粒（图1-V）。

心脏搏动期：受精后24 h 3 min，水温24.0 ℃，尾部伸长，眼下后方腹面的心脏开始跳动，由弱到强，胚体伸直（图1-W）。

2.1.7 孵化出膜阶段

受精后40 h 26 min，胚体通过头尾部不断拍击、扭动顶破卵膜，在胚体剧烈扭动下，仔鱼孵化出膜，大部分尾部先出膜，也有部分头部先出膜。出膜后仔鱼静卧水底，偶能挣扎弹起，间歇性游动。本阶段历时6.78 h，其中初始出膜时间为35.05 h，25%出膜时间为38.83 h，50%出膜时间为40.43 h，75%出膜时间为42.95 h，最迟出膜时间为47.21 h（图1-X）。

2.2 大鼻吻鮈胚胎发育的有效积温

大鼻吻鮈孵化过程的有效总积温为各个阶段的有效积温之和，计算得大鼻吻鮈胚胎发育的有效总积温为964.05 ℃·h（表 2）。

2.3 大鼻吻鮈仔鱼发育

在室温26 ℃条件下，初孵仔鱼全长约3.00~4.00 mm。体透明，体节明显；卵黄囊前部膨大，呈椭圆形，与头部相连，后部细长呈棒状，可见点状的黑色素细胞，排列于腹部及卵黄囊外周，眼部色素沉积较模糊，眼囊突出于头部两侧，眼轮廓明显，不能自行游泳，心跳101~132次/min（图2-A）。

出膜后第1天，全长约5.00~5.10 mm，体透明，卵黄囊缩小，游泳能力弱，与初孵仔鱼相比，黑色素细胞变得更大且密集，眼部有少量黑色素沉积，脑部上方有少量的黑色素细胞，心跳约107~132次/min（图2-B~C）。

出膜后第2天，仔鱼全长约5.10~5.30 mm，卵黄囊前部球状部分较第1天略有缩小，后部棒状部分逐渐增大，分布血管显著增多；眼部色素沉积，已呈黑色；胸鳍部位可见小的凸起，即胸鳍芽开始出现；可观察到鳃部组织轮廓；血细胞增多，观察到心脏部位呈淡红色，心跳约129~149次/min；运动能力增强。从孵化出膜到卵黄囊吸收完毕，大鼻吻鮈早期仔鱼的营养来源均由卵黄囊提供（图2-D）。

出膜后第３天，全长约5.10~5.25 mm，心跳约110~137次/min，卵黄囊消失且泄殖孔已开，饲喂少量蛋黄，肠道中可见少量蛋黄，在水中能够自由运动（图2-E~G）。

出膜后第４天，全长约5.20~5.25 mm，鳃盖张合运动明显；色素在头、背部沉积增多；仔鱼在水底出现扎堆现象（图3-H~I）。

出膜后第5天，仔鱼全长约5.20~5.30 mm，体长未发生显著变化，但是器官进一步发育，游泳能力增强，心跳加快约165~167次/min，与其他鲤科鱼类发育模式类似^［17-18］（图2-J）。

3 讨论

3.1 大鼻吻鮈胚胎发育特征

大鼻吻鮈与多鳞白甲鱼（Varicorhinus macrolepis）^［19］、拟赤梢鱼（Pseudaspius leptocephalus）^［20］、扁吻鱼（Aspiorhynchus laticeps）^［21］、拉萨裂腹鱼（Schizothorax waltoni Regan）^［22］、硬刺松潘裸鲤（Gymnocypris potanini firmispinatus）^［23］、马口鱼（Opsariichthys bidens）^［24］、长鳍吻鮈^［25］、祁连山裸鲤（Gymnocypris chilianensis）^［26］、鲈鲤（Percocypris pingi pingi）^［27］、似刺鳊鮈（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）^［29］等其他鲤科鱼类早期发育见表3。

大鼻吻鮈受精卵直径为（0.60±0.08） mm，与同科的拟赤梢鱼、马口鱼及长鳍吻鮈等的受精卵大小较为接近。本试验中大鼻吻鮈使用的孵化水温及孵化时间接近于拟赤梢鱼和马口鱼。相关研究表明，卵径小则其能量和营养物质缺乏，对低水温、稀缺饵料等恶劣条件更加不适^［19］。成熟受精卵的大小是胚胎发育、后期器官分化及仔鱼生长重要影响因素之一，卵径越大，胚胎发育有效积温越高，胚胎发育越慢。与其他11种鲤科鱼类相比，本试验中使用的孵化水温较高，大鼻吻鮈的受精卵偏小，整个胚胎发育过程时间偏短。

在胚胎发育这一复杂过程中，细胞增殖与分化以不同的速度同时出现^［30］，据此，可将大鼻吻鮈胚胎发育过程分为7个连续阶段（包含26个时期）：受精卵、卵裂、囊胚、原肠、神经胚、器官发生和出膜，其中器官发生阶段耗时最长。

在动物进化过程中，其胚胎发育过程具有高度的相似性^［31］。与鲤科鱼类^［32-40］相比，大鼻吻鮈胚胎发育过程中仅个别阶段存在差异，且主要表现在原肠中期和原肠晚期。如圆口铜鱼（Coreius guichenoti）在原肠中期，胚层下包至约卵黄囊2/3^［32］，尖裸鲤（Oxygymnocypris stewartii）胚层下包至约卵黄囊1/2^［36］，而大鼻吻鮈胚层下包至1/2~2/3；在原肠晚期，圆口铜鱼胚层下包至约卵黄囊3/4^［32］，云南盘鮈（Discogobio yunnanensis）覆盖胚体约4/5^［39］，而大鼻吻鮈胚层下包至3/4~4/5。对于这些差异，有学者认为一方面来自物种本身及生存环境的差异，另一方面可能在于观察时对胚胎发育时期的确定标准不一致^［41］。

3.2 水温对大鼻吻鮈胚胎发育的影响

鱼类胚胎发育受环境因素影响极大，谢仰杰等研究证明温度是影响鱼类胚胎发育的主要环境因素^［42］，胚胎发育时间随温度的升高而缩短^［43-44］。但超过一定的温度范围，可能会引起胚胎发育的停滞、畸形甚至死亡。本次试验是在宁夏气温、水温较高的6、7月份期间开展，试验水温（23.2±1.0）℃高于大鼻吻鮈自然繁殖的黄河水温（15~17）℃，其胚胎孵化时间最迟为47.21 h，大鼻吻鮈胚胎发育所需时间及温度与同亚科相比，长于余志堂等人对圆口铜鱼（35.55 h，18.2~32.8 ℃）^［45］和李修峰等对银鮈（Squalidus argentatus）的研究结果（40 h，17.5~27.0 ℃）^［46］；与胡佳祥等人对圆口铜鱼的研究结果（48.5 h，20.11±017 ℃）^［33］极为接近，短于产漂流性卵鱼类的长鳍吻鮈（56 h，17.6~18.3 ℃）^［25］，明显短于同亚科的蛇鮈（Saurogobio dabryi Bleeker）（81 h，15.5~17.5 ℃）^［47］和唇䱻（195 h，12.5~18.5 ℃）^［5］。本次试验在原肠胚后统计受精率为86.0%，出膜率高达98.7%，说明试验水温（23.2±1.0）℃在大鼻吻鮈胚胎发育适宜范围之内。

3.3 大鼻吻鮈胚胎发育积温

在进化过程中，鱼类也表现出对生活环境的适应性，在一定积温下仔鱼才能正常出膜和成活。通常用积温来表示鱼类的胚胎发育速度，积温是胚胎发育某阶段的发育时间与水温的乘积，积温值越大，其胚后各种生理功能越完善，对外界环境不良影响的抵抗力越强，进而提高其稚鱼成活率^［48］。本研究表明，大鼻吻鮈在（23.2±1.0）℃的水温条件下，从受精到孵化出膜的积温为964.05 ℃·h，低于同亚科长鳍吻鮈（17.35 ℃，1 275.44 ℃·h）^［16］、拟赤梢鱼（23 ℃，1 102.09 ℃·h）等，远高于同科赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）（28 ℃，453 ℃·h）^［49］。

3.4 大鼻吻鮈仔鱼发育特征

据报道，初孵仔鱼的体型越大，其口裂也越大，更有利于获取开口饵料，大鼻吻鮈初孵仔鱼全长3.00~4.00 mm，与马口鱼（3.74±0.04）mm^［24］接近，小于长鳍吻鮈（6.25~6.36）mm^［16］ 、草鱼（Ctenopharyngodon idella）（5.50~7.00）mm^［50］、赤眼鳟5.60 mm^［51］。相关研究表明，初孵仔鱼的生长速度、存活率均与其卵径大小呈正相关，即卵径越大的仔鱼生长越迅速^［19］。

对于人工繁育的种苗，开口期是鱼类在早期发育过程中生命活动最敏感的时期。观察发现大鼻吻鮈卵黄囊在出膜后第2天基本完全消耗吸收，需要外源性营养供给发育所需能量，而仔鱼初次摄食的质量和采食量也是影响仔鱼存活的关键，这也可能是造成大鼻吻鮈种群数量减少的先天性因素之一，因此在今后开展大鼻吻鮈人工繁育技术研究时，开口饵料的及时供给应是较为关键的一环。

4 结论

本试验获得的相关参数为大鼻吻鮈规模化人工繁育提供了科学依据，在提高大鼻吻鮈增殖放流数量、促进野生种群数量恢复方面具有重要意义。

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基金资助

宁夏重点研发计划项目“大鼻吻鮈种质资源保护遗传学及生殖发育和人工繁育技术研究”(2023BCF01013)

农业农村部财政专项“黄河渔业资源与环境调查”项目(HHDC-2022-02)

2022年自治区重点研发计划黄河流域生态环境保护与高质量发展科技支撑专项“黄河宁夏段公路斜拉桥绿色低碳建管养关键技术研究”(2022BEG02056)