球茎甘蓝qRT-PCR内参基因的筛选及稳定性验证

Screening and stability verification of kohlrabi reference genes

摘要

目的 通过对已知内参基因进行筛选，确定球茎甘蓝最合适的内参基因，确保实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的准确表达。 方法 本试验选择了11种参考基因，利用GeNorm、Normalfinder和Bestkeep软件对紫色球茎甘蓝和绿色球茎甘蓝不同部位的内部参考基因进行了分析。 结果 3个分析结果显示，内参基因Tip41在球茎甘蓝不同组织部位表达最稳定。 结论 Tip41是作为内参基因的最佳选择，为球茎甘蓝后续的分子生物学相关研究提供基础。

Abstract

Objective By screening known reference genes，the most appropriate reference genes in cabbage were identified to ensure the accurate expression of quantitative real-time PCR （QRT-PCR）. Method Eleven reference genes were selected in this experiment，and the internal reference genes of different parts of purple and green cabbage were analyzed by GeNorm，Normalfinder and Bestkeep software. Result Three analysis results showed that the internal reference gene Tip41 was expressed most stably in different tissue parts of kohlrabi. Conclusion Tip41 was the best choice as an internal reference gene，provide a basis for the subsequent molecular biology related studies of kohlrabi.

Graphical abstract

关键词

球茎甘蓝 / 内参基因 / 荧光定量

Key words

kohlrabi / reference gene / quantitative real-time PCR

Author summay

郭怡婷，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

球茎甘蓝（Kohlrabi，Brassica caulorapa Pasq.）是十字花科植物家族的一员，起源于欧洲北部海岸。球茎甘蓝耐高温和低温，并且可以在早季和晚季种植^［1］。作为一种蔬菜作物，球茎甘蓝对人类健康饮食具有丰富的营养价值，可以提供高水平的抗氧化剂和促进健康的物质^［2］，如维生素C、维生素E、类胡萝卜素、抗坏血酸和生育酚^［3-5］。

与传统的聚合酶链式反应（PCR）相比，定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）具有高度特异性、快速性和敏感性等优点，这使其常被用来研究植物的基因功能和调控^［6-7］。因此，确保相关基因表达分析的准确性十分重要^［8］。qRT-PCR广泛应用于基因检测、科学研究、药物研发与疾病诊断等领域^［9-10］。在适当内参基因作为对照的情况下，不同试验条件下的基因可以稳定表达。不同处理下各作物内参基因的选择不尽相同。植物基因表达研究最常用的参考基因是UBQ、β-TUB、18S rRNA和25S rRNA、GAPDH、eEF、eIF1、ACT、ACCase等^［11］。尽管已知这些基因在任何特定条件下都有稳定的表达，但有研究表明它们在不同植物物种或不同胁迫条件或发育阶段之间表达水平的差异^［12-14］。由于没有任何基因可以作为通用参考基因，因此有必要系统地为每个物种选择和确定合适的参考基因^［15-16］。

Ma^［17］等对不同非生物胁迫下冬油菜（Brassica rapa L.）内参基因的选择进行了研究，发现在不同处理中最稳定的内参基因分别为高温胁迫叶片中的F-box和SAND，高温胁迫根系中的PP2A和RPL，冷胁迫叶片中的β-actin和SAND，冷胁迫根系中的β-actin和EF1a，PEG胁迫下叶片中的RPL和PP2A，以及PEG胁迫下根系中的PP2A和RPL，盐胁迫叶片中的SAND和PP2A，盐胁迫根系中的RPL和UBC。在红葱不同组织部位中，UBQ1（Unigene0006851）是最佳稳定表达的内参基因^［18］。在含200 mmol/L NaCl的水培体系中，分别将臂尾草（syn.Urochloa）培养0、6、12和24 h，发现eIF4a是所有处理中最稳定的，而在根和茎中α-TUB5和ACT12是最合适的，与此同时根和茎中最不稳定的是β-TUB6和GAPDH^［19］。在贫育雀麦（Bromus sterilis L.）的三个发育阶段（2叶期、3叶期和4叶期）、两个不同的植物器官（芽和叶）和一个非生物胁迫（干旱胁迫）的处理下，最适合作为内参基因的是18SrRNA和ACCase^［20］。

在球茎甘蓝中，相关栽培技术^［21-22］、指纹图谱^［23］、品种选育^［24］及花青素^［25-28］已有前人作出研究，而作为评价基因表达情况的重要因素内参基因尚未见报道。本试验以两种颜色的球茎甘蓝不同时期各部位为研究对象，了解球茎甘蓝最适合的内参基因，为后续相关分子生物学研究作出基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以2019年11月种植于青海省农林科学院园艺所温室大棚内的紫色球茎甘蓝C8和绿色球茎甘蓝C12各个部位为研究材料（表1），分别于幼苗期（15 d）、膨大期1（30 d）、膨大期2（45 d）、成熟期（60 d）、花期（75 d）5个时期进行取样，以成熟期所有部位作为实时荧光定量表达分析的试验材料，每份材料各部位取3次生物学重复，测定时取3次技术性重复。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取、cDNA合成

使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取成熟时期的C8和C12各部位的总RNA，检测RNA的浓度与纯度，用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）合成cDNA，cDNA溶液终浓度稀释到200 ng/μL左右，保存到-20℃。

1.2.2 球茎甘蓝候选参考基因选择与引物设计

在实时定量PCR内参基因知识库ICG（http：//icg.big.ac.cn/）中以十字花科芸薹属甘蓝种材料作为参照选择出11个内参基因，根据球茎甘蓝重测序注释结果，使用Primer Premier 5设计出11对qRT-PCR引物如表2所示，要求长度在100 bp~200 bp之间，GC含量在40%~60%之间。

使用LightCycler/LightCycler480 System荧光定量PCR仪按如下反应体系进行：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ （TliRNaseH Plus） （TaKaRa），10 μL；上下游引物（10 μmol/L）各1 μL；cDNA模板（200 ng/μL），1 μL；灭菌水，7 μL。

qRT-PCR反应程序为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，55 ℃，30 s，72 ℃，10 s，40个循环；95 ℃，10 min；60 ℃，30 s；95 ℃，1 s。

1.2.3 内部参考基因表达的稳定性分析

选择与球茎甘蓝花青素合成相关的DFR和LDOX基因进行表达引物的设计（表3），方法与内参引物相同。

1.3 数据分析

采用2^-ΔCT法处理Ct值，再利用geNorm、Normfinder、Bestkeeper^［29］软件对11个候选内参基因的表达稳定性进行综合评价排名，通过几何平均法筛选出一个最佳内参基因。利用EXCEL2019进行数据统计计算，利用IBM SPSS Statistics 21进行差异显著分析，使用Origin 2018进行图形制作。用2^-ΔΔCT法计算相对表达量，观察表达情况。

2 结果与分析

2.1 候选内参基因的初步筛选

在使用LightCycler/LightCycler480 System荧光定量PCR仪筛选11组候选基因时发现Tub-a、EF1a、Rpl 18、Ubiq 4个内参基因极其不稳定或在所有组织中表达量都极低，故选择剔除。

2.2 候选基因引物特异性分析

对剩余的7对候选基因进行实时荧光定量分析，发现每对引物对应的溶解曲线（图1）均为单峰，无发卡结构和非特异性扩增，证明所选候选内参基因的特异性优良，所选程序和退火温度都可用于下一步试验，符合qRT-PCR标准。

2.3 Ct值比较候选内参基因稳定性

对7个候选参考基因表达水平的qRT-PCR检测表明，在不同处理下，所有候选参考基因的Ct值在16.47~32.5之间（图2）。CyP表达水平最高，平均Ct为18.78，范围为16.47~24.13，变异系数为7.91%。TIP41和Actin2的平均Ct值分别为26.12、20.83，范围最窄分别为23.79~29.67和18.07~23.64，变异系数为4.74%和5.82%。TIP41-like的表达水平最低，平均Ct为26.66，变异系数为5.14%。在所有处理中，CyP和ACT的变异性最大，变异系数分别为7.91%和7.85%，而TIP41的变异性最小，变异系数为4.74%

2.4 geNorm分析

使用geNorm软件对Ct值进行分析，从而得到最佳内参基因（图3）及其数目（图4）。取所获得的M值小于1.5的内参。分析结果如下所示，从图3可以看出，球茎甘蓝的7个内参基因中，UBC21的稳定值最大，为1.662（表4），M>1.5不适合作为内参基因。UBC30和TIP41的稳定值最小为1.053，7个内参基因在球茎甘蓝不同组织中表达稳定程度由高到低排序为：UBC21 > TIP41-like > Actin2 > ACT > CyP > UBC30 ≥ TIP41。

配对变异值V_n/n+1可用来分析使用多个内参基因配对差异，V_n/n+1和V_n+1/n+2之间差异越小，说明可再添加另一参考基因，当V_n/n+1 <0.15时说明n个基因可以达到校正目的基因表达量的要求。由图5我们可以得出，球茎甘蓝不同部位最佳内参基因数量为1个。

2.5 NormFinder 分析

geNorm软件不能从统计上区分表达模式类似的基因利用，而NormFinder软件可以有效解决这个问题。而且NormFinder不仅可以比较候选基因之间的差异性，而且还可以计算样品组间的变异。NormFinder软件中的稳定性用M值进行评价，M值越小内参基因稳定性越好，反之说明内参基因稳定性越差。对不同组织的候选内参基因使用NormFinder分析结果如表5所示，其中TIP41的M值最小，最小值为0.494；TIP41-like候选基因的M值最大，最大为0.805。7个内参基因在球茎甘蓝不同组织中表达稳定程度由高到低排序为：TIP41-like > Actin2 > UBC21 > ACT > CyP > UBC30 ≥ TIP41。又因NormFinder软件只能筛选出一个最佳内参基因，故在使用NormFinder的软件分析中选择TIP41基因作为最佳内参基因。

2.6 BestKeeper分析

使用BestKeeper软件对不同组织中7个内参基因的表达量进行分析，通过该软件获得相关系数r、变异系数CV和标准差SD，r越大，CV和SD越小内参基因表达越稳定^［30-32］。分析结果如表6所示，其中相关系数r最大的是UBC30（0.952）、其次是ACT（0.572），从高到底排序为：UBC30 > ACT > CyP > TIP41 > TIP41-like > Actin2 > UBC21；最小的是UBC21，最小值为0.572。7个候选基因中变异系数（CV）最小的是TIP41，最小值是4.74，其次是TIP41-like（5.14）从高到低排序依次为：ACT > CyP > UBC30 = Actin2 > UBC21 > TIP41-like > TIP41；标准偏差（SD）最小的值为Actin2（1.21）、最大为ACT（1.69）最不稳定，从高到低排序为：ACT > CyP = UBC21>TIP41-like > UBC30 > TIP41 > Actin2。综合上述3个分析结果，最终得出TIP41为球茎甘蓝不同组织表达最稳定的内参基因。

2.7 几何平均数分析

由于上述3个软件分析出的内参基因的结果存在部分差异 ，故综合采用几何平均值法对3个软件的处理结果进一步处理，从而对7个内参基因在球茎甘蓝不同部位表达稳定性进行综合性排名分析，分析结果如表7所示，稳定性最佳排名为：TIP41 > UBC30 > Actin2 > CyP > ACT > TIP41-like > UBC21。在作为实时荧光定量中内参基因时，可选择2个或多个内参基因来作为对照从而更好的减小误差。

2.8 球茎甘蓝内参基因稳定性分析

以紫色和绿色球茎甘蓝成熟期的各个部位为试验材料，TIP41为内参基因、DFR和LDOX为目的基因进行稳定性分析。结果如图5所示，从图中可以看出在这5个部位中，紫色球茎甘蓝的相对表达量均远高于绿色球茎甘蓝，且以DFR为目的基因进行鉴定时紫色球茎甘蓝在叶柄中表达量最高，而在茎肉中的表达远低于其他4个部位，两种球茎甘蓝均在茎肉中表达最低。以LDOX为目的基因时，紫色球茎甘蓝的表达情况由高到低依次为叶脉、叶柄、茎皮、叶片、茎肉，而绿色球茎甘蓝在两种LDOX基因中表达情况有所不同，具体表现为以LDOX-1为目的基因时叶片的表达量最高，叶脉表达量最低，而在LDOX-2中，茎肉表达量最高，叶脉表达量最低。

3 讨论

qPCR作为生物领域中分析基因表达的常用技术之一，被广泛的应用于植物次生代谢产物的分子机制研究。为了确保试验结果的准确性，需引入内参^［33］。据报道，一些植物中也已进行了相关内参基因筛选的研究，包括草地早熟禾^［34］、马铃薯^［35］、狗牙根^［36］、小麦^［37］、莴苣^［38］和胡杨^［39］等。

已知理想的内参基因在所有的组织或处理中应表现出一致的表达水平^［40］。为了建立11个候选基因表达的稳定性情况，我们采用△Ct、geNorm、Normfinder、Bestkeeper 4个评价指标，利用综合排名情况，最高的表示最稳定，最低的表示最不稳定，从最终排名得出，TIP41是表达最稳定的内参基因。

在菊苣（Cichorium intybus L.）中，Delporte等^［41］证明了TIP41是各种条件下细胞培养中最稳定的参考基因，并在其幼苗上对这些基因进行了平行验证，结果表明，最好的参考基因是Clath。Wang等^［42］分析了甘蓝型油菜叶片中的九个候选参考基因，发现TIP41和PP2A表现最好，在各种条件下都适用。在钝裂银莲花不同部位中以UBQ表现最稳定，而β-TUB相对稳定性最差^［43］；在肉桂和大叶清化桂两种植物的皮、枝、叶不同部位最适的内参基因为GAPDH^［44］；在药用植物老鸦瓣中，UBC和UBI均适合作为其不同器官和芽茎不同发育时期基因表达研究的内参基因^［45］，晋海军等^［46］还研究了中药材植物川续断植物的内参基因，结果表明DaACT103和DaTUB5均可作为川续断的内参基因。以上研究表明不同植物在不同部位及不同的发育阶段中，内参基因的稳定稳定性随着不同部位及不同的发育阶段的改变而改变，这也进一步验证了筛选内参基因的重要性。本研究所筛选出的最佳内参基因为TIP41，这和其他十字花科作物的研究结果相同^［47］。

4 结论

通过Ct值稳定性分析、geNorm、NormFinder、BestKeeper和几何平均值法综合分析7种内参基因在球茎甘蓝不同组织中的表达稳定性，可以得出TIP41为最佳内参基因，通过目的基因DFR和LDOX的表达分析验证了这一结果，且表达最稳定，可在球茎甘蓝实时荧光定量表达分析中当作内参基因使用。

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基金资助

国家大宗蔬菜产业技术体系-西宁综合试验站项目(CARS-23-G26)

青藏高原种质资源研究与利用实验室(2022-ZJ-Y01)

青海省重点研发与转化项目(2021-NK-124)

西宁市重大科技专项项目(2021-Z-03)