番茄小孢子发育时期与花器形态的相关性

Correlation of microspore development period and floral organ morphology of tomato

摘要

目的 明确番茄小孢子发育时期与花器形态的相关性，为番茄花药培养和小孢子培养提供理论和实际依据。 方法 以大粉果安纳西和大红果SV4224TH 2个番茄品种为材料，对不同发育时期花器各部分的颜色与大小进行测定与计算，采用改良苯酚品红染色法进行小孢子细胞学观察。 结果 2个番茄品种小孢子发育均经历了单核早中期、单核靠边期、双核期和成熟花粉粒时期，且各发育时期细胞学特征明显；小孢子各发育时期与花器外观形态密切相关，当番茄花蕾较小（安纳西纵径为5.54~8.83 mm、横径为2.33~3.35 mm；SV4224TH纵径为5.44~9.19 mm、横径为2.38~3.56 mm），花萼略微裂开呈绿色，花冠呈浅绿色且花药呈浅黄色时，小孢子处于单核靠边期；当小孢子处于单核靠边期时，2个品种的单核靠边期小孢子占比与花蕾纵径、横径呈极显著正相关，其相关系数分别为0.903、0.879和0.879、0.710，而与花蕾的纵横经比，花药的纵径、横径、纵横径比无极显著相关性；花蕾纵径在7.00~7.99 mm时，安纳西和SV4224TH单核靠边期小孢子占比最高，分别为98.50%和94.50%；花蕾横径在2.00~2.99 mm时，二者最高值分别为68.15%和61.55%。 结论 安纳西和SV4224TH的小孢子培养的最佳选蕾标准为花蕾纵径在7.00~7.99 mm，花萼略微裂开呈绿色，花冠呈浅绿色且花药呈浅黄色。

Abstract

Objective The study aimed at clarifying the correlation between microspore development stages and floral morphology of tomato，laying a theoretical and practical basis for tomato anther and microspore cultures. Method Two tomato varieties，i.e.，big pink fruit Annecy and big red fruit SV4224TH，were employed as the materials，followed by measuring the color and size of each part of floral organs at different development stages and observing microspore cytology with the method of Modified phenol fuchsin staining. Result The microspore development of the two tomato varieties experienced early and mid‐uninucleate stage，late uninucleate stage，binuclear stage and mature pollen stage，and the cytological characteristics of each development stage were obvious.Each stage of microspore development was closely related to the appearance and morphology of floral organs.When tomato buds were smaller (Annecy’s longitudinal diameter was 5.54~8.83 mm，and transverse diameter was 2.33~3.35 mm; SV4224TH’s longitudinal diameter was 5.44~9.19 mm，and transverse diameter was 2.38~3.56 mm)，the calyx was slightly dehiscent and green，and the corolla was light green and the anthers were light yellow，the microspores were being at the late uninucleate stage.When the microspores were in the late uninucleate stage，the proportion of microspores of the two varieties was extremely significantly positively correlated with both longitudinal and transverse diameters of the flower buds，and the correlation coefficients were 0.903，0.879 and 0.879，0.710，respectively，while there was no significant correlation with the aspect ratio of buds，the longitudinal and transverse diameter，and with the aspect ratio of anthers.When the longitudinal diameter of flower bud was 7.00~7.99 mm，the proportion of microspore at mononuclear marginal stage was the highest，which were 98.50% and 94.50% for Annecy and SV4224TH，respectively.When the transverse diameter of flower bud was 2.00~2.99 mm，the highest values of two varieties were 68.15% and 61.55%，respectively. Conclusion For both Annecy and SV4224TH，the suitable stage of buds selected for microspore culture was that their longitudinal diameter was 7.00~7.99 mm，the calyx was slightly split and green，and the corolla was light green and the anther light yellow.

Graphical abstract

关键词

番茄 / 小孢子 / 花器形态 / 发育时期 / 单核靠边期

Key words

tomato / microspore / floral organ morphology / development stage / late uninucleate stage

Author summay

王凯彬，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

番茄（Lycopersicon esculentum Mill）是茄科（Solanaceae）番茄属一年生或多年生草本植物，又名西红柿，洋柿子，原产于南美洲^［1］，是全球栽培最广的蔬菜作物。中国是世界上番茄种植面积最大的国家及世界第一大番茄制品出口国^［2-3］，而地处中国西北地区的宁夏凭借独特的气候优势及当地政府的引导与支持，迅速成为我国越夏番茄种植主产区之一^［4］，因此宁夏积极开展番茄遗传育种研究与新品种选育工作。

单倍体育种是生物技术育种中非常重要的方法之一，具有广阔的应用前景^［5-6］。而其中的花药培养是克服杂种性状分离，通过染色体加倍，加速育种进程，提高选育效率，能够在较短时间内获得一批纯系的单倍体育种方法^［7-8］。影响单倍体育种成败的关键因素之一是小孢子所处的发育时期^［9-10］，不同发育时期的小孢子对花药培养的效果有很大差异，一般认为单核靠边期是花药培养的最佳时期^［11］。目前在四季报春（Primula obconica Hance）^［12］、菜心（Brassica rapa syn.Campestris ssp.Chinensis var.Utilis Tsen et Lee）^［13］、黄花菜（Hemerocallis citrine Baroni）^［14］、黑皮冬瓜（Benincasa hispida Cogn）^［15］和人参（Panax ginseng C.A.Meyer）^［16］等多种植物中发现，小孢子发育时期与花器形态密切相关^［17］。但小孢子发育时期对应的花器形态指标因植物不同也不尽相同，所以在花药培养中准确判断小孢子发育时期的花器形态特征是非常有必要的^［18］。关于番茄小孢子发育时期与花器形态相关性的研究中，辛建华等^［9］得出春季日光温室种植的里格尔87-5番茄品种花蕾纵径为5.0~8.0 mm、横径为2.5~3.4 mm，花药呈黄绿色且较易分离时，其小孢子处于单核靠边期；罗佳等^［19］发现春季露地种植的3个大果型番茄杂交品种，花蕾纵径为10.9~14.3 mm，横径为3.3~4.4 mm，且花药纵径为5.0~8.2 mm，花药颜色为黄绿色或淡绿色时，小孢子处于单核靠边期；而单淑玲等^［10］发现，种植于夏季日光温室的3个加工番茄杂交品种花蕾纵径在5.00~6.99 mm时，60%左右的小孢子处于单核靠边期。综上可见，小孢子处于单核靠边期的选蕾标准受番茄品种和环境条件等其他因素的影响。另外，小孢子发育存在一定程度的渐续性（即不同步性），相同的花药内往往包含着几个发育时期的小孢子^［20］，而辛建华等^［9］和罗佳等^［19］的研究结果里，未关注到单核靠边期小孢子占比，单淑玲等^［10］研究结果里关注到了单核靠边期小孢子占比与花蕾纵径的相关性，但与花器其他部分形态的相关性不得而知，因此有必要对不同发育时期的单核靠边期小孢子占比与花蕾及其花药的纵径、横径、纵径横径比的相关性进行分析和研究。

本研究以安纳西和SV4224TH 2个基因型不同的番茄品种为材料，通过对番茄花器形态的观察与测量，研究小孢子不同发育时期与花蕾及其花药的颜色、纵径、横径、纵径横径比的相关性，重点确定小孢子单核靠边期的花蕾及其花药的形态，以便根据花器外部形态可以快速、准确地找到单核靠边期小孢子占比最高的时期，为番茄花药培养及单倍体育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

番茄品种海泽拉的安纳西（大粉果）和圣尼斯的SV4224TH（大红果）由宁夏巨丰种苗有限责任公司提供，二者为无限生长型，植株生长旺盛，连续坐果能力强。

1.2 试验方法

1.2.1 采样

番茄在5月初育苗后，于4叶期移栽至宁夏大学实验农场番茄育种基地进行露地栽培，在晴天上午8∶00~10∶00时，采蕾环境温度范围在15~22 ℃，用刀片采摘不同品种生长健壮植株上大小不同的花蕾，装入自封袋内做好标记并放入冰盒内快速带回实验室。

1.2.2 花器形态特征的观察与测量

用游标卡尺测量花蕾基部到顶部的长度，将其分为7个长度区间等级，分别为：4.00~4.99 mm；5.00~5.99 mm；6.00~6.99 mm；7.00~7.99 mm；8.00~8.99 mm；9.00~9.99 mm和10.00 mm以上，然后观察花蕾与花药的形态特征，花药的取出要用镊子在解剖镜下小心剥去萼片和花瓣，并用游标卡尺测量每个花蕾和花药的纵径、横径，以及计算纵横径比。

1.2.3 小孢子细胞学的观察

参照何兰花和卢家^［21］的方法配制改良苯酚品红染色液，并参照余毓君^［22］的方法取材和压片。将制成的临时装片置于Olympus SC180光学显微镜下观察，先在低倍镜下寻找花粉母细胞，一般花粉母细胞呈圆形或扁圆形，观察到有一定分裂相的花粉母细胞后，再在40倍物镜下观察小孢子所处的发育时期并拍照保存。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件整理数据及计算，SPSS 20.0统计软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 番茄小孢子不同发育时期细胞学特征

光学显微镜下观察到番茄小孢子发育经历了单核早中期、单核靠边期、双核期和成熟花粉粒时期（图1）。单核早中期的小孢子呈圆形，细胞中心有细胞核，液泡较小不明显（图1-A）；小孢子进一步发育，大液泡开始形成，向一边挤压细胞质，细胞核从中心被挤压到靠近细胞壁，即为单核靠边期（图1-B）；随着小孢子继续发育，经过1次不均等有丝分裂，形成2个核，即为双核期（图1-C）；之后细胞继续膨大边缘变圆，能观察到3个呈凹透镜形状的萌发孔，标志着小孢子进入成熟花粉粒时期（图1-D）。

2.2 番茄小孢子发育时期与花蕾和花药外观形态相关性

安纳西和SV4224TH这2个品种番茄的花蕾和花药外部形态由图2和表1可知，随着小孢子发育时期的变化，花蕾纵横径逐渐变大，萼片逐渐裂开，其颜色由浅绿色过渡到绿色，花冠逐渐张开，图2-B及图2-D是从对应的图2-A和图2-C花蕾中剥离的花药，花药纵横径也逐渐变大，其颜色由浅黄绿色过渡到黄色。当花蕾很小，闭合严密，萼片呈浅绿色，花药呈浅黄绿色时，小孢子处于单核早中期；适宜取材的花蕾在单核靠边期，表现为花蕾较小，花萼略微裂开呈绿色，花冠呈浅绿色，花药呈浅黄色；花萼完全裂开，花冠略微张开呈黄色，花药也呈黄色时，小孢子进处于双核期；当花蕾完全长大并且花冠完全张开时，小孢子进入成熟花粉粒时期。

2.3 番茄小孢子发育时期与花蕾和花药大小相关性

对安纳西和SV4224TH这2个品种番茄小孢子发育时期的花蕾和花药大小进行比较，由表2所示，随着小孢子发育时期的变化，花蕾和花药的纵径、横径及纵横径比均呈增长的趋势。当小孢子由单核早中期发育为成熟花粉粒时期时，安纳西番茄花蕾和花药的纵径、横径及纵横经比分别经历4.32~13.86 mm、2.27~5.14 mm、1.85~3.76、2.51~9.61 mm、1.81~4.03 mm、1.35~2.54的增长变化；SV4224TH番茄花蕾和花药的纵径、横径及纵横经比分别经历4.35~13.63 mm、2.03~5.25 mm、2.17~3.38、2.53~9.52 mm、1.83~4.29 mm、1.36~2.49的增长变化。其中，当安纳西番茄的花蕾纵径为5.54~8.83 mm、横径为2.33~3.35 mm以及纵横径比为2.30~2.59时，花药纵径为3.27~7.02 mm、横径为2.18~3.36 mm以及纵横径比为1.45~2.13时；SV4224TH番茄的花蕾纵径为5.44~9.19 mm、横径为2.38~3.56 mm以及纵横径比为2.23~2.42时，花药纵径为3.51~7.15 mm、横径为2.29~3.33 mm以及纵横径比为1.54~2.21时，2个品种番茄小孢子具体处于单核靠边期。

针对安纳西和SV4224TH这2个番茄品种，为了研究小孢子各发育时期的单核靠边期小孢子占比与花蕾及其花药大小之间的相关程度，以单核靠边期小孢子占比、花蕾纵径、横径及纵横径比和花药纵径、横径及纵横径比7个数量性状进行相关性分析。从表3、4得出，2个番茄品种的7个数量性状间绝大部分为极显著或显著正相关。2个番茄品种小孢子在不同发育时期时，单核靠边期小孢子占比与花蕾纵径，花蕾纵径与花蕾横径、花药纵径都是呈极显著或显著正相关。当小孢子具体处于单核靠边期时，2个品种的单核靠边期小孢子占比与花蕾纵径、横径呈极显著正相关，其相关系数分别为0.903、0.759和0.879、0.710，而与花蕾的纵横经比，花药的纵径、横径、纵横径比无极显著正相关。花蕾横径与花药纵横径，花药纵径与花药横径呈极显著或显著正相关，花蕾纵横径比与其他性状没有相关性，其中安纳西品种的单核靠边期小孢子占比还与花药纵径呈显著正相关，其相关系数为0.657，花药纵横经比与花蕾横径、花药横径呈极显著或显著正相关外，花药纵横经比与其他性状没有相关性。

2.4 番茄花蕾纵径、横径与小孢子单核靠边期的关系

由表5可知，安纳西和SV4224TH这2个番茄品种，不同花蕾纵径和花蕾横径区间的番茄单核靠边期小孢子占比存在显著性差异。安纳西番茄花蕾纵径在7.00~7.99 mm和8.00~8.99 mm 2个长度区间时与其它长度区间差异显著，其单核靠边期小孢子占比最大为98.50%和85.80%。SV4224TH花蕾纵径在7.00~7.99 mm时与其他长度区间差异显著，单核靠边期小孢子占比最大为94.50%，花蕾纵径在6.00~6.99 mm和8.00~8.99 mm 2个长度区间时单核靠边期比列差异不显著，其占比为69.25%和75.68%。2个番茄品种的花蕾横径在2.00~2.99 mm时，单核靠边期小孢子占比分别为68.15%和61.55%，而2个番茄品种的花蕾纵径在7.00~7.99 mm时，单核靠边期小孢子占比最大，都在94%以上，所以可以将花蕾纵径作为番茄花药培养研究中的采样指标之一。

3 讨论

随着现代生物育种技术的快速发展，目前主要通过花药和小孢子培养的方式来获得单倍体植株^［23］，各国学者已经在十字花科、茄科和禾本科等植物中相继获得了花药培养诱导的愈伤组织及胚状体^［24-26］，并且在小麦^［27］和水稻^［28］等其他作物上建立了适合该物种的完整花药培养体系，也产生了一定的经济价值^［29］。近些年来，番茄花药培养和小孢子培养技术取得了较大的进展，但在实际应用中番茄小孢子培养也依然是植物小孢子培养中的难点^［30-33］。因为番茄单倍体诱导的效率不高，其诱导率只有百分之几^［34］，所以选择适宜的小孢子发育时期是成功诱导胚状体和获得单倍体植株的关键因子^［35-36］。研究表明，单核靠边期是进行番茄小孢子培养的最佳时期^［30］，这与甜瓜^［20］、草莓^［37］和青花菜^［38］等作物培养最佳时期一致，所以确定小孢子发育时期相对应的花器外部形态指标至关重要。

本研究重点在番茄花药培养与小孢子培养的前期基础工作，采用改良苯酚品红染色法在光学显微镜下对小孢子不同发育时期的细胞学特征进行观察，发现当花蕾纵径大于4.00 mm时，小孢子发育经历单核早中期、单核靠边期、双核期和成熟花粉粒时期，每个时期可以根据细胞核的数量、位置及其他明显特征进行区分，小孢子所经历的发育时期与单淑玲等^［10］和罗佳等^［19］观察到的时期一致。同时通过观察与比较番茄小孢子发育时期的花器外观形态，发现不同番茄品种的小孢子处于单核靠边期时都表现为花萼略微裂开呈绿色，花冠呈浅绿色，花药为浅黄色，花蕾纵径最大区间为5.44~9.19 mm，这与辛建华等^［9］和罗佳等^［19］研究结果不一致，笔者认为这是由于品种以及栽培环境不同所导致。

在花蕾纵径选择的最大区间5.44~9.19 mm内，其选择上限与下限之间有3.75 mm的跨度，这与辛建华等^［9］和罗佳等^［19］的研究结果花蕾纵径选择范围跨度为3.4 mm基本一致。由于跨度大不能全部确保选择范围内单核靠边期小孢子占比最高，这是因为番茄小孢子发育的不同步性造成的^［20］，所以有必要引入单核靠边期小孢子占比这一指标。除了单淑玲等^［10］研究了番茄单核靠边期小孢子占比与花蕾纵径的相关性，至今在其他植物小孢子发育与花器形态相关性分析中未见引入这一指标的相关报道。本研究通过分析小孢子各发育时期的单核靠边期小孢子占比与花器形态指标的相关性，发现单核靠边期小孢子占比与花蕾纵径、横径呈极显著相关性，而与花蕾的纵横经比，花药的纵径、横径、纵横径比无极显著相关性。本文进一步以1.00 mm为间隔，对花蕾纵径和横径划分区间，发现花蕾纵径在6.00~6.99 mm，单核靠边期小孢子占比在60%左右，这与单淑玲等^［10］发现花蕾纵径在5.00~6.99 mm时，单核靠边期小孢子占比也在60%左右的研究结果较一致。花蕾纵径在7.00~8.99 mm，单核靠边期小孢子占比在75%以上，花蕾横径在2.00~2.99 mm时，单核靠边期小孢子占比最高为65%左右，而花蕾横径差异小，不具有实操性，花蕾纵径是一个容易测量和判断的花器形态指标，故可以直接将花蕾纵径作为番茄花药培养研究中的采样指标，这与单淑玲等^［10］和高慧等^［11］选择采样指标一致，其最佳选择花蕾纵径在7.00~7.99 mm时，94%以上的小孢子处于单核靠边期。

因此，依据本研究结果，根据番茄花蕾的纵径，同时参考花蕾花药的颜色来判断小孢子发育时期，以此实现在田间直接取材，省时省力，为番茄小孢子的培养提供了简单易行的选择方法，从而为构建高效的番茄花药与番茄游离小孢子培养体系奠定基础。

4 结论

综上所述，安纳西和SV4224TH番茄品种的小孢子处于单核靠边期时，单核靠边期小孢子占比仅与花蕾纵径、横径呈极显著正相关。番茄小孢子培养的最佳选蕾标准为：花蕾纵径7.00~7.99 mm，花萼略微裂开呈绿色，花冠呈浅绿色且花药呈浅黄色。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2020AAC03094)

宁夏回族自治区农业特色优势产业育种专项(NXNYYZ20200103)

宁夏大学大学生创新创业训练计划项目(2019107490502)

宁夏大学园艺国家一流专业建设项目(2020)