青海茄参种子的萌发特性

Seed germination characteristics of Mandragora chinghaiensis

摘要

目的 本试验旨在探索青海茄参种子的萌发特性。 方法 以青海茄参（ Mandragora chinghaiensis ）的种子为试验材料，选择常规播种，低温处理（4 ℃），组织培养3种方式进行萌发试验。 结果 青海茄参种子经 TTC法染色检测，活力为65%；常规播种与低温处理无法使青海茄参种子萌发，只有组织培养的方式获得了种苗；对种子的预处理最适宜的方式为300 mg/L的GA₃浸泡16 h；最佳的消毒方式为20% NaClO消毒15 min；最适宜萌发的基本培养基为1/2MS；最有利于青海茄参种子萌发的激素组合为1/2 MS + 6-BA 2 mg/L + NAA 0.1 mg/L^{+ GA₃ 0.3 mg/L。 结论 探索青海茄参种子的萌发体系，可以缓解青海茄参人工繁殖困难种苗极难获得的瓶颈问题，为进一步研究其药学价值及生物学特性提供新的支持。}

Abstract

Objective To study the seed germination characteristics of Mandragora chinghaiensis. Method The seeds of Mandragora chinghaiensis were used as the test material， and three methods of germination were selected： conventional sowing，low temperature treatment （4 ℃） and tissue culture. Result The viability of M.chinghaiensis seeds was 65% by TTC method staining.Conventional sowing and low temperature treatment failed to germinate the seeds of M.chinghaiensis， but only the seedlings were obtained by tissue culture.The most suitable pre-treatment for seeds was 300 mg/L of GA₃ soaked for 16 h.The best disinfection method was 20% NaClO disinfection 15 min.The most suitable base medium for germination is 1/2MS.The most favorable hormone combination for seed germination of M.chinghaiensis was 1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ GA3 0.3 mg/L. Conclusion By exploring the germination system of M.chinghaiensis seeds，this study can alleviate the bottleneck problem that M.chinghaiensis seedlings are extremely difficult to obtain for artificial propagation，and provide new support for further research on its pharmacological value and biological properties.

Graphical abstract

关键词

青海茄参 / 种子萌发 / 低温处理 / 组织培养 / 激素组合

Key words

Mandragora chinghaiensis / seed germination / low temperature treatment / tissue culture / hormone combination

Author summay

段红俊，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

青海茄参（Mandragora chinghaiensis）为茄科（Solanaceae）茄参属（Mandragora）多年生双子叶的草本植物，主要分布在青海海拔4 200 m左右的岩石滩和草地中，有一定的耐寒性，同时研究发现其全草皆可入药，有治肺脓肿，镇痛消痈等药用价值。但由于野生青海茄参对生长环境的要求相对苛刻，再加上近些年受到人类活动的影响，其野生存活率很低，资源匮乏。采用生物技术探索青海茄参的繁殖就具有重要意义。

在茄科植物中，种子具有一定的休眠特性^［1］，将休眠期的种子进行升温催芽往往不能得到好效果^［2］，而将种子引发作为种子发芽的前处理技术可以得到很好的效果^［3-5］，最常见的GA₃（赤霉素）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）等植物生长调节剂预处理对于打破一些种子的休眠和萌发有促进作用^［6-7］。当然，种子活力的测定可以判断种子是否有活性，从而更好地为种子萌发提供支持^［8］。组织培养是当下最常见、最易成功的植物繁殖技术^［9］，通过利用植物细胞再生能力培育出新的完整植株，特别是对自身繁殖慢难繁殖的植物选用此技术，可有效缓解该问题。茄科植物的组织培养已经发展了很长时间，但对青海野生茄科的研究相对较少，仅对常见的茄科植物进行了系统研究。

本试验以青海茄参的种子为试验材料，测定其种子活力，并尝试用不同激素打破种子休眠的处理方式，以提高其的萌发率。再通过常规播种、低温处理、组织培养3种方式进行种子的萌发试验，得出青海茄参种子萌发的最佳方式。本研究结果可以为后续人工繁殖获得大量青海茄参种苗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取2021年8月青海省果洛藏族自治州达日县野外植株生长健壮、且无病虫害的野生青海茄参^［10］种子为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 种子活力测定

将保存在-20 ℃中的野生青海茄参种子（前一年8月成熟期采集）置于4 ℃处理3 d后，用水浸泡，剥去种皮，再用0.1%的TTC溶液染色，放置在恒温培养箱35 ℃下，染色6~8 h，观察染色情况，计算出种子活力^［11-12］。

1.2.2 种子的预处理

试验采用GA₃（100、300、500 mg/L）、6-BA（2、4、6 mg/L）2种不同浓度的激素浸泡，以水浸泡做为对照（CK），浸泡16 h，3次重复，每处理100粒种子，16 h后晾干备用^［13］。

1.2.3 常规播种

将经过预处理的种子均匀播在混合基质［草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1（V∶V∶V）］中，未进行预处理的种子做为对照（CK），3次重复，注意浇水并覆膜，培养条件：光周期16/8 h，温度25 ℃，相对湿度60%，观察种子的发芽情况。

1.2.4 低温处理

参照课题组前期种子萌发经验进行^［11-13］。以未进行预处理的青海茄参种子为对照，每个处理种子各取15粒，分别排列在垫有纱布的培养皿中，放置在温度4 ℃、相对湿度70%的环境中^［14-15］，模拟野生青海茄参的发芽环境，每隔1 d补1次蒸馏水，确保种子萌发所需的湿度，观察种子的发芽情况。

1.2.5 种子消毒

由于青海茄参的组培相关研究未见报道，因此对青海茄参种子的消毒借鉴张微、张玉英^［16-17］等对番茄种子的消毒方法，先将浸泡的种子用75%的乙醇（C₂H₆O）消毒30 s，无菌水清洗2次，再分别转入20% NaClO（5、10、15 min）和0.1% HgCl₂（3、5、8 min）2种消毒剂中消毒（以上处理分别为T₁~T₆），取出后用无菌水清洗3次，然后将种子放置在无菌滤纸上，待其吸干种子水分后备用。接种于课题组前期筛选6-BA 15 mg/L+NAA 4 mg/L+IAA 1.5 mg/L的激素组合的培养基上进行消毒方式的筛选，每瓶6粒种子，3个重复，培养条件均为：光照强度5 000 lx，光周期16/8 h，昼温25 ℃，夜温20 ℃。接种7 d后，统计种子污染率，接种30 d后，统计发芽率。

1.2.6 基本培养基与种子预处理激素浓度的筛选

目前茄科植物常用的基本培养基种类有MS、1/2 MS、WPM等^［17-18］，因此青海茄参种子萌发选用MS与1/2 MS 2种基本培养基，接种于6-BA 15 mg/L+NAA 4 mg/L+IAA 1.5 mg/L培养基上，其中T₁~T₆分别为MS+GA₃（100、300、500 mg/L）、6-BA（2、4、6 mg/L），T₇~T₁₃分别为1/2 MS+GA₃（100、300、500 mg/L）、6-BA（2、4、6 mg/L），未进行预处理的种子做为CK，每瓶6粒种子，6个重复，培养条件均为：光照强度5 000 lx，光周期16/8 h，昼温25 ℃，夜温20 ℃。生长30 d，统计种子萌发数，计算种子萌发率。

1.2.7 筛选种子萌发的最佳培养基

取预处理后的种子清洗干净，并用水浸泡12 h以上，用未做任何处理的种子做对照（CK），用75％的酒精消毒30 s后，无菌水冲洗2次，再用20%的NaClO溶液消毒15 min，取出用无菌水清洗3~4次，然后将种子放置在无菌滤纸上，待其吸干种子水分后，选用20个不同浓度的激素配比（如表1所示），均匀播种在不同激素组合的1/2 MS培养基上，每瓶6粒种子，6个重复，培养条件同上，35 d后观察种子的萌发情况，并统计发芽率。

1.3 统计分析

采用Excel 2010、Spass等软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 种子活力测定

通过TTC染色法^［11］，在恒温培养箱（35 ℃）染色7 h，观察有100粒染色明显，30粒染色较明显，70粒未染色，计算出青海茄参种子的活性为65%。

2.2 常规播种的萌发

综合统计所有处理，在播种30 d内观察，种子没有任何萌发迹象，45 d观察没有发芽；60 d后观察种子仍无发芽。通过常规播种青海茄参种子，无法让其正常萌发（未能萌发可能与青海野生茄参所需的海拔、气候等条件相关）。

2.3 低温处理

在保证青海茄参种子萌发所需的温度、湿度条件下，30 d内观察各处理的种子没有任何变化；45 d后观察，部分种子颜色变黑，CK变黑较多，但各处理都没有发芽；60 d后观察，各处理都有种子颜色变黑且有膨胀，种子仍没有发芽；120 d后观察，种子颜色黑化严重且无发芽。通过低温处理，模拟青海茄参的低温处理打破种子休眠，无法满足青海茄参的萌发条件。

2.4 组织培养方式

2.4.1 不同消毒方式对青海茄参种子萌发的影响

在接种25 d（图3），20% NaClO较0.1% HgCl₂消毒效果更好，且对种子伤害较小，利于种子发芽，差异显著（P<0.05）；其中 T₁处理的污染率为100%，发芽率为0.00%；T₃处理的污染率为0.00%，发芽率最高为66.67%，由此可得NaClO较HgCl₂更适宜青海茄参种子的萌发，其最佳的消毒方式为20%的NaClO消毒15 min。

2.4.2 青海茄参种子萌发的基本培养基与预处理激素浓度种子

30 d观察（图4），种子污染率差异不明显（P>0.05）。在培养环境、预处理浓度、激素配比等条件不变时，接种在1/2 MS培养基上的种子发芽率最高为80.55%，最低为CK发芽率11.11%；而接种在MS培养基上的种子发芽率最高为52.78%，最低为CK未发芽。对比发现，接种在1/2 MS培养基的种子发芽率普遍高于MS培养基，差异显著（P<0.05），所以1/2 MS培养基更适宜做青海茄参种子萌发的基本培养基。

处理30 d（图4），用GA₃浸泡处理的种子较6-BA发芽率显著增强。在MS培养基中，GA₃浓度为300 mg/L时发芽率最高为52.78%，6-BA浓度为4 mg/L时发芽率最高为38.89%；在1/2 MS培养基中，GA₃浓度为300 mg/L时发芽率最高为80.55%，6-BA浓度为4 mg/L时发芽率最高为61.11%；CK的发芽率为11.11%，且差异不显著（P>0.05）。由此可得对青海茄参种子最适宜的预处理为浓度300 mg/L的GA₃中浸泡16 h。

2.4.3 不同激素配比对种子萌发的影响

将青海茄参种子接种到20个不同的激素配比的培养基中，15 d时，T₁₇、T₁₈最先开始发芽，各有2粒种子发芽。30 d时，大部分处理都有发芽现象。35 d时（图5）：T₁₆、T₁₇、T₁₈同CK比较发芽率显著增强（P<0.05），且T₁₇的发芽率最高；T₂、T₉、T₁₀、T₁₉、T₂₀同CK比较发芽率有所提高，但差异不显著；其余处理同CK相比发芽率没有明显变化，差异不显著。由此可以得到课题组前期筛选的T₁激素配比不适宜青海茄参种子的萌发，6-BA浓度为2~3 mg/L时最利于种子的萌发。对比T₁₇与T₁₈、T₁₉与T₂₀发现，添加0.1 mg/L的NAA时，种子的发芽率更高。对比T₁₂与T₁₅的发芽率，表明GA₃比IAA更利于提高青海茄参种子的发芽率。综合以上不同激素组合的发芽率，可以得T₁₇最适宜青海茄参种子萌发，因此种子萌发的最佳培养基为1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA₃ 0.3 mg/L。

3 讨论

青海茄参作为茄科茄参属的一种高原植物，具有在高海拔地区生长的特殊性，对其研究鲜有报道，因此对青海茄参的种子萌发特性研究参考了其它茄科植物。本次试验先对青海茄参种子进行活力测定，来确证野生种子是否具有活性，之后进行种子萌发试验，结果表明青海茄参的种子活力为65%；课题组采用常规播种、低温处理^［14-15］、组织培养3种方式对青海茄参种子进行萌发试验。常规播种是最常见的种子萌发方式，但对生长环境要求苛刻的青海茄参来说，采用常规播种的方式进行种子萌发比较困难；采用低温处理的方式进行萌发试验也未获得成功；而采用组织培养的方式进行种子萌发得以成功。

本次试验选用不同浓度的激素对青海茄参种子进行预处理，结果发现不同浓度的激素对种子的萌发影响较大^［4-5］。GA₃是最为广泛的一种能促进种子发芽的生长调节剂^［20-22］，在试验中6-BA也被用来刺激种子发芽，例如周其宇^［23］在茄子的种子萌发试验中将GA³、6-BA 2种激素刺激茄子种子的萌发，结果表明GA₃浓度为300 mg/L时，茄子发芽率最高；闫艳华^［6］选用250 mg/L与300 mg/L 2种不同浓度的GA₃刺激曼陀罗种子，结果表明250 mg/L的GA₃发芽效果最好；王维泽^［24］也采用GA₃刺激番茄种子，结果表明GA₃可显著提高番茄种子发芽。由此可见茄科植物种子引发剂常采用GA₃、6-BA两种激素，本试验采用这两种激素进行种子预处理，与番茄等茄科植物类似，GA₃处理较6-BA发芽率显著提高，且最适合青海茄参种子萌发的激素为300 mg/L的GA₃。

青海茄参因生长环境恶劣，种子萌发条件的苛刻，加之人类的活动与放牧，使其存活能力显著下降。当今随着组织培养技术的成熟与产业中的应用，可为濒危野生物种的人工再生与扩繁提供技术支持。本试验通过种子的消毒方式、基本培养基、最佳激素组合的筛选，可为构建青海茄参种子萌发与组培体系研究奠定基础。

茄科植物种子消毒方式的研究报道较多，茄科植物的种子消毒NaClO比HgCl₂的发芽率高。李莉莉^［25］选用7%的NaClO 对番茄种子进行不同时间消毒时间处理，表明消毒10 min时发芽率最高；王理^［26］选用75%的酒精+0.1% HgCl₂ （2 min）对番茄种子进行消毒，污染率很低，但发芽率也较小；用75%的酒精+3% NaClO （2 min）有较好的效果，污染率低，但发芽率较高。吴志刚^［18］选用10% NaClO与0.1%的HgCl₂ 2种消毒剂，结果表明10% NaClO消毒的发芽率较0.1% HgCl₂高。本试验中对青海茄参种子消毒参考了茄科植物种子的消毒方式^［27-29］，结果发现20% NaClO比0.1% HgCl₂更适宜青海茄参种子的萌发，消毒时间为15 min。

由于组织培养技术的成熟，对基本培养基的选择也趋于多样化，茄科植物组织培养选用较多的基本培养基为MS与1/2 MS 2种^［30-31］。吴志刚^［18］进行番茄种子的组培萌发试验，结果表明1/2 MS培养基可以使种子快速发芽，种苗生长健壮，整齐。谢礼洋^［19］在获取辣椒无菌苗时选用MS做为基本培养基，种子易发芽，种苗生长健壮。青海茄参种子萌发试验结果表明，1/2 MS更加适合青海茄参种子的萌发。

目前，对青海茄参组织培养的研究未见报道，本次试验参考其它茄科植物，设置不同的激素浓度梯度对青海茄参种子萌发进行筛选。接种后15 d，种子没有出现任何变化，20 d后出现发芽，35 d后统计发芽结果，通过分析得出，可以得出青海茄参种子萌发的最佳培养基为1/2MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA₃ 0.3 mg/L。赖小芳^［32］进行番茄种子萌发选用糖15 g/L+琼脂粉5 g/L作为最佳培养基诱导种子萌发；谢礼洋^［19］在获取辣椒无菌苗时选用MS+蔗糖30 g/L^{+琼脂6 g/L+AgNO₃ 4 mg/L做为最佳培养基；刘思言［33］将MS培养基做为诱导番茄种子萌发的最佳培养基。本试验的结果与其它茄科植物略有不同，这可能与野生茄参种子的特殊性有关，需要加入激素才可刺激种子萌发。}

4 结论

本研究结果初步获得野生青海茄参种子萌发的组培体系，可以缓解其人工繁殖困难种苗极难获得的瓶颈问题，为后续人工繁殖获得大量青海茄参种苗提供技术与理论参考。

参考文献

[1] 杜贵国.冬季茄子育苗难的原因及对策［J］.蔬菜，1993（6）：26-27.

[2] 赵桂云.简述种子发芽的条件［J］.种子世界，2001（10）：32.

[3] 佐月，许永华.种子萌发过程中GA与ABA的作用机制研究进展［J］.分子植物育种，2021，19（18）：6221-6226.

[4] 唐萍.影响茄子种子发勃的主要因素及解决办法［J］.吉林蔬菜，2004（2）：31.

[5] 张卫华，郝丽珍，胡宇宝.种子引发及其效应［J］.种子，2004，23（9）：59-64.

[6] 闫艳华.不同浸种处理对曼陀罗种子萌发和幼苗生长的影响［J］.江苏农业科学，2022，50（1）：133-138.

[7] 黎家，李传友.新中国成立70年来植物激素研究进展［J］.中国科学：生命科学，2019，49（10）：1227-1281.

[8] 向春阳，于连波，田秀平 等.番茄种子活力测定的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，1996（1）：38-41.

[9] 邓演文，林洁莹，吴乔娜 等.木兰属植物组织培养技术研究综述［J］.林业与环境科学.2018，34 （5） ： 118-124.

[10] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1978.

[11] 胡迎峰，穆帅，张家祥，等.快速测定多花黄精种子活力的TTC染色法条件研究［J］.安徽农学通 报，2021，27（10）：31-32.

[12] 虞华丽，张晶.测定加工番茄种子活力方法探讨［J］.石河子科技，2007（4）：3-5.

[13] 白占兵，李雪峰，倪向江，等.种子引发剂对辣椒种子发芽的影响［J］.湖南农业科学，2009（1）：6-7.

[14] 韩雪平，薛晓敏，王金政.赤霉素和低温层积处理对金太阳杏种子萌发的影响［J］.安徽农业科 学，2017，45（8）：24-25.

[15] 俞群，巫智斌，刘少彦.低温层积对紫叶李种子发芽的影响［J］.林业科技通讯，2020（9）：60-62.

[16] 张微，侯雷平，赵慧，等.影响番茄子叶再生的因素［J］.分子植物育种，2010，8（5）：913-919.

[17] 张玉英，韦正乙，王云鹏，等.番茄叶片高频再生体系的建立［J］.吉林农业科学，2014，39（2）：78-82.

[18] 吴志刚，宋明，王志敏，等.番茄组织培养中无菌苗培养条件的优化［J］.中国农学通报，2006（4）：335-337.

[19] 谢礼洋，匡华琴，赖钟雄，等.辣椒愈伤组织诱导的研究［J］.黑龙江农业科学，2013（11）：17-20.

[20] Groot S P C， Karssen C M.Gibbrellins regulate seed cermination in tomato by endosperm weakening：A study with gibberellin-deficient mutants［J］.Planta，1987，171（4）：525-531.

[21] 赵程，郭晔红，赵阳武，等.氟啶酮赤霉素协同诱导对肉苁蓉种子发芽率的影响［J］.甘肃农业大学学 报，2018，53（4）：54-58.

[22] 马雨婷，蒋志荣，方向文，等.白毛锦鸡儿种子萌发对温度及外源激素的响应［J］.甘肃农业大学学报，2018，53（1）：124-129.

[23] 周其宇.不同引发剂对番茄、茄子种子萌发的影响［J］.山西农业科学，2021，49（8）：947-951.

[24] 王维泽.引发剂组合对番茄种子发芽质量的影响［D］.南京：南京农业大学，2017.

[25] 李利利.番茄高效再生体系的优化［D］.太谷：山西农业大学，2019.

[26] 王理.番茄高效离体再生体系的建立及遗传转化初探［D］.成都：四川农业大学，2012.

[27] 赵歌，王谨，储荣华，等.番茄子叶不定芽分化的初探［J］.北方园艺，2010（4）：150-153.

[28] 王月，郭凤，林英.Micro-Tom番茄离体再生条件的选择［J］.北方园艺，2010（18）：139-141.

[29] 张洪岩，陈秀玲，李景富，等.番茄材料“0946”和“0949”再生体系的研究［J］.北方园艺，2012（12）：125-127.

[30] 李扬，凌永胜，林金秀.不同有机添加物对马铃薯组培苗生长的影响［J］.福建热作科技，2020，45（2）：5-7.

[31] 高玉蓉，刘振国，和江明，等.组培固定番茄杂种优势优化体系的建立［J］.安徽农业科学，2017，45（30）：46-48.

[32] 赖小芳，陈伟强，王健康，等.番茄‘7728’组织培养及植株再生研究［J］.上海农业学报，2017，33（4）：35-39.

[33] 刘思言，王丕武，关淑艳，等.番茄种子消毒方法及愈伤组织诱导的初步研究［J］.河南农业科学，2012，41（3）：113-115.

基金资助

国家自然科学基金项目(31860575)

青海省科学技术厅自然科学基金项目(2017-ZJ-923Q)

青海省林业厅林木种苗总站国家长期科研基地监测项目(2130211)