一株除草活性菌株HY-041的除草潜力及其生物学特性研究

The herbicidal potential and biological characteristics of a herbicidally active strain HY-041

摘要

目的 探讨HY-041菌株的除草潜力及生物学特性，为其用于工业化生产提供理论依据。 方法 通过离体接种法，测定了菌株HY-041对野燕麦（Avena fatua L.）、藜（Chenopodium album L.）、密花香薷（Elsholtzia densa Benth.）、猪秧秧（Galium aparine L.）、冬葵（Malva verticillata L.var.crispa）、酸模叶蓼（ Polygonum lapathifolium L.）和反枝苋（Amaranthus retroflexus L.）7种杂草叶片的致病力。采用生长速率法和孢子计数法，考察不同培养基、光照、温度、碳源、氮源、pH及致死温度等因子对菌丝生长和产孢量的影响。 结果 HY-041菌株接种离体叶片7 d致病性表现为：酸模叶蓼>冬葵>野燕麦>藜>猪秧秧>反枝苋>密花香薷。HY-041菌株在PSA培养基中生长发育最快，且菌丝稠密，菌株最适生长温度为20 ℃，最适产孢温度为25 ℃，在持续黑暗环境下，更有利于菌丝生长和孢子的产生，最适碳源为肌醇，最适氮源为硝酸钾和硝酸钠，菌株适宜生长pH值为9，最适产孢pH为8，致死温度为55 ℃下水溶10 min。 结论 本试验明确了HY-041菌株在离体条件下对7种杂草的致病性及该菌的生物学特性，通过优化提高了菌株的产孢量，为生防制剂的研究奠定理论基础。

Abstract

Objective To study the herbicidal potential and biological characteristics of HY-041 strain and provide theoretical basis for its industrial production. Method The pathogenicity of strain HY-041 to seven weeds （Avena fatua L.，Chenopodium album L.，Elsholtzia densa Benth.，Galium aparine L.，Malva verticillate L.var.crispa，Polygonum lapathifolium L.and Amaranthus retroflexus L.） was determined by in vitro inoculation.The effects of different media，light，temperature，carbon source，nitrogen source，pH and lethal temperature on mycelial growth and spore production were studied by growth rate method and spore counting method. Result The pathogenicity of strain HY-041 inoculated on isolated leaves for 7 days was as follows：P.lapathifolium >M.verticillata> A.fatua >C.album >G.aparine > A.retroflexus > E.densa.The HY-041 strain grew fastest and had dense mycelia in PSA medium，the optimum growth temperature of the strain is 20 ℃，the optimum sporulation temperature is 25℃，in a continuous dark environment，more conducive to mycelial growth and spore production，the optimum carbon source is inositol，the optimum nitrogen source is potassium nitrate and sodium nitrate，the suitable growth pH of the strain is 9，the optimum sporulation pH is 8，the mycelial lethal temperature is 55 ℃/10 min. Conclusion The pathogenicity of HY-041 strain on 7 species of weeds in vitro and the biological characteristics of the strain were clarified，and the spore production of strain HY-041 was increased by optimization，which provided a theoretical basis for the study of biocontrol agents.

Graphical abstract

关键词

除草潜力 / 生物学特性 / 产孢量 / 生防制剂

Key words

herbicidal potential / biological properties / spore production / biocontrol preparations

Author summay

李欢，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

杂草是造成农业减产的主要有害生物之一，它具有野生植物和栽培作物的特性，同时对自然环境有较强的适应性和抗逆性^［1］，与粮食作物争夺植物所需的营养物质、水和阳光，占用粮食作物生长的空间，导致粮食作物发育不良，粮食产量和质量下降。杂草数量在所有植物中所占的比例高达十分之一，其中，每年大约有1 800种杂草对主要农作物产量带来了不同程度的损害，在主要农作物田中生长着约200多种杂草，而难治的恶性杂草多达130余种，导致主要粮食作物减产10%，最严重时可减产50%以上甚至颗粒无收^［2］。全国年均杂草危害面积已达到930万hm²，全国每年用于草害综合治理的费用已达到250多亿元，在如此高的投入下，杂草每年导致的全国粮食作物损失仍然高达5 000万t，直接损失将近1 000亿元^［3］。如今，化学除草剂仍然是农田杂草的主要防治手段，但由于其存在高成本、污染环境、导致土壤退化、杂草抗药性及对后茬作物造成药害等问题，随着除草剂在世界范围内的用量持续增加，由此带来的负面影响也日趋严重^［4-5］，使得人们越来越重视生物除草技术的发展与应用。生物除草具有对目标杂草专一性强、绿色环保等优势，更符合现代农业可持续发展的要求，因此，研究与发展利用生物除草替代部分化学除草技术成为当务之急。

一般来说，利用发酵技术生产除草剂首先要在实验室进行小规模试验，确定有利于产孢的培养基配方及培养条件，生产丰富的孢子，使得产孢量能够达到工厂化生产的标准，然后放大生产体系，为批量发酵及工厂化生产提供技术基础。研究微生物发酵所需的培养基和发酵条件，是提高孢子产量的方法和途径^［6-13］。微生物发酵受多种发酵条件的影响，如碳源的种类、发酵温度、基质含水量、培养时间、发酵转速、接种量、初始pH等，这些因素会直接影响菌体的生长和产物合成^［7，12］，研究培养基配方和微生物发酵条件是提高孢子产量的重要途径^［13］，蔺泽荣等^［14］研究发现，优化后的培养基配方增加了菌株HZ-011的产孢量，可广泛应用于农田杂草的防治。朱海霞等^［15］通过对具有除草活性的生防菌株HZ-31进行发酵条件优化，促进了菌株HZ-31的产孢量。蒋冬花等^［16］对菌核曲霉（Aspergillus sclerotiorum）As-68菌株进行发酵条件优化，优化后其对抑制水稻白叶枯病菌影响效果更加明显。杨莹等^［17］采用单因素试验和响应面法对出芽短梗霉菌PA-2的液体培养基进行了优化，在最适宜发酵条件下提高了孢子产量，使杂草藜的鲜质量防效达到了75.0%。尹艳楠等^［18］对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus） NJSZ-13菌株进行优化，活菌数量达到优化前的4.1倍。孢子产量能否达到规模化生产标准，直接影响剂型加工和商品化^［19］。现阶段对燕麦镰孢菌的研究主要集中在植物病害防治阶段，而用于生物除草仅有少量报道，研究燕麦镰孢菌HY-041的除草潜力和发酵生产工艺，进一步明确各成分与菌种发酵生产之间的相互联系，将为该菌种的大规模生产与剂型研发奠定理论依据。

本研究以前期从自然患病刺儿菜叶片上分离筛选得到一株燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）HY-041，在离体条件下测定其对野燕麦、藜、密花香薷、猪秧秧、冬葵、酸模叶蓼和反枝苋7种杂草叶片的致病性，通过离体接种7种杂草叶片后明确菌株的除草潜力。通过单因素试验对菌株的多种生物学特性加以深入研究，探明燕麦镰孢菌生长发育必需的各类养分和最适宜培养要求，可得到产孢量高、致病力强的优质菌株，为菌种剂型加工和保持生物活性研究提供条件基础^［10］。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

HY-041从自然感病的刺儿菜杂草叶片中分离得到，经鉴定确定为燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum），存放于青海省农林科学院植物保护有害生物综合防治实验室。

1.2 供试培养基

参考李健等^［20］、顾琼楠等^［21］、姚锦爱等^［22］和王燕等^［23］对菌株生物学特性的研究方法，本试验选择了马铃薯葡萄糖（PDA）培养基、马铃薯蔗糖（PSA）培养基、孟加拉红（Rose Bengal）培养基、查氏（Czapek）培养基、酵母浸膏（YEA）培养基、、葡萄糖蛋白胨（GPA）培养基、理查德（Richard）培养基和水琼脂（WA）培养基8种培养基对菌株HY-041进行培养，筛选出适合菌株生长和产孢的最适培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 HY-041菌株对离体叶片致病性测定

从青海省农林科学院的试验田收集足够数量的新鲜健康的杂草叶片，供试杂草叶子有野燕麦、酸模叶蓼、藜、冬葵、密花香薷、猪秧秧及反枝苋等用无菌水清洗3次后自然晾干，然后将其放置于垫有消毒滤纸的培养皿中（Φ=9 cm），每皿3~4片，用无菌水浸湿滤纸，使培养皿内保持湿润。从培养5 d的菌落边缘打取菌饼（Φ=8 mm）接种到杂草叶片正面处，于25 ℃恒温培养箱培养，每个处理重复3次，未接菌的PDA作为对照，7 d 后观察病斑面积，病斑面积=1/4×长×宽×3.14。调查发病程度，进行如下分级：0级：叶片无任何病斑；1级：叶片上有病斑产生；2级：病斑扩展至1/3~2/3 叶片；3级：2/3以上的叶片坏死；4级：叶片全部枯死变色^［24］。

1.3.2 HY-041菌株最适培养基的筛选

将HY-041菌株接种于 PDA培养基上，放置于（25±1）℃的培养箱暗培养5 d制成供试菌。用无菌打孔器从供试菌落培养皿中取出8 mm的菌饼，接到8种不同培养基上，每处理设置3次重复，恒温培养箱中黑暗培养，6 d后观察菌株生长状况，然后用十字形交叉法测定菌落直径。培养至第12天后，加入5 mL无菌水，用载玻片刮平板，4层纱布过滤后得到孢子悬浮液，并测量不同培养基的产孢量^［25-26］。

1.3.3 HY-041菌株最适生长和产孢温度

从活化5 d的供试菌落边缘打取直径8 mm的菌饼，倒置接种于PDA平板中央，分别放置于5、10、15、20、25、30 ℃处理的恒温培养箱暗培养6 d。菌落直径及产孢量的测量方法同1.3.2。

1.3.4 HY-041菌株最适生长和产孢的pH

以PDA 培养基作为基础培养基，用1.0 mol/L HCl和1.0 mol/L NaOH 溶液将培养基的pH值依次调节为 4、5、6、7、8、9、10、11、12 共9个梯度，在活化5 d 的供试菌落边缘打取直径8 mm的菌饼，倒置接种于不同pH处理的培养基中央，于 25 ℃恒温培养箱中全黑培养6 d，菌落直径及产孢量的测量方法同1.3.2。

1.3.5 HY-041菌株最适生长和产孢的碳源

以无糖PDA培养基为对照，分别用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、肌醇和D-甘露醇代替PDA培养基中的碳源。取直径为8 mm的菌饼，接至不同碳源处理的培养基中央，用25 ℃恒温培养箱全黑培养，6 d后观察菌丝生长情况，并测定菌落直径及产孢量，方法同1.3.2。

1.3.6 HY-041菌株最适生长和产孢的氮源

在PDA培养基的基础上依次加入5 g相同质量氮元素的蛋白胨、酵母膏、硝酸钾、硫酸二胺、硝酸钠、尿素和牛肉浸膏等作为培养基中唯一氮源，以PDA培养基作为对照，将已培养好的菌株用8 mm打孔器打取菌饼，放入7种氮源培养基中，于 25 ℃黑暗条件下培养6 d，并测定菌落直径及产孢量，测量方法同1.3.2。

1.3.7 HY-041菌株最适生长和产孢的光照条件

取直径为8 mm的菌饼接至PDA 培养皿中心位置，在25 ℃恒温培养箱中设4组光照处理，光照条件分别为24 h黑暗、12 h光暗交替、16 h光照和24 h光照，持续培养6 d，然后测定菌落直径及产孢量，测量方法同1.3.2。

1.3.8 HY-041菌株菌丝的致死温度

取9支体积为20 mL的无菌试管，每管加入10 mL无菌水，取3块直径为6 mm的菌饼接至已灭过菌的试管中，将8支试管分别放入35、40、45、50、55、60、65 、70 ℃的水浴锅中恒温水浴处理 10 min，冷却至室温后，将处理过的菌饼取出倒置接种于PDA平板中央，以室温下放置的试管作为对照（20±1）℃，于25 ℃培养箱中培养6 d，观察菌落生长情况，每处理3次重复，确定致死温度^［27］。

1.4 数据处理与统计分析

每个试验均设置3个重复。试验数据采用 Excel 2010 计算平均值及标准偏差，并用 DPS 15.10软件的 Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 离体叶片的致病力测定

由图1和表1可知，菌株HY-041菌饼接种野燕麦、藜、密花香薷、冬葵、猪秧秧、酸模叶蓼、反枝苋的离体叶片7 d后，杂草叶片均有不同程度的发病，并随着时间推移逐步地向四周扩散，同时也都伴随着菌丝的生长，围绕着菌丝块周围侵染后都会产生褐色斑点，随着时间的推移慢慢扩大，直至整个叶片发黄枯死。同时，菌丝块也会对叶片有侵染，并遍布整个叶子背面，随着时间推移再延伸至整片叶子，开始发黑腐烂。

与对照组相比，菌丝块HY-041接种离体叶片后，处理组酸模叶蓼、冬葵和野燕麦会产生大量白色菌丝，菌丝侵染叶片后产生大小不一的褐色病斑，后期病斑逐渐扩大，病斑四周呈现黄褐色叶片发黄、腐烂坏死；离体反枝苋叶片相比对照而言，叶片接种部位有穿透且出现病斑，菌丝透过叶片表皮生长至叶片背面，之后扩展至整个叶片；藜、密花香薷、猪秧秧离体叶片接种菌丝块后，叶片出现病斑，病斑上出现白色菌丝，并逐渐向四周扩展。HY-041菌丝块对不同杂草离体致病性强弱依次表现为：酸模叶蓼>冬葵>野燕麦>藜>猪秧秧>反枝苋>密花香薷。

2.2 培养基对菌株HY-041生长和产孢量的影响

HY-041菌株在8种培养基上均能生长，但在不同培养基上菌落形态各异，且菌落直径和产孢量存在差异。从菌落直径来看，PSA、GPA培养基中长势较快，没有显著性差异（P<0.05），培养6 d菌落直径分别为82.67、82.33 mm，但在GPA培养基上菌丝稀疏。其次为Czapek、Richard和PDA培养基，培养6 d菌落直径分别为78.33、77.67、66.67 mm，在Richard培养基上生长至后期，菌丝逐渐退化；孟加拉红和YEA培养基上菌落直径较小，菌落直径仅为52.67、47.67 mm。8种供试培养基产孢量存在显著差异，在PSA培养基上产孢量显著大于其他培养基，产孢量为1.24×10⁷ 个/mL，其次在PDA、Richard、孟加拉红和GPA培养基上产孢较少，在 YEA 和WA培养基上产孢最差（表2）。

2.3 温度对HY-041菌株生长和产孢量的影响

测定HY-041菌株在不同温度处理下的菌落直径和产孢量，结果显示，HY-041最适生长温度为20 ℃，菌落直径为80.67 mm，显著高于其他5个处理（P<0.05），在25 ℃时产孢量与其他处理差异显著，产孢量为1.63×10⁷个/mL；低于5 ℃或高于30 ℃，菌丝生长迟缓甚至停止；在5 ℃下菌落生长最慢，菌落直径最小为24.67 mm（表3）。

2.4 pH对HY-041菌株生长和产孢量的影响

结果表明，菌株HY-041在pH为4~12均能生长，最适菌落生长的pH值为7~9，而适宜产孢pH值范围为8~9。在不同pH条件下菌丝生长速度由大到小依次为pH 9>pH 8>pH 7>pH 10>pH 11>pH 12>pH 6>pH 5>pH 4，说明过酸或者过碱均不利于菌株的生长。pH为9时菌落生长最快，菌落直径为60.00 mm，pH值为8时产孢量最高且显著高于其他pH值条件（P<0.05），可达到1.51×10⁷个/mL。当pH值为4时，HY-041菌落直径仅为35.67 mm，产孢量0.12×10⁷个/mL（表4）。

2.5 不同碳源对HY-041菌株生长和产孢量的影响

HY-041菌株在以肌醇为碳源的培养基上菌落生长速度最快，培养6 d后，菌落直径可达80.33 mm，显著高于碳源培养基（P<0.05）；以麦芽糖、乳糖和D-甘露醇为碳源的培养基上，菌落生长状况较好，菌落直径分别为75.33、76.00、78.00 mm，与对照相比差异不显著；而以葡萄糖和蔗糖为碳源的培养基中菌落直径明显低于对照。菌株在以蔗糖为碳源的培养基上产孢量最佳为1.43×10⁷个/mL，以葡萄糖和肌醇为碳源的培养基产孢量次之；以D-甘露醇为碳源培养基和对照产孢量最小（表5）。

2.6 不同氮源对菌株HY-041生长和产孢量的影响

HY-041菌株生长的最佳氮源为硝酸钾，6 d后菌落直径为69.33 mm，与其他处理差异显著（P<0.05）；以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和大豆粉为氮源的培养基上菌落直径分别为55.67、53.7、54.00、53.67 mm，与对照差异不显著；而以硫酸铵为氮源的培养基对菌株生长抑制，菌落直径为43.00 mm，显著小于对照；菌株在氮源为硝酸钾和硝酸钠的培养基上产孢最多，为1.15×10⁶个/mL和1.03×10⁶个/mL两者之间没有明显差异，但是显著高于其他氮源培养基（P<0.05），以酵母膏，牛肉膏和蛋白胨为氮源的培养基次之，以硫酸铵和大豆粉为氮源的培养基上，菌株的产孢受到轻微抑制（表6）。

2.7 不同光照条件对菌株HY-041生长和产孢量的影响

菌株HY-041在不同光照条件下培养6 d后发现，24 h黑暗、16 h光照和24 h光照3个处理的菌丝生长速度差异不显著（P<0.05），培养6 d后菌落直径分别为72.67、76.67、77.33 mm，12 h光暗交替不利于菌丝生长。24 h持续黑暗处理产孢量最高为1.48×10⁷个/mL，其产孢量显著大于其他3种光照处理（P<0.05），12 h光暗交替和16 h光照条件下产孢量差异不显著，24 h光照不利于产孢（表7）。

2.8 致死温度对菌株HY-041生长和产孢量的影响

在经35~50 ℃水浴处理10 min后，HY-041菌株菌丝生长缓慢，但仍能形成菌落。水浴超过55 ℃后，在PDA平板上不能产生菌落。说明菌株的致死温度是55 ℃。

3 讨论与结论

本研究以从大刺儿菜上分离到的燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）HY-041为对象，研究了7个因素（培养基、光照、温度、碳源、氮源、pH和致死温度）对该菌株HY-041生长的影响。生物学特性试验表明，该菌在8种不同的培养基上均能生长，其中在 PSA培养基上生长最佳，产孢量最大，菌株HY-041适宜生长温度为20 ℃，适宜产孢温度为25 ℃。菌落生长的最适pH值为9，最适产孢pH为8，过酸过碱均不利于菌丝生长。燕麦镰刀菌HY-041可以利用多种碳源，其中以肌醇利用最佳，最适宜氮源为硝酸钾，对其他氮源利用效果稍差，该菌株在不加碳氮源培养基上虽能快速生长，但菌丝稀疏、菌落稀薄且颜色较浅，由此可知碳氮源对菌株的生长具有重要作用，这与魏密等^［28］和王志霞等^［29］的研究结果相同。菌株在4种不同光照周期下均可生长，持续黑暗环境更有利于菌丝生长和产孢。菌株的致死温度为55 ℃水浴处理10 min，这与牛世全等^［30］的研究结果 71 ℃相差较大，推测可能是由于不同地区环境和寄主有所差异，菌丝已经适应该地区的环境，使病原菌特性发生改变，从而导致同一种病原菌生物学特性发生差异。

据研究报道，用于杂草生物防除的植物病原真菌主要集中于镰孢菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）和炭疽菌属（Colletotrichum）等^［31］，镰孢菌属（Fusarium）是一类寄生在植物体内或土壤内的丝状真菌，是常见的土壤习居菌，可引起多种植物病害^［32］。如轮枝镰孢菌（F.verticillioides）会引起甘蔗梢腐病^［33］，尖孢镰孢菌（F.oxysporum）和茄镰孢菌（F.solani）引起的辣椒根腐病和樱桃根颈腐烂病^［34-35］，禾谷镰孢菌（F.graminearum）引起的小麦赤霉病^［36］。除此之外，镰孢菌属也被广泛的应用于生物防治，王之樾等^［37］从自然患病的列当上分离出了一株镰孢菌（Fusarium orobanches）并研制成生防制剂F798用于防治列当，邵华等^［38］从自然感病的麻叶荨麻叶片中分离出了木贼镰孢菌（F.equiseti），该菌株的菌丝体和粗毒素对恶性杂草麻叶荨麻具有极强的防治效果，被证实具有除草潜力。目前国内外对燕麦镰孢菌除草方面的研究成果相对较少，程亮等^［39］研究表明，从自然罹病的野燕麦植株上分离出的燕麦镰孢菌，采用活性追踪法对燕麦镰孢菌正丁醇萃取物进行活性成分分离和活性测定，从而确定燕麦镰孢菌GD-2的除草活性成分。证实GD-2可作为防除野燕麦的潜力生防菌。另外，程亮等^［40］研究菌株GD-2的靶标杂草为野燕麦，而本研究中，燕麦镰孢菌HY-041除了野燕麦之外，对青海省田间常见的阔叶杂草亦有致病效果。除此之外，燕麦镰孢菌HY-041通过接种不同杂草叶片都有不同程度的致病性，可直观看出叶片发病强弱表现为：酸模叶蓼>冬葵>野燕麦>藜>猪秧秧>反枝苋>密花香薷，由于除草潜力评估是在室内离体叶片上进行，后续还将开展活体盆栽试验和大田试验进一步验证该菌株的除草活性。

本研究对燕麦镰孢菌HY-041的生物学特性进行分析，并用7种杂草叶片对其进行除草潜力评估，然而，从具有除草潜力的菌株发展成为生物除草剂还有不少工作要做，既要确保菌株的田间除草的有效性，还要保证田间作物的安全性^［41］。下一步将对该菌株的剂型、田间药效、作物安全性、除草机理活体盆栽等进行系统的研究，为该菌今后剂型的研发和产业化生产提供技术参考。

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基金资助

青海省科技厅国际合作专项(2023-HZ-808)