甘加藏羊发情周期输卵管和子宫中THRs的表达及分布

Expression and distribution of THRs in oviduct and uterus of Ganjia Tibetan sheep during estrus cycle

摘要

目的 为阐明甘加藏羊（Ovis aries）发情周期甲状腺激素受体α（THRα）和甲状腺激素受体β（THRβ）在输卵管和子宫中表达，探讨其对藏羊繁殖活动中的调控作用。 方法 选取健康未孕处于发情周期和乏情期的甘加藏羊30只，应用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色方法研究了发情周期和乏情期输卵管和子宫组织THRα和THRβ mRNA及其蛋白含量的表达和分布。 结果 THRα、THRβ mRNA及其蛋白在藏羊发情周期和乏情期输卵管和子宫中均有表达，输卵管中THRα、THRβ mRNA表达量在发情后期最高，显著（P<0.05）高于其他3个时期和乏情期；子宫中发情期表达量最高，与其他时期差异显著（P<0.05）。THRβ mRNA的平均相对表达量显著高于THRα mRNA。输卵管组织中THRα蛋白在发情后期表达量最高，子宫中发情期最高，显著（P<0.05）高于与其他时期。输卵管和子宫中THRβ蛋白在发情后期表达量最高，与其他时期差异显著（P<0.05）。乏情期THRα、THRβ mRNA及其蛋白的平均表达量显著低于发情周期各时期。免疫组织化学染色结果显示：藏羊发情周期THRα和THRβ免疫反应阳性细胞主要表达在输卵管的黏膜上皮、纤毛细胞、分泌细胞和肌层，在子宫中主要表现在基质细胞和子宫腺。 结论 THRα和THRβ二者两者浓度差异性表达，表明THRs对甘加藏羊发情时期的输卵管和子宫有一定的调控作用，可能参与甘加藏羊生殖生理活动。

Abstract

Objective The study aimed to elucidate the expressions of Thyroid hormone receptor α (THRα) and Thyroid hormone receptor β (THRβ) in the oviduct and uterus during the estrous cycle of Ovis aries,exploring their regulation effect on breeding activities of the Tibetan sheep. Method Thirty healthy and non-pregnant Ganjia Tibetan sheep in estrus and anestrus were employed.Real-time PCR，Western blot，and immunohistochemical staining were used to study the expression and protein content of THRα and THRβ mRNA in the oviduct and uterine tissues during estrus and anestrus. Result The THRα and THRβ mRNA and their proteins were expressed in the fallopian tubes and uterus of Tibetan sheep during the estrus cycle and anestrus period.The expression levels of THRα and THRβ mRNA in the fallopian tubes were the highest in the late estrus period，which were significantly (P<0.05) higher than those in the other three periods of the estrus cycle and anestrus period.The average relative expression level of THRβ mRNA was significantly higher than that of THRα mRNA in utero during estrus (P<0.05).The expression level of THRα protein in oviduct tissues was the highest in the late estrus period，and the highest in the uterus tissues in estrus period，which was significantly (P<0.05) higher than was in other periods.The expression level of THRβ protein in the oviduct and uterus was the highest in late estrus，which significantly differed from the other periods (P<0.05).The average expression levels of THRα and THRβ mRNA and their protein in the anestrous period were significantly lower than those in each estrous period.The results of immunohistochemical staining showed that THRα and THRβ immunoreactive cells were mainly expressed in the mucosal epithelium，ciliary cells，secretory cells，and myometria of the fallopian tube，and in stromal cells and uterine glands of the uterus. Conclusion The different-concentration expression of THRα and THRβ suggested that THRs could regulate the fallopian tube and uterus of Ganjia Tibetan sheep during estrus，which was probably involved in the reproductive physiological activities of Ganjia Tibetan sheep.

Graphical abstract

关键词

甘加藏羊 / 输卵管 / 子宫 / 发情周期

Key words

Ganjia Tibetan sheep / oviduct / uterus / estrus cycle

Author summay

张光敏，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

甲状腺合成分泌的甲状腺素（thyroid hormone，TH）通过与其受体结合，调节相关基因表达对动物生长发育、生殖、新陈代谢等发挥重要调节作用^［1］。甲状腺激素受体（thyroid hormone receptors，THRs）属类固醇核受体超家族成员，有甲状腺激素受体α（thyroid hormone receptor α，THRα）和甲状腺激素受体β（thyroid hormone receptor β，THRβ）2种。TH通过与下丘脑THRs结合参与促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）脉冲释放的神经内分泌过程来实现对性腺轴系统的繁殖调控^［2］。在下丘脑中三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）通过亲吻促动素（kisspeptin，kiss）与RF氨酸相关肽（RF amide-related peptides，RFRP）作用于GnRH神经元，调节GnRH的释放，影响促性腺激素的分泌，从而影响季节性发情^［3］。甘加藏羊为季节性发情动物，生活于3 000 m海拔以上的甘南州，2.5岁开始配种，发情周期平均为（16±2） d，每年产羔1次，1次1胎，因高寒牧场冷季较长以及饲养管理粗放导致其繁殖成活力低下^［4］。目前研究表明甲状腺激素、甲状腺合成酶对甘加藏羊下丘脑-垂体-卵巢轴（hypothalamic-pituitary-ovary axis，HPO）各器官功能活动及藏羊的发情、排卵等生殖活动发挥着重要的调控作用^［5］，现有研究主要集中在动物HPO轴的THRs的表达，而有关THRs基因和蛋白是否与藏羊输卵管和子宫功能活动有关的研究及其对繁殖活动的影响报道较少。因此本研究应用qRT-PCR、Western-blot、IHC等检测方法对甘加藏羊发情周期和乏情期输卵管、子宫组织中THRs mRNA及其蛋白表达和分布进行研究，为深入研究甲状腺激素对藏羊生殖活动的调控机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在发情季节（7~9月）和非发情季节（3~6月）于甘南藏族自治州甘加乡藏羊养殖场选取30只健康未孕年龄2.5~3.5岁的雌性甘加型藏绵羊，在藏羊非繁殖季节，确定乏情期设为对照组。根据4期分法^［6］和发情周期阴道细胞变化规律^［7］观察到公羊爬跨，此时判定为发情期开始，将发情周期藏羊分为发情期（0~36 h）、发情后期（36~72 h）、间情期（4~13 d）、发情前期（13~16 d），每组6只。在相应各时期颈动脉放血处死试验用羊，迅速取出子宫和输卵管组织，将所取组织平均分为2份，一份置于4%多聚甲醛中，以备免疫组织化学试验。一份置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱中，以备定量RT-qPCR和Western-blot试验。

1.2 甘加藏羊发情周期输卵管和子宫中总RNA的提取与THRs mRNA检测

严格按照RNA提取试剂盒（北京，TransGen）说明书操作，分别提取子宫和输卵管总RNA，测定RNA浓度和纯度，控制RNA的D_260nm/D_280nm在1.8~2.0的范围。根据反转录试剂盒进行，反转录出cDNA第1条链，-20 ℃保存备用。根据NCBI上绵羊的THRs和β⁃actin基因序列，利用Premier 5.0软件设计引物，引物合成见表1（上海生工生物科技有限公司合成）。以反转录的cDNA为模板，RT-qPCR体系共20 μL，每个样品设3个重复，进行扩增。SPSS 26.0软件进行数据分析，t检验比较其差异显著性。

1.3 甘加藏羊发情周期输卵管和子宫中THRs蛋白表达的检测方法

取1 g组织，加入1 mL蛋白裂解液，研磨取上清，配制5%浓缩胶和12%分离胶，以5 μL的上样量进行电泳后，转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加THRα抗体和THRβ抗体以及β-actin多克隆抗体（1∶500稀释）4℃孵育过夜，PBST洗膜，每次20 min；加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶4 500稀释）37 ℃恒温孵育60 min；PBST洗膜，每次20 min；滴加发光液，WB扫描成像仪扫描蛋白条带（n=3），Image-J分析成像结果。以β-actin为内参，并用SPSS 26.0软件进行分析。

1.4 甘加藏羊发情周期输卵管和子宫中组织形态特点和THRs表达与定位的免疫组织化学检测方法

取福尔马林内固定好的子宫和输卵管进行石蜡包埋、制备成5 μm的石蜡切片脱蜡处理后，进行常规HE染色。

取福尔马林内固定好的子宫和输卵管进行石蜡包埋、制备成5 μm的石蜡切片脱蜡处理后，用微波法进行抗原修复，PBS清洗，加3%H₂O₂（Bioss，北京）在湿盒37 ℃下孵育15 min，正常山羊血清工作液37 ℃封闭15 min，THRα和THRβ一抗稀释液（兔抗羊，1∶350），阴性对照组中一抗用PBS代替，4 ℃孵育过夜后37 ℃孵育1 h，依次滴加生物素标记的羊抗兔IgG，37 ℃孵育15 min，辣根标记链霉卵白素工作液（C液）37 ℃孵育15 min，新鲜配置的DAB（Bioss，北京）显色，苏木精染色并脱水透明后用中性树胶封片。染色结果用Motic SK210型光学显微镜观察拍照。

2 结果与分析

2.1 甘加藏羊发情周期输卵管和子宫中THRs mRNA表达

qRT-PCR结果显示，THRα mRNA在输卵管中发情后期达到最大值，与其他3个时期和乏情期差异显著（P<0.05）；子宫中发情期表达量最高，显著（P<0.05）高于其他3个时期和乏情期（图1）。THRβ mRNA输卵管中发情后期最高，显著（P<0.05）高于其他3个时期和乏情期；子宫中发情期表达量最高，显著（P<0.05）高于其他3个时期和乏情期。发情周期各时期THRα、THRβ mRNA平均相对表达量均高于乏情期。

2.2 甘加藏羊发情周期输卵管和子宫中THRs蛋白的表达

结果分析发现，THRα蛋白在输卵管中发情后期表达量达到最大值，与其他3个时期差异显著（P<0.05）；子宫中发情期最高，在发情前期最低，显著（P<0.05）高于其他3个时期和乏情期。THRβ蛋白在输卵管中发情后期表达量最高，在发情期表达量最低，发情后期显著（P<0.05）高于其他3个时期和乏情期，发情期与间情期差异不显著（P>0.05）；子宫中发情后期表达量最高，乏情期表达量最低，发情后期显著（P<0.05）高于其他3个时期和乏情期（图2~3）。

2.3 甘加藏羊发情周期输卵管子宫组织形态变化和THRs阳性产物的分布

通过对不同发情周期输卵管和子宫组织的HE染色（图4A-H）发现，发情前期（图4-A）输卵管内膜细胞和微绒毛增长，发情期（图4-B）纤毛细胞体积增大且细胞密集，到发情后期（图4-C）体积达到最大，间情期（图4-D）细胞疏松且体积减小；发情前期（图4-E）子宫内子宫腺增多，发情期（图4-F）基质细胞和子宫腺体积增大且黏膜变厚，发情后期和间情期（图4-G，H）腺腔扩张，体积较发情期小。

通过对不同发情周期输卵管和子宫IHC结果分析，THRα、THRβ的免疫反应产物为棕黄色。所有对照组试验的标本均呈阴性，证明所用（一抗）抗体具有THRα和THRβ免疫反应的特异性。甘加藏羊发情周期各时期输卵管和子宫组织中均有THRα、THRβ蛋白的表达（图5-I~X），THRβ的阳性表达强于THRα。THRs主要表达在输卵管的黏膜上皮、纤毛细胞、分泌细胞和肌层（图5-I~L，Q~T），纤毛细胞中免疫阳性产物表达强，着色深，且在发情期（图5-J）和发情后期（图5-S）着色较深；在子宫中基质细胞和子宫腺呈高表达（图5-M~P，U~X），且在发情后期着色较深（图5-O，W）。

3 讨论

输卵管是运送卵子和受精的部位，由黏膜、肌层和浆膜组成。研究表明在发情前期会引起输卵管内膜细胞和微绒毛增长，输卵管黏膜上皮细胞分泌活性物质为早期胚胎发育提供适宜的生理环境。Jansen ^［8］证实在黄金仓鼠HPO轴中均有THRs的表达。甲状腺的主要分泌产物是四碘甲腺原氨酸（thyroxine，T4），经TH转运蛋白和甲状腺素脱碘酶作用可以转化为活性强的T3^［9］，而T3的核激素受体THRs可介导T3的生物活性，从而调节GnRH的释放，对季节性动物的繁殖活动进行调控^［10］。TH可通过与其受体结合和通过PI3K/AKT通路的共同作用^［11］。TH调控性腺轴系统繁殖的另一种方式可能是通过THRs直接参与GnRH脉冲释放来实现。Billings ^［12］对绵羊甲状腺进行切除后，不能终止其季节性繁殖状态，为其注射T4后进入非繁殖状态。George ^［13］给下丘脑内注射T3能影响促黄体素（LH）分泌；Yasuo ^［14］发现高浓度的T3导致LH和促卵泡素（FSH）的分泌增加，进而促进性腺生长，通过血液循环FSH和LH与输卵管内其受体相互作用从而发挥其生理活性，为摄取卵子、精子获能和受精等提供最适条件^［15］。葛闻博^［16］发现GnRH对甘加藏羊发情周期具有调控作用，TH通过其受体THRs对性腺激素受体转录进行调控，从而作用于性腺组织中的促性腺激素受体，对发情期的开始、卵子产生等繁殖活动有直接调控作用^［17］。本研究首次对甘加藏羊输卵管组织THRα和THRβ蛋白分布和表达进行了观察，THRα和THRβ阳性细胞主要分布在输卵管黏膜上皮和肌层组织。同时证实输卵管中THRα、THRβ mRNA和THRα蛋白表达量在发情后期表达量最高，THRβ的蛋白表达量在发情期表达量最高，发情周期THRα和THRβ在输卵管中呈现动态变化，提示THRs参与输卵管功能活动，THRs蛋白在输卵管发情期和发情后期高表达可能为卵子的运输、排卵后精子的获能及卵子和精子的结合提供可能的环境。这与刘莉莉^［5］的研究得出THRβ主要在发情后期调控甘加藏羊的生殖活动，参与调控卵泡发育和排卵等生殖活动一致。提示其THR参与调控藏羊的发情周期生殖活动。

子宫是胚胎附植及孕育胎儿的器官，动物生长发育过程中子宫发生一系列有周期性的规律性变化^［18］。子宫分为子宫内膜、子宫肌膜和子宫外膜3层，在发情前期子宫粘膜血管增生且粘膜变厚，其中子宫内膜是胚胎植入的关键，而它的结构功能在发情周期过程中随激素变化而不断变化，对动物妊娠、繁殖具有重要意义^［19］。本研究IHC结果显示，THRs在子宫角、子宫体和子宫颈的子宫内膜中都有阳性表达，主要表达在基质细胞和子宫腺。子宫内膜腺是子宫膜内能分泌糖原、糖蛋白等物质的结构之一，对精子的获能、胚儿的发育具有重要作用，这提示了THRs在子宫中可能发挥调控作用。有研究表明褪黑素（MT）对TH具有调节作用，进而激活HPO轴内的相关激素^［5，20］。THRα和THRβ都介导T3的特定功能^［21］。T3和T4一方面对GnRH神经元起直接调控作用，影响动物生殖活动^［3，21］；另一方面通过KISS/GnRH通路，使T3通过kiss与RFRP相互作用，刺激GnRH神经元，从而影响GnRH的脉冲性释放，控制季节性发情^［3］。本研究发现，THRs mRNA和蛋白呈现一定的动态变化。THRα mRNA和蛋白在发情期相对表达量最高，而且从发情前期开始呈现上升趋势。THRβ mRNA在发情期相对表达量最高，THRβ蛋白的相对表达量在发情后期最高，而且从发情前期开始呈上升趋势。这与刘莉莉^［5］试验中得出的在HPO轴THRβ mRNA和蛋白在发情后期表达量最高有差异，可能的原因是检测的组织不同，这与调节精子的获能、为卵子后续运行提供适宜条件和适合的环境等有关系。有研究报道称，雌激素是性器官发育的主要激素，TH接受到性腺激素的反馈调节主要是通过THRs能诱导雌激素受体的转录来实现^［22］。所以THRs在不同组织中表达时，其mRNA与蛋白相对表达会有差异，具体的影响机制需进一步进行研究。

4 结论

本研究结果表明，甘加藏羊发情周期各个时期和乏情期THRs mRNA及其蛋白在输卵管和子宫中相对表达量呈现动态变化，且具有一定的差异，这种差异证明THRs参与甘加藏羊的生殖调控，为进一步研究THRs对藏羊的繁殖调控提供一定的理论和试验依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31960689)