四海舒郁丸介导miRNA-494对甲状腺乳头状癌细胞的干预作用

Study on the intervention effect of Sihaishuyu pill mediated by miRNA-494 on thyroid papillary carcinoma cells

摘要

目的 探讨四海舒郁丸含药血清对甲状腺乳头状癌细胞miRNA-494及靶基因PTEN和相关通路PI3K/AKT的干预机制。 方法 将2月龄SPF级雄性SD大鼠随机分为四海舒郁丸低、中、高剂量组与空白组，每组5 只，灌胃给药后制备四海舒郁丸含药血清和空白组血清（等量生理盐水）并作用于体外培养的细胞。试验组甲状腺乳头状癌细胞选用KTC-1细胞株，分为空白组（2 mL/（100 g·d）生理盐水），低、中、高剂量组（分别为0.24、0.48 、0.96 g/（100 g·d）），正常组甲状腺组织细胞选用Nthy-ori-3-1。通过CCK-8探究细胞的活力的影响；RT-qPCR检测miRNA-494-5p及PTEN的mRNA表达水平，Western Blot法检测PTEN及下游PI3K/AKT通路蛋白表达水平。 结果 四海舒郁丸能抑制KTC-1细胞的活性，且作用随浓度的增加而增强（P<0.01），但无时间依赖性；相比较于KTC-1空白组，四海舒郁丸低、中、高剂量组中miRNA-494-5p的mRNA表达均降低（P<0.01），PTEN的mRNA表达量增加，其中高剂量组差异有统计学意义（P<0.05）；高、中、低剂量组中p-PI3K/p-AKT信号通路蛋白表达均明显下降（P<0.05），而PTEN蛋白表达均有所增加（P<0.01）。 结论 四海舒郁丸含药血清通过下调miRNA-494-5p后负向调控PTEN进而阻断PI3K/AKT通路对PTC发挥辅助抑癌作用。

Abstract

Objective To investigate the intervention mechanism of Sihaishuyu pill containing serum on miRNA-494，target gene PTEN and related signaling pathway PI3K/AKT in papillary thyroid carcinoma cells. Method SPF male Sprague-Dawley rats aged 2 months were randomly divided into low，medium，and high-dose Sihaishuyu pill group and blank control group，with 5 rats in each group.After gavage，the serum containing Sihaishuyu pill and the serum of the blank control group （with the same volume of normal saline） were prepared and used as cultured cells in vitro.Thyroid papillary cancer cells in the experimental group were divided into blank group （2 mL/（100g·d） normal saline），low，medium and high dose groups （0.24，0.48，0.96 g/（100g·d），respectively）.Thyroid cells from the normal group were selected and Nthy-ori-3-1.CCK-8 was used to study the effect on cell viability.The mRNA expression levels of miRNA-494-5p and PTEN were detected by RT-qPCR，and the protein expression levels of PTEN and its downstream PI3K/AKT pathway were detected by Western blot. Result Sihaishuyu pill could inhibit the activity of KTC-1 cells in a dose-dependent manner （P<0.01），but not in a time-dependent manner.Compared with the KTC-1 blank group，the mRNA expression of miRNA-494-5p was decreased （P<0.01），and the mRNA expression of PTEN was increased in the low，medium and high dose groups of Sihaishuyu pills，and the difference in the high dose group was statistically significant （P<0.05）.The expression of p-PI3K/ p-Akt signaling pathway protein was significantly decreased in the high，medium and low dose groups （P<0.05），while the expression of PTEN protein was increased （P<0.01）. Conclusion Sihaishuyu pill serum may have an additional anti-cancer effect on PTC by down-regulating miRNA-494-5P and negatively regulating PTEN to block the PI3K/AKT pathway.

Graphical abstract

关键词

四海舒郁丸 / miRNA-494 / 甲状腺乳头状癌 / PTEN / PI3K/AKT

Key words

Sihaishuyu pill / miRNA-494 / papillary thyroid carcinoma / PTEN / PI3K/AKT

Author summay

陈茜茜，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

甲状腺癌（carcinoma of thyroid）是头颈部常见的恶性肿瘤，以甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）最为常见，约占甲状腺癌的80%~90%^［1］。值得注意的是，此型具有惰性生物学特性^［2］。故其治疗方式不应仅限于常规西医治疗，随着过度医疗概念的广泛普众，传统医学的辅助治疗备受关注且接受度随之增加。治疗方案组合化的优势日渐突出，特别是基因靶向治疗、传统医学与常规治疗（如手术，化疗）相结合。联合治疗将为PTC的诊治提供新的视角。甲状腺癌归属于中医之“瘿瘤、瘿病”，四海舒郁丸作为治瘿经典古方，配方中木香、陈皮具有改善循环、扩张血管的作用，可通过改善血液循环缓解结节囊肿及局部钙化、纤维化，并且木香的镇静作用可减轻焦虑、抑郁等负性情绪；昆布、海螵蛸等含碘丰富可弥补合成甲状腺激素原料不足的问题，抑制甲状腺激素释放，促使甲状腺代偿减轻，消除结节及甲状腺肿。研究表明，四海舒郁丸辅助优甲乐可有效治疗甲状腺肿，可减少结节直径及数目，也可改善情绪，并且不会进一步损害甲状腺功能^［3-5］。但其辅助抗瘤作用疗效及机制有待进一步探究，以便更好服务于临床。本研究将探讨miRNA-494与甲状腺乳头状癌的相关性及四海舒郁丸对miRNA-494及靶基因PTEN和相关通路PI3K/AKT的干预作用。旨在为甲状腺乳头状癌的诊治提供更多的理论依据与治疗方法。

1 材料与方法

1.1 细胞

甲状腺乳头状癌KTC-1细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，正常人甲状腺Nthy-ori3-1细胞购自上海富衡生物科技有限公司，均于我校“甘肃省中医药防治慢性疾病重点实验室”培养传代。

1.2 动物

2月龄SPF级雄性SD大鼠20 只（180~220 g），试验动物购自并饲养于甘肃中医药大学动物实验中心，许可证号为SYXK（甘）2015-0005。动物许可证号为SCXK（甘）2015-0002。饲养条件：温度：（22±2）℃；湿度：40%~60%；光照周期：12 h/12 h，普通饲料喂养，自由进食进水。试验程序和方法得到甘肃省人民医院医学伦理学会批准。

1.3 药物

四海舒郁丸药物（自制）组成：木香20 g，陈皮10 g、海蛤粉10 g，海藻70 g、昆布70 g、海螵蛸60 g，均购自甘肃中医药大学附属医院中药配方颗粒药房。

1.4 主要试剂

胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、RPMI1640培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶，青链霉素混合液双抗；CCK-8试剂盒，兔单克隆抗体 p-AKT、兔多克隆抗体p-PI3K（Affinity，AF0208；AF6261；AF3241）；兔单克隆抗体 PI3K、AKT（美国Cellsignaling technology，4249T、4691T），尿蛋白定量测试盒（CBB法），生产批号：20211209。高效RIPA 组织/细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝，批号：20220808；20220519），细胞/组织总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒（上海翌圣，批号：19221ES50；11141ES60）。

1.5 主要仪器

细胞培养箱（日本三洋公司，SDK-8CS），超微量分光光度计（Ther mo Scientific），高速冷冻离心机（Sigma公司），反转录仪（Ther mo Scientific），SIEMENS冰箱（博西华家用电器有限公司），-80 °C冰箱（Ther mo Electron C orporation），纯水系统（Milli-QB iocel），酶标仪（iMark公司），电泳仪（BIORAD，mini protean 3 cell），实时荧光定量PCR仪（FuNGLYN BIOTECH INC公司）。

1.6 主要方法

1.6.1 四海舒郁丸含药血清的制备与分组

取SD大鼠20只随机分为空白组和四海舒郁丸低、中、高剂量组，每组5只，制备空白血清组和四海舒郁丸含药血清组。其中中药含药血清浓度受中药灌胃剂量、采血时间、血清稀释程度3个因素的影响，主要是通过控制1个或2个因素不变，另为变量的筛选方式进行设计试验；其中“同剂量灌胃，同采血时间，不同体积分数”“不同剂量灌胃，同采血时间，同体积分数”是中药体外细胞试验最常见的筛选方法，综合考虑各个利弊后，为反映中药在体内的消化吸收、代谢及最后产生药理效应的真实结果，血清中既有药物原形成分，代谢成分及体内产生的应激成分，又能够反映药物在体内的真实状态；避免稀释操作过程繁杂导致试验误差等。本文选择后者进行干预细胞后，比较不同组间的差异^［6］。四海舒郁丸给药剂量根据《中药药理研究方法学》体表面积折算^［6］。低、中、高剂量组分别将0.24、0.48、0.96 g/（100g·d）四海舒郁丸颗粒溶于2 mL/100g生理盐水，空白组予2 mL/100g生理盐水，每日灌胃1次，连续7 d。末次给药1 h后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏采血（操作简单、采血量大、 样本质量可靠、便于一次性处死试验动物；其他采血方式：眼后静脉丛，剪尾法，腹主动脉等也可选择，综合考虑各采血方式的优缺点及非实验中间过程的采样等因素选择心脏采血），室温静置30 min，3 000 r/min离心15 min后取上清液。56 ℃、30 min水浴灭活，微孔滤膜滤过除菌，分组分装标记，-80 ℃保存备用。

1.6.2 细胞的培养

将冻存的KTC-1细胞和Nthy-ori3-1细胞置于37 ℃水浴快速溶解，将细胞悬液吸至离心管，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，用PBS清洗1~2次后加入含10%FBS的完全培养基（KTC-1细胞用DMEM、 Nthy-ori3-1细胞用RPMI1640），置于37 ℃、5% CO₂培养箱内培养，首次待贴壁后更换培养基，之后2~3 d换1次培养基。取对数生长期细胞用于后续试验。

1.6.3 CCK-8法检测KTC-1细胞活力

将含10%FBS的DMEM培养液的KTC-1细胞悬液以4×10⁴/L的密度接种于96孔板，每孔100 μL，每组设5个复孔，放入37 ℃，5% CO₂的培养箱中继续培养（细胞须长满80%以上）。后用含10%的各组四海舒郁丸含药血清的DMEM培养液干预24、48和72 h，37 ℃孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm处吸光度（OD）值。计算各组的KTC-1细胞存活率。进行3次独立重复试验。

1.6.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miRNA-494和PTEN的mRNA表达量

miRNA-494和PTEN引物由武汉谷歌生物科技有限公司合成。将细胞悬液用PBS洗涤细胞2次，用Trizol试剂提取细胞总RNA。使用紫外分光光度计检测细胞RNA纯度（每样品A₂₆₀/A₂₈₀在1.8~2.1）和浓度。按照RT-qPCR试剂盒说明书配置逆转录反应体系合成cDNA，每组取2 μL的总RNA反转录为cDNA，反转录结束后按照PCR反应体系进行扩增，以U6和GAPDH作为内参照，进行PCR产物的定量分析。PCR反应条件：预变性：95 ℃，30 s；变性：94 ℃，20 s，退火：58 ℃，20 s，延伸：72 ℃，20 s，共40个循环。使用2^-ΔΔCt定量方法分析mRNA表达量。进行3次独立重复试验。

1.6.5 Western-blot法检测PTEN和PI3K/AKT通路的相关蛋白表达水平

配置不同培养液干预各组KTC-1细胞（分别含10%高、中、低四海舒郁丸含药血清的DEME培养基）和正常细胞（含10%FBS的RPMI1640培养基）24 h，用预冷的PBS洗2次，在冰上分别用预冷细胞裂解液RIPA，裂解细胞并提取非磷酸化和磷酸化蛋白，BCA法定量蛋白浓度并确定上样量。然后进行免疫印迹检测，通过SDS-PAGE后分离并转移至PVDF膜。用含有0.05%TBST和5%脱脂奶粉的缓冲液轻摇封闭PVDF膜2 h，加入目标蛋白Ⅰ抗PTEN、AKT、PI3K、P-AKT、P-PI3K（1∶1 500）4 ℃孵育过夜。次日TBST（1X）洗膜3次（15 min/次）后加入Ⅱ抗（1∶1 500）室温轻摇孵育2 h。洗膜3次后用超敏发光试剂显色（ECL A液和B液=1∶1），进行显影和定影。采用Photo Shop整理去色，软件Image J处理分析目标带的光密度值，以目标蛋白与内参照GAPDH的灰度值比值做统计分析。进行3次独立重复试验。

1.7 统计学方法

采用SPSS 24.0软件，数据经正态性以及方差齐性检验后，计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。CCK8结果用完全随机设计的方差分析，其余结果用单因素方差分析；方差不齐选择非参数检验的两独立样本t检验。

2 结果与分析

2.1 四海舒郁丸含药血清对甲状腺乳头状癌KTC-1细胞活力的影响

甲状腺乳头状癌KTC-1细胞活力的影响如表2和图1所示。CCK-8结果显示，在干预的24、72 h时间段内，与KTC-1空白组相比，低、中、高剂量组均能对KTC-1细胞的增殖活力有不同程度的抑制作用（P<0.01），尤其24 h时，随着浓度增加，其抑制作用逐渐增强，差异具极显著统计学意义（P<0.01）。但并没有表现出时间依赖性。根据KTC-1细胞在不同浓度不同时间下的细胞活力的变化，选择具有明显抑制效果的24 h培养时间进行后续试验。

2.2 四海舒郁丸含药血清对KTC－1细胞中miRNA-494和PTEN mRNA表达的影响

RT-qPCR结果如表3和图2所示，与正常甲状腺组织细胞组相比，在癌细胞KTC-1空白组中，miRNA-494-5p mRNA则相对高表达（P<0.01）；而PTEN mRNA相对低表达（P<0.01）。经含药血清干预后，与癌细胞KTC-1空白组相比，PTEN mRNA表达量随剂量的增大有不同程度的增加，其中高剂量组对PTEN mRNA的影响最大（P<0.01）；相反，与癌细胞KTC-1空白组相比，含药血清高、中、低剂量组miRNA-494-5p mRNA相对表达量均有所减少（P<0.05），尤以中剂量组对miRNA-494-5 mRNA表达影响较明显，差异具有统计学意义（P<0.01）。

2.3 四海舒郁丸含药血清对甲状腺乳头状癌KTC-1细胞中PTEN及PI3K/AKT通路相关蛋白的表达的影响

Western blot结果如表4和图3、4所示，与正常甲状腺组织细胞Nthy-ori3-1组相比，PTEN在KTC-1空白组细胞中相对低表达（P<0.01），p-PI3K及p-AKT相对高表达，差异具有统计学意义（P<0.01），PI3K、AKT表达无统计学意义。经含药血清干预后，与KTC-1空白组相比，含药血清高剂量组的PTEN表达有所提高（P<0.01），p-PI3K相对低表达（P<0.01），但无明显浓度依赖性，p-AKT也相对低表达（P<0.01），在中剂量组差异更加显著（P<0.01），PI3K、AKT相对表达量无统计学意义。

3 讨论

PTC为最常见的甲状腺癌，起源于能产生和储存甲状腺激素的滤泡细胞，其生长缓慢、恶性程度低、预后良好，发病机制尚不清，涉及机体免疫、肿瘤血管生成等多阶段和多基因调控。且归属惰性癌，其增殖、转移复发能力差，故为其早期可以通过中西医结合、基因调控等联合方式进行干预及治疗提供依据。然而，目前PTC的诊治局限，寻找敏感准确的生物学指标是研究方向之一。microRNAs的调控与人类PTC关系密切^［8］。其中miRNA-494通过促凋亡、调控肿瘤因子等表现出广泛的抗肿瘤活性。在食管癌中Circ-0007142通过海绵吸附miR-494-3p上调靶基因SH3蛋白1增强顺铂耐药性，而在肝癌细胞中Linc01612作为竞争性内源性RNA并通过海绵化miR-494促进活化转录因子3（ATF3）的表达，进而激活p53通路^［9-10］。miR-494与高水平亚油酸摄入诱导的癌症休眠也有关^［11］。说明此miRNA在癌症治疗中具有一定的调控作用及研究意义。本小组前期也对PTC患者癌组织及癌旁组织进行转录组测序并筛选显著差异表达的microRNA时发现miRNA-494-5p表达显著上调^［12］。并且在恶性甲状腺结节中，PTEN相关miRNA-494在细针穿刺细胞学检查（FNAB）标本、外周循环中的表达水平存在差异，miRNA-494可辅助FNAB作为早期诊断甲状腺癌的分子标记物^［13］。本研究亦验证miRNA-494-5p mRNA在甲状腺乳头状癌细胞KTC-1空白组中相对高表达，而在正常细胞（Nthy-ori3-1）中相对低表达，提示此基因可能促进PTC的发生发展。

此外，microRNA也可调控各种抑癌、原癌基因的表达。而miRNA-494被推测为致癌基因，作为肿瘤启动子在癌组织中高表达，促进肝细胞癌、膀胱癌等细胞增殖、侵袭迁移；抑癌基因PTEN为其靶标，与miRNA-494的表达呈负相关，并且PTEN被证明可逆转miRNA-494的促癌作用，抑制PI3K/AKT信号通路发挥抑癌作用^［14-16］。PTEN低表达或缺失影响细胞生长、分化和凋亡，在肿瘤细胞浸润、血管生成等方面也发挥重要作用，参与调控肝癌、甲状腺癌的发生发展^［17-19］。本研究也发现PTEN蛋白及mRNA在癌细胞中均相对低表达，且与miRNA-494呈负相关，故推测PTEN为miRNA-494的负性靶基因，miRNA-494可能靶向下调PTEN进而发挥促癌作用。PTEN还介导多个信号通路并发挥生物学功能，其中就包括PI3K/AKT，此通路发现于20世纪80年代，广泛参与肿瘤的发生过程^［20］。PI3K是一种与细胞内信号转导有关的脂类第二信使，在炎症、肿瘤、代谢等疾病的发病机制中发挥着重要作用。AKT是原癌基因c-AKT编码的一种57 kU的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K直接的靶蛋白。PI3K/AKT信号通路能激活核因子κB（NF-κB），上调各种致炎因子的表达且增强肿瘤坏死因子-α（TNF-α）产生和释放，导致细胞因子的失衡，促进其他多种细胞因子的产生和释放，最终扩大炎性连锁反应。并且PI3K/AKT通路是广泛存在于细胞内重要的生存信号转导通路之一，其激活与细胞增殖、分化、凋亡、自噬密切相关。 赵粉琴等^［21］研究明确表明上调 PI3K/Akt/Foxo3a 信号通路会诱导颗粒细胞凋亡，进而损伤卵巢组织，导致卵泡凋亡闭锁等。同时，PI3K/AKT信号通路也被验证参与调控PTC的发生发展^［21］。而PTEN表达缺失致杀伤性T细胞数量和杀伤能力下降，通过异常激活PI3K/Akt通路引起肿瘤免疫耐受^［23-24］，并使肿瘤更具侵袭性。结合本试验癌细胞中miRNA-494 mRNA相对高表达，PTEN mRNA呈负性下调趋势，PI3K/AKT信号通路过度激活后高表达。进一步说明miRNA-494可能通过负性调控PTEN进而激活PI3K/AKT信号通路发挥促癌作用。

中医学中甲状腺疾病类属“瘿病”范畴，与情志、饮食因素密切相关。病变在肝、脾，涉及心，病机多为气机郁滞及脾伤气结，脾虚生痰湿，痰气交阻、凝结与颈前，日久血脉瘀阻，则气、血、痰壅结而成瘿病。故重在行气化痰，破瘀散结。四海舒郁丸取自《疡医大全》卷十八，原文药物由木香15 g，陈皮、海蛤粉各9 g，海带、海藻、昆布、海螵蛸各60 g组成，以海带、海藻、昆布、海螵蛸共为君药，其中海藻、昆布均归属归肝、胃、肾经，功效为软坚散结，消痰，利水。臣药木香、陈皮皆为重点理气药，二者合用则行气疏肝，畅达气机，增强行气化痰调中止痛之功。佐以海蛤粉以清热化痰软坚，正如《本经逢原》：散瘿瘤，解热毒。共同起到行气化痰，破瘀散结的作用。

中医因其独特的整体观念与辨证论治体系，辅助抑癌作用的研究意义重大，加之甲状腺乳头状癌的惰性特性，使得中药干预作用成为可能。本次研究结果发现四海舒郁丸干预后miRNA-494-5p mRNA相对表达量降低，而靶基因PTEN mRNA相对表达量上调。同时随含药血清浓度的增加，PTEN的表达增加，明显下调p-PI3K/p-AKT的表达。结合研究报道PTEN亦可通过局灶黏附激酶（FAK）和SH2包含蛋白（Shc）的去磷酸化抑制细胞的黏附侵袭及血小板源性生长因子（PDGF）和血管生成素（Ang）、血管内皮生长因子（VEGF）和环氧合酶2（Cox-2）等多种血管生成因子的表达，从而抑制肿瘤血管的生成^［25-26］。而四海舒郁丸中软坚药物可治疗瘀血与痰浊凝聚成形，息而沉积的病变，选择性地作用于血行不畅而瘀阻在体内的病灶部位，使其软化变性，结合理气药的行气化瘀功效，最终起到软坚散结、化瘀祛浊的作用，达到淤血不去、新血不生，气行则血行的作用机理，共同起到祛除瘀血秽浊，抑制新的瘀浊瘤体的生成及发展，进而进一步激活抑癌基因PTEN的高表达，类似于一个正反馈调节的过程，起到辅助抑癌作用。同时PTEN也是AKT的负性调节器，通过使PI3K下游的分子磷脂酰肌醇-3（PIP3）脱磷酸转变为PIP2，从而抑制Akt的活性，最终阻断PI3K/Akt的信号传导通路，阻断该通路可以明显减少NF-κB、TNF-α等产生从而达到抗炎效果，而西医的炎症类似于中医火热之证，治以清热解毒之法，正好四海舒郁丸中佐药海蛤粉解热毒、散瘿瘤，从而达到减毒增效的效果。全方配合治以痰化而结散、热清而毒除，从而发挥辅助抗癌作用。同时CCK-8结果显示KTC-1细胞的活性也相对降低。因此我们推测，四海舒郁丸通过下调miRNA-494激活抑癌基因PTEN的高表达，进而抑制PI3K/AKT的信号通路，同时降低KTC-1细胞活性，发挥对PTC的辅助抑癌作用。

4 结论

总之，四海舒郁丸作为治疗瘿瘤的经典方剂，能有效抑制KTC-1细胞的活力，并通过下调miR-494负向调控PTEN进而抑制PI3K/AKT信号通路对PTC起到辅助抑癌作用。后续可进一步进行体内抑瘤作用的临床观察研究，为PTC的诊疗及术后辅助治疗提供更加有效的方案。

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基金资助

甘肃省自然科学基金项目(20JR5RA177)

甘肃省自然科学基金项目(20JR10RA368)