孵化过程中鸡胚性别分化期的判定

Determination of the gender differentiation stage of chicken in the process of embryonic development

摘要

目的 研究鸡胚孵化过程中，通过不同方法判断其性别分化的时间。 方法 以黄羽肉鸡胚蛋为研究对象，孵化黄羽肉鸡胚蛋（温度37.8 ℃，相对湿度60%）。分别通过胚线观察法、生殖腺器官形态观察法、组织学形态学、分子生物学来判断鸡的性别分化期，试验重复3次。 结果 通过胚线观察法分析发现，在鸡胚孵化期第3天，可以通过血管分支的粗细和形态来辨别雌雄。通过生殖腺器官的观察，在孵化期第8天，能够明显关察到雄性性腺对称发育，雌性性腺则不对称发育。通过组织学形态鉴定，在孵化期第7~10天，观察到雄性性腺有类似于曲精细管的团索状结构出现，雌性性腺有皮髓结构出现，能够判定鸡胚性别分化期可能为胚胎孵化期第7天。通过分子生物学鉴定，孵化期第3~10天，观察到雄性个体有1条扩增条带，其大小是为550 bp左右，观察到雌性个体有2条扩增条带，其大小为550 bp和450 bp左右，因此判定性别分化期可能为孵化期第3天。 结论 综上判定鸡性别分化期约在胚胎孵化期第3~8天。

Abstract

Objective This study aims to determine the period of sex differentiation during the incubation of chicken embryos. Method The research subject was the yellow feather broiler.The incubation conditions for fertilized eggs were set at a temperature of 37.8 ℃ and a humidity of 60% RH.The egg shape index method，embryo line observation，gonad organ morphology，gonad histology observation，and molecular biology identification were utilized to ascertain the stage of sex differentiation in the developing embryos.The experiment was conducted three times. Result Using the embryo line observation method，it was found that by the third day of incubation，male and female embryos could be distinguished based on the thickness and shape of blood vessel branches.Morphological examination of gonadal organs on the eighth day revealed that male gonads developed symmetrically，whereas female gonads developed asymmetrically.Histological observation of the gonads from seven to ten days of incubation indicated that female gonads exhibited a cortex and medulla structure，whereas male gonads displayed a structure resembling convoluted seminiferous tubules.The initial determination of the sex differentiation stage in chicken embryos was identified as occurring on the seventh day of development.Subsequent molecular biology testing showed a single amplification band in males，approximately 550 base pairs (bp) in size，between three to ten days of incubation.In contrast，females displayed two amplification bands，sized at 550 and 450 bp.Therefore，the sex differentiation stage，as determined by molecular biology methods，may be identified as early as the third day of incubation. Conclusion The sex differentiation of chicken embryos occurs between the third and eighth days of embryonic incubation.

Graphical abstract

关键词

鸡胚 / 孵化 / 性别分化 / 判定

Key words

chicken embryo / gonadal development / gender differentiation / determination

Author summay

王梦磊，本科。E-mail：[e-mail]

家禽养殖业在我国畜牧业生产中占据重要地位。在养殖过程中，鸡的性别决定许多经济性状和生产力。因此，鸡性别控制技术是提高养鸡生产效益的重要途径之一。多年来，一些学者对鸡性别调控的决定因素及性别的分化与反转进行了大量的研究，发现卵生动物在性别分化前进行一定的调控，会有性反转的概率发生^［1］。有研究者用芳香化酶抑制剂注射孵化5 d的受精卵，发现孵出的雏鸡全部转化为雄性^［2］，说明在性别分化的一定时间段进行调控，可能会使鸡性别发生变化，且性别分化期调控时间点的选择对性别的决定会有极大的影响^［3］。目前，鸡胚准确的性别分化时间仍不能确定。有报道，在鸡胚胎孵化过程中最早能够利用细胞形态学方法观察到性别分化的时间是在胚胎孵化期第6天^［4］。也有一些报道在胚胎孵化期的第6.5天时，两性性腺在组织结构外观上的差异已经明确可见，此时在雄性性腺内部的髓质中已经开始形成曲细精管索；而在雌性性腺外侧的皮质层也开始增殖^［5］。性腺发育后，雄性为两侧性腺均发育，但皮质层退化，髓质层增厚，其中含有多个曲精细管结构；而雌性形成不对称发育，仅左侧一边发育，右侧出现退化并逐渐萎缩^［6］。目前，不同方法鉴定的鸡胚性别分化时期存在一定的差异。因此，本研究以黄羽肉鸡受精鸡蛋作为研究对象，分别通过胚线观察、生殖腺器官形态观察、组织学形态鉴定、分子生物鉴定来综合判断鸡胚的性别分化期，进而为定向调控性别提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鸡卵

本试验所用846枚黄羽肉鸡胚蛋均由合肥立华畜禽有限公司长丰孵化场提供，从入孵到孵化结束，都在孵化箱中进行，孵化温度37.8 ℃，相对湿度60 RH，每2 h自动翻蛋1次，试验在安徽农业大学生物科技楼进行。

1.2 主要试剂

快速DNA提取试剂盒购自Tiangen公司；琼脂糖购自Biowest公司；4%多聚甲醛溶液购自Sigma公司；石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、蜂蜡、浓盐酸购自上海国药集团；引物购自安徽通用生物有限公司；50×TAE buffer购自上海吐露港生物科技有限公司；苏木精、伊红购自北京中杉金桥生物技术有限公司；树胶中性购自上海懿洋仪器有限公司；无水乙醇购自江苏强盛功能化学股份有限公司；二甲苯购自广东西陇科学股份有限公司。

1.3 主要仪器及设备

孵化箱产自山东德州裕达孵化设备厂；包埋冷冻机产自浙江科迪仪器设备；半自动石蜡切片机产自沈阳龙首电子仪器；荧光倒置显微镜产自日本Olympus；半自动石蜡切片机产自沈阳龙首电子仪器；电泳仪及电泳槽产自北京六一仪器厂；凝胶成像系统产自美国Bio-rad；普通PCR仪产自杭州朗基科学仪器；涡旋震荡仪产自德国IKA； 电子分析天平产自瑞士Mettler。

1.4 胚线观察法鉴定

1.4.1 观察方法

每天每组选取10枚胚胎（分别为胚胎孵化期第1~6天），于一环境昏暗处对受精蛋进行照检，将手电筒的灯光对准鸡蛋大头气室处，使灯光从上到下垂直穿过鸡蛋，根据鸡胚的血管粗细和分布情况判别鸡胚性别的分化。

1.4.2 判断标准

参照唐剑林等^［7］方法（图1）。雄性：主血管较明显，血管较粗、分布均匀；雌性：血管比较纤细，粗细均匀，分支较多，呈不规则状。

1.5 生殖腺器官形态观察鉴定

1.5.1 生殖腺器官观察

将收集的鸡胚（分别为胚胎孵化期第3~12天）小心沿着腹中线向上剖开，暴露肾脏，性腺位于肾脏上方，为白色短棒状组织。修剪肾脏周围组织，进行观察。

1.5.2 判断标准

参照朱金金等^［8］的方法。雄性性腺为2条白色，近似对称的短棒样组织；雌性性腺表现为一侧退化，另一侧为片状的发育形态。

1.6 组织学形态鉴定

1.6.1 性腺的采集

将孵化不同天的鸡卵（分别为胚胎孵化期第3~12天），以1 d的时间为隔期，分别用镊子从较大的一侧敲破，然后将鸡胚挑出，放置盛有PBS溶液的平皿中，用手术刀轻轻打开鸡胚腹膜，剔除表层组织，暴露出性腺，然后摘取完整的性腺，置于4%多聚甲醛的管中，做好相应标记，放入4 ℃冰柜中保存备用。

1.6.2 石蜡切片的制作

性腺组织切片制作过程参考刘含（2017）的方法^［9］。简而言之，将固定好性腺组织修剪后，放入包埋盒，标记，流水过夜。先放进70%酒精过夜，再按顺序放入80%酒精3 h；90%酒精2 h；95% Ⅰ酒精1 h 45 min；95% Ⅱ酒精1 h；100% Ⅰ酒精45 min；100% Ⅱ酒精30 min，对性腺组织进行乙醇逐级脱水。之后放入二甲苯中透明大约40 min。将切片依次浸入石蜡I和石蜡II各1 h，包埋性腺组织后修块。将组织切成5 μm的切片，放入60 ℃恒温干燥箱中烘干2~3 h备用。

1.6.3 苏木精-伊红（HE）染色

将切片在60 ℃条件下烤片2 h，然后冷却到常温后，浸入二甲苯Ⅰ20 min，再放入二甲苯Ⅱ中直至脱蜡。分别在无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95% 酒精Ⅰ、95% 酒精Ⅱ、80% 酒精、70% 酒精中各浸泡5 min。再将切片放入苏木素6 min后，用流水轻轻冲洗干净。在1% 盐酸酒精中分化2 s，流水冲洗15 min后，放入伊红溶液中染色3 min。分别放入70%酒精、80%酒精、95% Ⅰ酒精、95%Ⅱ酒精、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中各脱色3 min。再在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中，分别脱色10 min，取出切片后擦去其周围的二甲苯溶液，用中性树脂封片，室温晾干，显微镜下观察。

1.7 分子生物学鉴定方法

1.7.1 引物的设计和合成

鸡胚性腺染色体的性别遗传鉴定的引物，参照刘含（2017）的引物设计^［9］。性染色体上的CHD1基因所设计引物如下：CHD1-L：GTTACTGATTCGTCTACGAGA，CHD1-R：ATTGAAATGATCCAGTGCTTG。引物由安徽通用生物系统有限公司合成。

1.7.2 基因的提取

利用TIAN combi DNA Lyse & Det PCR Kit（Tiangen）提取鸡胚胎组织的DNA并进行性别鉴定。基因的提取按照试剂盒说明书步骤进行。简而言之，首先取少量样品于1.5 mL的离心管中，加入100 μL缓冲液B1，覆盖样品。将样品（分别为胚蛋孵化期第1~8天）捣碎、研磨至溶液浑浊变色。再加入100 μL缓冲液B2，震荡混匀之后，12 000 r/min离心2 min。离心后，小心吸取100 μL上清液于1.5 mL离心管中作为模板备用。

1.7.3 PCR扩增反应

根据凝胶电泳的扩增产物的扩增条带情况来确定性别，雄性仅1条扩增条带，大小为550 bp左右；雌性有2条扩增条带，1条大小为550 bp左右，另1条大小为450 bp左右。扩增反应体系如表1所列。PCR反应条件设置：94 ℃预热3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存备用。琼脂糖凝胶电泳：PCR产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳后置紫外透射反射分析仪上观察，电脑成像系统拍照。

2 结果与分析

2.1 胚线观察法鉴定鸡胚的性别分化期

如图2所示，在胚胎孵化期第1~2天，均未观察明显的血管（图2-A~B）；在胚胎孵化期第3天，观察血管出现，血管生长良好，并能以此判断出鸡胚性别（图2-C）；在胚胎孵化期第4~6天，相较于胚胎孵化期第3天能观察到明显的胚盘卵黄囊血管（图2-D~F），观察到雄性主血管较明显，血管较粗、分布均匀，雌性血管比较纤细、粗细均匀、分支较多，且呈不规则状。初步判定鸡胚性别分化期可能为胚胎孵化期第3天。

2.2 生殖腺器官形态观察法鉴定鸡胚的性别分化期

如图3所示，在胚胎孵化期第5天，未能观察到鸡胚性腺（图3–A1~A2）。在胚胎孵化期第6天，在肾脏内侧边缘观察到性腺组织，但形态并不规整，无法判断出性别（图3–B1~B2）。在胚胎孵化期第7天，相较于胚胎孵化期第6天，性腺的形态轮廓清晰，体积明显变大，但发育情况仍不足以判断性别（图3-C1~C2）。在胚胎孵化期第8天，性腺有清晰的轮廓，观察到雌性性腺不对称发育，即右侧不发育，左侧正常发育，（图3-D1所示），而雄性两侧对称发育（图3-D2所示）。在胚胎孵化期第9~10天，相较于胚胎孵化期第8天性腺进一步发育，雌性的两侧发育的不对称性也愈发明显（图3-E1~F1）；雄性性腺两侧对称发育，结构清晰，而雌性性腺不对称发（图3-E2~F2）。通过此方法初步判定鸡胚性别分化期可能为胚胎孵化期第8天。

2.3 性腺组织学观察法鉴定鸡胚的性别分化期

如图4所示，在胚胎孵化期第6天，未观察到雌、雄性腺的特征结构（如图4-A~B）。在胚胎孵化期第7天，观察到雄性鸡胚性腺有类似于曲精细管的团索状结构出现（图4-C）；雌性鸡胚性腺开始出现皮质层（图4-D）。在胚胎孵化期第8天，雄性鸡胚性腺内部的团索状结构转变成曲细精管（如图4-E）；雌性鸡胚性腺的皮质层增厚，并出现了空腔结构（如图4-F）。在胚胎孵化期第9天，雄性鸡胚性腺内部的曲细精管形态明显，数量也有所增加（如图4-G）；雌性鸡胚性腺的皮质层继续增厚，空腔结构的数量和大小也有所增加（如图4-H）。通过此方法初步判定鸡胚性别分化期可能为胚胎孵化期第7天。

2.4 鸡胚性别分化期分子生物学的鉴定

如图5-A所示，在胚胎孵化期第1~3天，凝胶电泳均未出现扩增条带（图5-A）。在胚胎孵化期第4天，凝胶电泳出现两种扩增条带的结果；雄性个体只有1条扩增条带，其大小为550 bp左右；雌性个体有2条扩增条带，其大小为550 bp和450 bp左右。如图5-B所示，胚胎孵化期的第5~8天，凝胶电泳中均出现了可以识别雌雄的扩增条带（图5-B）。通过此方法初步判定鸡胚性别分化期可能为胚胎孵化期第4天。

3 讨论

3.1 胚线观察法

胚线观察是一种较为传统的检测方法，胚线是指受精卵在胚胎发育初期，绒毛膜和尿囊膜的膜层中间会形成丰富的血管网^［10］。早期唐剑林等^［7］在胚线鉴定性别之后，在鸡胚上分别注上公母标记后继续置于孵化器中孵化，全部出壳雌雄比例约为1.06∶1，而在自然情况下孵化雌雄比例约1∶1。王世军等^［11］利用墨汁灌注法使血管扩张后，观察到清晰的血管轮廓，并以鸡胚性腺检测结果对照，证明此法具有一定的准确性。基于此法汤勇等^［12-13］利用机器视觉图像采集系统观察胚线纹理鉴定的性别准确率高达83.3%。该技术操作简便、成本较低、对孵化影响较小，几乎不会影响鸡的孵化率和出雏率，但这项技术至今未能像翻肛鉴别法一样推广到生产中，其鉴别技术的标准性和稳定性还有待提高^［15-16］。

3.2 生殖腺器官形态观察法

生殖腺器官形态观察法常用于实验室鸡胚性别发育的鉴定。李碧春等^［14］研究发现，胚胎孵化期第6天性腺显示为卵巢和睾丸特征。也有一些报道在胚胎孵化期的6.5 d时，两性性腺在组织结构外观上的差异已经明确可见，此时在雄性性腺内部的髓质中已经开始形成曲细精管索；而在雌性性腺外侧的皮质层也开始增殖^［5］。王静嫄^［17］利用蛋白质组学的方法通过差异表达基因鉴定生殖腺器官观察准确性。由上研究可知，生殖腺器官形态观察法既能明显地观察到胚胎内的雌雄性腺差异，又能较准确地来判断胚胎性别，因此本试验采用了此方法来判断鸡胚的性别分化期。然而，现实中这种方法会导致胚胎提早死亡，无法顺利继续胚胎孵化，观察到性别分化的时间与其他方法相比较晚。

3.3 性腺组织学观察法

刘含^［9］曾采用组织形态学观察来鉴别雌雄性腺组织，发现腺发育后，雄性为两侧性腺均发育，但皮质层退化，髓质层增厚，其中含有多个曲精细管结构；而雌性形成不对称发育，仅左侧一边发育，右侧出现了退化并逐渐萎缩。游秀容等^［18］利用了这方法研究大黄鱼的性腺分化及发育规律，并得出大黄鱼的雌雄性腺分化开始于不同时期，大黄鱼55 d解剖学分化的开始；120 d细胞学分化的开始；95 d大黄鱼精巢的解剖学分化开始；215 d其精巢细胞学分化开始。李培伦等^［19］通过性腺组织学观察，2 d大麻哈鱼卵巢内含有3个时相的卵母细胞，而3 d卵巢内90%以上为第Ⅲ时相卵母细胞，此结果符合野生环境下大麻哈鱼一次性产卵特性。以上研究均证实了性腺组织学观察法的可行性、准确性和科学性，本试验通过性腺组织学观察法观察到雄性鸡胚性腺内部的团索状结构向曲细精管转变，雌性鸡胚性腺的皮质层增厚并且出现了空腔结构。并且此结论与刘含^［9］的结果基本一致。此法应用于生产上也会导致胚胎提早死亡，无法顺利继续胚胎孵化。

3.4 分子生物学鉴定法

PCR 性别鉴定分子学方法始于1991年，由Griffiths等^［20］所创，这一鉴定方法在2001年被Clinton 等所改进形成快速、简单的鉴定方法。与其他性别鉴定方法相比，分子生物学鉴定方法因采样量少，易于取材，不受样本发育的限制，操作简便等特点而具有明显的优越性^［21］，除此之外，更为重要的是通过双阳性结果来判断雌雄，排除了假阴性的可能性，确保了结果的可靠性^［22］。胡锐颖等^［23］对9个品种86只国家一级保护鸟类进行了PCR性别鉴定，其准确率高达99%。刘铸等^［24］运用CHD基因的一对引物2550 F和271成功对东方白鹳（Ciconia boyciana）进行了准确简便的性别鉴定，并对其序列结合其他5种远源鸟类相应序列进行分析，以上研究均证实了分子生物学鉴定法的科学和可信。本研究通过PCR方法通过凝胶电泳扩增条带出现2种结果，可以初步判断已经出现性别分化。这与刘含^［9］的结果一致，并验证了该引物的可行性。此法需要的仪器价格昂贵，引物设计相对复杂，并不适用于实际生产。

4 结论

分子生物学层面上，通过PCR方法在凝胶电泳图上发现两种不同结果的扩增条带判定鸡性别分化期为胚胎孵化期第3天；胚线发育程度上，通过观察鸡胚胚线分支形态判定鸡性别分化期为胚胎孵化期第3天；生殖腺器官形态学层面上，通过直接观察性腺形态结构判定鸡性别分化期为胚胎孵化期第8天；性腺组织学层面上，通过镜检HE染色的石蜡切片判定鸡性别分化期为胚胎孵化期第7天。综上，常规孵化条件下鸡性别分化期约在胚胎孵化期第3~8天。

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基金资助

大学生创新创业项目(X202210364028)

安徽省高校自然科学基金(KJ2021A0153)