Ⅱ型糖尿病模型小鼠粪便微生物多样性分析

Analysis of fecal microbial diversity in a type Ⅱ diabetes mouse model

摘要

目的 揭示粪便微生物对Ⅱ型糖尿病的作用以及影响。 方法 以SPF级BKS-DB雄性小鼠为T2DM模型，通过测定对照组（CN组）和模型组（T2DM组）粪便微生物16SrRNA基因分析其群落结构与组成。 结果 门水平上，发现T2DM模型组小鼠粪便中蝴蝶菌门、弯曲杆菌门菌群丰度显著高于CN组。属水平中，T2DM组发现16个特有菌属，其中丰度占比最大的是库特氏菌属。在差异显著的前10个菌属中，9个菌属T2DM组菌群丰度显著高于CN组（P<0.05），仅有1个菌群丰度显著低于CN组。通过LEfSe分析，发现厌氧菌属、棒状杆菌属在T2DM模型组出现富集，而这两种菌属都存在于免疫力低下的人群中，与糖尿病呈正相关存在。 结论 在T2DM模型小鼠的粪便中，蝴蝶菌门、拟杆菌属等菌群出现高表达现象，同时，厌氧菌属、棒状杆菌属也出现了失衡，这可能导致了机体免疫力降低，正向影响糖尿病的发生。

Abstract

Objective To elucidate the role and influence of fecal microorganisms on type Ⅱ diabetes mellitus(T2DM). Method In this study，SPF-grade BKS-DB male mice served as models for T2DM.The community structure and composition of fecal microbial 16S rRNA genes were analyzed in both the control group (CN group) and the T2DM model group (T2DM group). Result At the phylum level，the abundance of Patescibacteria and Campilobacterota in the feces of mice in the T2DM group was significantly higher than that in the CN group.At the genus level，16 endemic genera were identified in the T2DM group，with Kurthia being the most abundant.Among the top 10 genera with significant differences，the abundance of flora in 9 genera in the T2DM group was significantly higher than in the CN group (P<0.05)，while the abundance of microbiota in 1 genus in the T2DM group was significantly lower.LEfSe analysis revealed that the genera Anaerofustis and Corynebacterium were enriched in the T2DM group and are both associated with immunocompromised individuals，showing a positive correlation with diabetes. Conclusion In the feces of T2DM model mice，high expression of flora such as Patescibacteria and Bacteroidota was observed，along with an imbalance between the genera Anaerofustis and Corynebacterium.This imbalance may contribute to decreased immune function and positively influence the development of diabetes.

Graphical abstract

关键词

Ⅱ型糖尿病 / Ⅱ型糖尿病模型小鼠 / 粪便微生物

Key words

type 2 diabetes / model mice with type 2 diabetes / fecal microorganisms

Author summay

尚小龙，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种代谢性疾病，其特征是胰岛素分泌绝对或相对不足，靶向器官的胰岛素敏感性降低，进而导致脂肪、蛋白质、水和电解质代谢紊乱^［1］。目前，全球约有4.63亿成年人患有糖尿病，据国际糖尿病联盟预测，到2045年糖尿病患者人数将达到7亿^［2］。糖尿病引发的心肌缺血、糖尿病肾病、中风、足部溃疡、视网膜病变等并发症严重威胁人类的健康，给社会和家庭带来了沉重的负担^［3］，已经成为全球突出的社会问题，因此，了解糖尿病发病机制，找到新的治疗方法非常重要。

肠道菌群与糖尿病的关系是目前的研究热点。现代药理学研究表明，除遗传、环境和饮食因素外，肠道微生物在糖尿病发生发展过程中起着重要作用^［4］。肠道菌群是人体最大的微生态系统，对人体的物质和能量代谢有重大影响^［5-6］。肠道菌群紊乱导致短链脂肪酸（SCFAs）、胆汁酸、内分泌调节肽含量下降，脂多糖（LPS）含量上升，诱导胰岛素抵抗（IR），从而促进T2DM的发生^［7-8］。

然而，现有的研究仅揭示了部分菌群与糖尿病的关系，对造成T2DM特有的肠道微生物有待挖掘。本试验通过16sRNA方法，研究T2DM模型小鼠与正常小鼠的粪便微生物组成差异，找出新的诱发T2DM细菌，以期从微生物多样性变化角度揭示粪便微生物对糖尿病的作用以及影响，为肠道菌群调控T2DM的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

自杭州子源实验动物科技有限公司［SCXK（浙）2019-0004］选购24只8周龄SPF级BKS-DB雄性小鼠，其中T2DM小鼠、正常小鼠各12只，血糖值和体质量见表1。运送至上海实验动物研究中心，经检验合格后，在动物房进行饲养试验 ［SYXK（沪）2019-0004］。饲料为浙江大学试验动物研究中心生产的小鼠辐照专用颗粒饲料。饮用水为上海实验动物研究中心自制的灭菌水。

本试验经上海实验动物研究中心实验动物管理和伦理委员会审查批准（IACUC-AF-003-2022），所有动物试验操作符合试验动物福利和伦理原则，试验动物设施满足动物试验要求。

1.1.2 主要仪器与试剂

E.Z.N.A.®Soil DNA Kit DNA抽提试剂盒（美国Omega公司）；FastPfu Polymerase（北京全式金生物技术有限公司）；ABI GeneAmp®9700型PCR仪（美国ABI公司）；DYY-6C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；日立7180型全自动生化分析仪（日本株式会社日立高新科学系统），葡萄糖测定试剂盒（己糖激酶G-6-PHD法）（均由上海-富士胶片和光纯耀上海化学有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

在同一饲喂背景下，随机选取T2DM小鼠、正常小鼠各12只，每组设4个重复，每个重复3只小鼠，饲喂小鼠辐照饲料4周。

1.2.2 样品采集和测定

试验小鼠运输到动物房，适应1周后，进行空腹血糖检测鉴定（表1）。按摩小鼠腹部使其排便，使用无菌镊子从肛门口夹取一粒新鲜粪便（0.05 g，每天一次，连续取样1周）放入无菌冻存管中，迅速放入液氮速冻保存至-80℃冰箱后进行测序。待饲喂至第5周时，再次进行血糖检测、粪便取样。

1.2.3 样品DNA抽提和测序

根据E.Z.N.A.® soilDNA kit说明书进行微生物群落总基因组DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。以提取的DNA为模板，对16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增和DNA测序，上游引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和下游引物806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mm dNTPs 2 μL，上游引物（5 μm）0.8 μL，下游引物（5 μm）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA10 ng，补足至20 μL。扩增程序如下：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存（PCR仪：ABI GeneAmp® 9700 型）。扩增产物经凝胶电泳检测后送上海美吉生物医药科技有限公司，利用Illumina公司的NovaSeqPE250平台进行测序。

1.3 微生物多样性数据分析

使用Fastp、FLASH对双端原始测序序列进行质控、拼接^［9］，使用UPARSE对质控拼接后的序列进行操作分类单元OTU聚类并剔除嵌合体^［10-11］。利用RDP classifier比对16S rRNA基因数据库物种分类学注释^［12］，使用PICRUSt2进行16S功能预测分析^［13］。

2 结果与分析

2.1 微生物测序基础数据分析

本试验对小鼠粪便微生物16S rRNA的v3-v4区进行高通量测序分析，24份样品测序保留细菌得到320 888条有效序列，对原始序列进行质控拼接之后共获得226 808条优化序列，其CN组106 722条，T2DM组116 694条。进行降噪处理之后CN组分为8个门、10个纲、21个目、33个科、64个属、93个种和189个OTU，T2DM组分为7个门、8个纲、19个目、31个科、58个属、85个种和164个OTU。T2DM组相对于CN组各个生物学分类中微生物多样性均减少。物种稀释曲线逐渐趋于平稳（如图1），说明测序数据量渐进合理，继续加大测序量，可能不会产生较多的新物种数（OTUs）。

2.2 细菌群落多样性及丰富度分析

利用抽平序列计算细菌的多样性指数（Simpson）和丰度指数（Chao、ACE、Sobs），分析发现T2DM组的多样性指数和丰度指数普遍低于CN组（表2）。

2.3 门、属水平物种组成

2.3.1 门水平组间物种组成

在门水平中，检测到CN组和T2DM组9个门，菌群丰度占比大于1%的菌门为Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidota（拟杆菌门）、Actinobacteriota（放线菌门），其中厚壁菌门和拟杆菌门占总丰度的90%以上（图2-A）。与CN组相比，T2DM组厚壁菌门中丰度降低17.06%，拟杆菌门增加16.03%，放线杆菌门增加1.07%（图2-A，C~D）。在组间差异分析中发现Patescibacteria（蝴蝶菌门）、Campilobacterota（弯曲杆菌门）差异显著（P<0.05），T2DM组中蝴蝶菌门、弯曲杆菌门菌群丰度显著高于CN组（图2-B）。

2.3.2 门水平组内物种组成

在门水平中，CN1、CN2、T2DM1、T2DM2组中菌群丰度大于1%的菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门，其中厚壁菌门和拟杆菌门占总丰度的90%以上（图3-A~B）。与CN1组相比，CN2组中厚壁菌门、放线菌门丰度显著增加27.01%、2.06%（图3-A，C，E~F），拟杆菌门丰度显著降低28.97%（P<0.05）。与T2DM1组相比，T2DM2组中厚壁菌门、放线菌门丰度显著增加39.36%、2.02%（图3-B，D，G，H），拟杆菌门丰度显著降低40.64%（P<0.05）。

2.3.3 属水平组间物种组成

在属水平中，检测到130个菌属，其中CN组和T2DM组共有菌属属102个（图4-A）。CN组特有的菌属12个（图4-A，D），其中丰度排名前3的菌属是Pseudomonas（假单胞菌）、Eisenbergiella、Hydrogenoanaerobacterium。T2DM组特有菌属16个（图4-A，E），其中排名前三的菌属是Kurthia（库特氏菌属）、unclassified_f_Prevotellaceae、norank_f_norank_o_norank_c_noran-k_p_Firmicutes。在组间差异分析中取差异显著排名前10的菌属（图4-B~C），其中Bacteroides（拟杆菌属）、Helicobacter（幽门螺杆菌属）、Streptococcus（链球菌属）等9个菌属T2DM组菌群丰度显著高于CN组，余下的1个菌属Desulfovibrio（脱硫菌属）T2DM组菌群丰度显著低于CN组（图4-C）。

2.3.4 属水平组内物种组成

在属水平中，CN1、CN2、T2DM1、T2DM2组中菌群丰度大于1%，排名前5的优势菌门为：Lactobacillus（乳杆菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌）、norank_f__Muribacul-aceae、Aerococcus、Lachnoclostridium（乳酸梭菌属）、Enterorhabdus、norank_f__norank_o__Clostridia_UC G-014（图5-A~B）。

与CN1组相比，CN2组中Enterorhabdus、葡萄球菌显著增加1.46%、20.69%，norank_f__Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group菌群丰度显著降低23.53%、2.82%（P<0.05）（图5-A，C，E~F）。

与T2DM1组相比，T2DM2组中norank_f__Muribaculaceae菌群丰度显著降低28.95%（P<0.05）（图5-B，D，G，H）。

2.4 细菌类群LDA效应量（LEfSe）分析

使用LEfSe分析（LDA阈值为2）门、纲、目、科、属分类水平上CN组和T2DM组的关键微生物差异，共发现44个差异项（P<0.05），其中CN组有脱硫菌属、g_Eisenbergiella等7个富集项。T2DM组有37个富集项，排名前10的菌属分别为：拟杆菌属、g_Anaerofustis（厌氧菌属）、g__Helicobacter（幽门螺杆菌属）、g_Streptococcus（链球菌属）、g_Candidatus_Saccharimonas、g_Marvinbryantia、g_norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014、g_Prevotellaceae_N K3B31_group、g_Candidatus_Arthromitus、g_unclassified_f_Muribaculaceae、g_unclassified_f_Eggerthellaceae。

2.5 微生物功能富集预测

使用PICRUSt2进行分析，将基因信息与对应的KEGG功能数据库进行比对，获得每个样本中对应的微生物群落功能信息和丰度信息。发现T2DM组总体功能丰度低于CN组，代谢通路主要富集在代谢途径、次生代谢物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、氨基酸的生物合成、碳代谢、核糖体、ABC转运蛋白、嘌呤代谢、糖酵解/糖异生等方面（图7）。

3 讨论

微生物菌群失衡可能诱发糖尿病等疾病^［14］。但微生物菌群失衡是否直接导致T2DM的发生，还有待确定。本研究发现小鼠粪便微生物Alpha多样性指数T2DM组与CN组无显著差异，但在Shannon、Chao、ACE、Sobs指数上T2DM组菌群多样性明显低于CN组。Li Qian等人的研究表明T2DM患者肠道菌群多样性明显降低^［15］，这与本试验结果相一致。

在门水平组间差异分析中，与CN组相比，T2DM组中厚壁菌门丰度降低17.06%，拟杆菌门丰度增加16.03%。厚壁菌门中嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等益生菌对T2DM起到降低血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白等作用，而产丁酸菌、普拉氏梭杆菌等细菌导致产生的丁酸盐减少，使得炎性反应发生，对T2DM发生起到促进作用^［16-17］。拟杆菌门是一类革兰氏阴性、无芽孢、无动力的专性厌氧菌，有调节机体免疫和代谢的功能^［18］，是健康人群胃肠道的优势菌群^［19］。T2DM组中蝴蝶菌门、弯曲杆菌门菌群丰度显著高于CN组（P<0.05），蝴蝶菌门是一种神秘细菌门，人们对其在肠道中生理特性知之甚少，在地下土壤中参与氮、硫和铁循环的自养类菌群，通常是以发酵的生活方式驱动的，而不直接依赖于特定的宿主^［20］，有研究发现蝴蝶菌门在小鼠结肠炎中高表达，有可能是一种有害菌^［21］。另有研究发现小鼠肝炎模型中弯曲杆菌门丰度显著增加^［22］，据此推断弯曲杆菌门可能参与了炎症的发生，可能诱发T2DM。

在门水平组内差异分析中，与CN1组、T2DM1组相比，CN2组、T2DM2组厚壁菌门、放线菌门丰度显著增加，拟杆菌门丰度显著降低。其中厚壁菌门中部分益生菌群起到降低血糖作用，部分致病菌群又可能对糖尿病起到促进作用^［16-17］。放线菌门不仅可以加速纤维素、半纤维素和木质素的降解，还可以增加碳水化合物活性酶的活性^［23］。碳水化合物活性酶有助于将机体中的碳水化合物分解成易被肠道消化、吸收的单糖分子，有助于机体代谢平衡。拟杆菌门具有调节机体免疫和代谢的功能，拟杆菌门的减少还意味着丙酸的产量减少，而丙酸可以促进肠道糖异生，影响机体能量和葡萄糖稳定，因此拟杆菌门可能与糖尿病的发生密切相关^［24］。

在属水平组间差异分析中，T2DM组中特有菌属：库特氏菌属、unclassified_f_Prevotellaceae、norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_Firmicutes；其中库特氏菌属具有一定的致病性，对人临床表现为腹泻和局部发炎症状，在奶牛乳腺炎中也具有高表达^［25］。尿道炎患者的尿道中分离出来库特氏菌，且未检测到其它细菌的伴随感染，说明库特氏菌与炎症的发生密切相关^［26］；unclassified_f_Prevotellaceae菌属是一种从未被培养过的细菌，人们对其在肠道中生理作用了解较少，在T2DM研究中罕见报道，而在肝纤维化研究中发现unclassified_f_Prevotellaceae是一种有害菌属，可能促进肠道炎性反应^［27］。unclassified_f_Prevotellaceae在本试验T2DM组中发现，猜测可能促进T2DM的发生。norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_Firmicutes是厚壁菌门下的一个未知菌属，尚无相关研究报道证明其在肠道中的生理作用，需进一步研究。CN组中假单细胞菌具有巨大的分解代谢潜力，能够吸收碳水化合物、脂质、蛋白质、肽、氨基酸、脂肪酸、胺、醛、酮等物质，可以降解一些脂肪族胺^［28］，有助于人体的新陈代谢，在人体中发挥着积极作用。另外发现拟杆菌属、幽门螺杆菌属、链球菌属、unclassified_f_Prevotellaceae、norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_Firmicute等9个菌属T2DM组丰度显著高于CN组。在糖尿病患者与正常人群研究中发现拟杆菌属丰度显著降低^［29］，与本研究相一致。而拟杆菌属与其他菌群及宿主之间有着复杂的联系，是条件性的致病菌，拟杆菌属增加可能导致糖酵解能力降低从而导致挥发性脂肪酸减少，挥发性脂肪酸经过能量代谢途径或免疫途径破坏肠道屏障功，可能造成慢性炎症及胰岛素抵抗^［30-31］。幽门螺杆菌导致糖代谢障碍，进而引发高脂血症和全身脂质代谢紊乱^［32］，近年来有研究发现脂质代谢紊乱是糖尿病发生的重要因子^［33］。链球菌可引起毒素性疾病、化脓性疾病，也可引起肾盂肾炎、肾小球肾炎^［34］，糖尿病肾病的发生与炎症因子和炎症介质都密切相关^［35］。这些菌群在T2DM组富集可能引发炎症，炎症和代谢失调导致的菌群失衡会增加胰岛素抵抗并促进T2DM的发生^［36］。脱硫菌属菌群丰度T2DM组显著低于CN组，有研究表明脱硫菌属在健康人群中富集，有益于人们的健康^［37-38］，但也有研究表明脱硫菌属与疾病发生有关，引发炎症造成化脓性关节炎^［39］。因此，脱硫菌属在T2DM中的作用需进一步研究。

在属水平组内分析差异中，与CN1组相比，CN2组Enterorhabdus、葡萄球菌属菌群丰度显著增加；Lachnospiraceae_NK4A136_group 、norank_f_Muribaculaceae菌群丰度显著降低。与T2DM1组相比，T2DM2组norank_f_Muribaculaceae菌群丰度显著降低。有研究发现Enterorhabdus在自发性结肠炎小鼠模型中高表达，可能与促炎性反应密切相关^［40］，而对Enterorhabdus在T2DM中的研究少有报道，其作用机理有待进一步的验证。在糖尿病宿主相关研究中发现葡萄球菌损害宿主机体组织并引起疾病，且葡萄球菌在糖尿病患者中高表达^［41］。因此，推测葡萄球菌菌群丰度增加可能导致糖尿病患者病情加重。而在益生菌的相关研究中发现，Lachnospiraceae_NK4A136_group可以将植物多糖发酵成短链脂肪酸和乙醇^［42］，而短链脂肪酸具有调节血糖、调节免疫、改善肠道菌群平衡和肠道功能^［43］，因此，推测Lachnospiraceae_NK4A136_group对糖尿病治疗起到重要作用。也有研究发现norank_f_Muribaculaceae利于胆汁酸的分解，总胆汁酸池的调节也会影响血糖和胰岛素敏感性，且胆汁酸参与调节糖脂代谢，抑制氧化应激与炎症反应^［44］，对糖尿病的治疗起到积极作用。

使用LEfSe分析与T2DM密切相关的微生物菌属，其中厌氧菌属主要靠侵袭力和产生毒素引起疾病，当机体感染或者抵抗力下降时，菌群平衡破坏就会发生厌氧菌内源性感染，从而引发糖尿病等疾病^［45］。棒状杆菌属中以纹带棒状杆菌为代表，是一种条件性致病菌，在免疫力低下的人群中发生机率较高^［46］，免疫力低下会导致免疫球蛋白的增高。而有研究发现糖尿病患者比正常人群免疫球蛋白明显增高^［47］，与本研究一致。

在微生物预测分析中发现T2DM组中碳代谢、核糖体、ABC转运蛋白、嘌呤代谢、糖酵解等代谢丰度低于CN组。其中糖酵解之后产生乙酸、丙酸、丁酸等产生短链脂肪酸，短链脂肪酸具有抗炎、调节胰岛素与胰高血糖素分泌等作用^［48］。氨基酸和肽类主要是由链球菌属等几种肠道菌属进行微生物分解代谢^［49］。在脂质代谢中，一些酯类化合物参与革兰氏阴性细菌的形成，尤其是脂多糖与其受体结合是胰岛素抵抗的关键诱导剂，影响胰岛素的敏感性^［50-51］。这些微生物代谢可能引起肠道生态系统的变化进而引发炎症，改变肠道通透性，并调节胆汁酸、短链脂肪酸的代谢，这些代谢物协同作用于胰岛素抵抗的代谢调节系统，从而诱导糖尿病的发生^［52］。

4 结论

在组间差异分析中，蝴蝶菌门、弯曲杆菌门可能促进炎症的发生。在属水平中，库特氏菌属是T2DM独有菌属，也具有一定的促炎症反应，可能导致糖尿病的发生；拟杆菌属、幽门螺杆菌属、链球菌属等菌属也可能诱发炎症反应，对于糖尿病的发生有一定的促进性；而脱硫菌属在患病者和健康人群都存在，需要进一步研究其在T2DM中的作用；厌氧菌属、棒状杆菌属失衡导致机体免疫力降低，从而影响糖尿病的发生。

在组内差异分析中，门水平显著差异的菌群一致。厚壁菌门对糖尿病利弊参半，放线菌门有助于机体代谢平衡，拟杆菌门具有调节机体代谢的功能，从而影响葡萄糖稳定。属水平中，发现Lachnospiraceae_NK4A136_group、norank_f_Muribaculaceae具有调节血糖等作用，对糖尿病起到重要作用。与CN1、CN2组相比，T2DM1、T2DM2组差异菌群较少，表明试验期间T2DM模型差异较小。

综上所述，Ⅱ型糖尿病小鼠粪便微生物菌群失衡导致促微炎性反应，这为T2DM的研究提供理论依据，有利于建立开发基于微生物群的个性化干预措施以应对糖尿病等人类代谢性疾病。

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基金资助

州校合作项目(2020ZXND02)

科技创新人才计划(2020FA011)