基于ISSR标记的长瓣铁线莲杂交子代鉴定及遗传多样性分析

Identification and genetic diversity analysis of hybrid progeny of Clematis macropetala using ISSR markers

摘要

目的 准确快速确定长瓣铁线莲（Clematis macropetala）杂交子代真实性，缩短长瓣铁线莲新品种培育周期，并为铁线莲属植物杂交子代鉴定和新品种选育提供理论依据。 方法 利用12条ISSR引物对8个长瓣铁线莲杂交组合的30个子代进行鉴定，并对真杂种和亲本进行遗传多样性分析。 结果 30个子代共鉴定出29个真杂种，真杂种率为96.67%；29个真杂种及9个亲本PCR扩增共得到136条清晰条带，多态性条带比率达到99.26%；38个样本的等位基因数（Na）为1.992 6，有效等位基因数（Ne）为1.477 8，Nei’s基因多样性（H）为0.293 7，Shannon’s多样性信息指数（I）为0.453 1，表明38个样本具有较高的DNA多态性和丰富的遗传多样性；遗传相似系数矩阵表明，82.76%的真杂种与父本的亲缘关系较近。 结论 ISSR分子标记技术可准确快速鉴定长瓣铁线莲杂交子代真实性，长瓣铁线莲同一杂交组合后代间的遗传距离较近，真杂种发生了一定的遗传分化，整体与父本保持更近的亲缘关系。

Abstract

Objective This study was conducted to accurately and quickly determine the authenticity of the hybrid progeny of Clematis macropetala，to shorten the breeding time of new cultivars of C.macropetala，which is important for the early identification of the hybrid progeny and the breeding of new cultivars. Method In this study，30 progenies of 8 C.macropetala cross combinations were identified using 12 ISSR primers，and genetic diversity analysis was performed on the true hybrids and the parents. Result A total of 29 true hybrids were identified from 30 progenies，with a true hybrid rate of 96.67%.PCR amplification of the 29 true hybrids and 9 parents gave a total of 136 distinct bands，with a polymorphic band ratio of 99.26%.The average observed number of alleles （Na） was 1.992 6，the number of effective alleles （Ne） was 1.477 8，the genetic diversity of Nei （H） was 0.293 7 and Shannon's information index （I） was 0.453 1，indicating that 38 samples had rich genetic diversity.The genetic similarity coefficient matrix showed that 82.76% of the true hybrids were closely related to their male parents. Conclusion ISSR molecular marker technology can accurately and quickly identify the authenticity of hybrid progeny of C.macropetala.The genetic distance between progeny of the same cross combination is relatively close.Genetic differentiation has occurred in true hybrids and they have maintained a closer genetic relationship to their male parents.

Graphical abstract

关键词

长瓣铁线莲 / 杂交子代 / 分子鉴定 / 遗传多样性

Key words

Clematis macropetala / hybrid progeny / molecular identification / genetic diversity

Author summay

贾艳艳，硕士研究生。E-mial：[e-mail]

铁线莲属（Clematis L.）植物多为多年生木质或草质藤本，或为直立灌木或草本，其花型丰富，花色众多，具有较强的观赏性和适应性，同时还兼具一定药用价值^［1］。铁线莲属植物在西方和日本园林中占有极其重要地位，被广泛应用于植物园、公园和家庭花园的装饰绿化^［3］。我国具有丰富的铁线莲属资源，但资源开发和新品种培育工作相对落后。长瓣铁线莲（C.macropetala）原产于我国中北部及与蒙古和俄罗斯临近地区，为攀援木质藤本花卉，花形奇特，呈钟状到碗状，瓣化雄蕊众多，花色蓝紫色于自然界中较为罕见，具有极高的观赏价值。长瓣铁线莲新品种培育是众多铁线莲学者研究的热点之一，杂交育种是各国育种家培育长瓣铁线莲新品种的重要方法^［4］。长瓣铁线莲结实率低、培育周期较长，从播种到开花需2~3年时间，自然状态下野生种结实率低至20%左右，杂交种子结实率更低。长瓣铁线莲野生种和品种花粉数量质量参差，花期分散，增加了杂交育种难度。此外，铁线莲杂交子代实生苗中存在一定比例的自交子代^［5］。因此，对长瓣铁线莲杂交子代进行早期杂种真实性鉴定至关重要，可有效提高长瓣铁线莲新品种培育效率，避免不必要的人力物力浪费。

确定杂交子代真实性在遗传育种中至关重要^［6］，常用手段有形态，染色体，同工酶和分子鉴定^［7］。但形态，染色体，同工酶鉴定可用鉴定标记较少，结果易受材料、环境等因素影响，单一的鉴定结果可靠性差，常需与其他的鉴定方法相结合^［8］。相比较而言，分子标记鉴定杂种具有快速、有效、灵敏度高的优点，可客观地反映供试材料在DNA分子水平上的真实差异^［9］。使用分子标记对杂种进行鉴定取样量小，适宜在选育种过程中，特别是在早期阶段筛选真杂种。目前，已有多种植物成功通过分子标记快速、有效地进行了杂种鉴定，如观赏百合（Llilium spp.）^［10］、菊花（Chrysanthemum spp.）^［11］、梅花（Prunus mume）^［12］、紫薇（Lagerstroemia spp.）^［13］等，常用方法有RAPD、SRAP、SSR、ISSR、和ITS序列等^［14］。

与其他分子标记方法相比较，ISSR分子标记方法具有更高的多态性、重复性和可靠性，以及操作简单等优点，被广泛应用于植物分子标记研究^［15］。王毅等^［16］在47个枇杷（Eriobotrya japonica）杂种后代中利用ISSR分子标记法鉴定出35个真杂种，为枇杷育种开发了一种新的远缘杂交方法。孙晓梅等^［17］利用ISSR分子标记研究芍药属（Paeonia L.）植物杂交亲和性，并确定了2个子代为芍药（Paeonial actiflora）和牡丹（Paeonia suffruticosa）的远缘杂交子代，两个子代均属偏母型。胡凤荣等^［18］利用3条ISSR引物在风信子（Hyacinth spp.）3个杂交组合的杂种后代中共鉴定出33个真杂种，确定了ISSR分子标记方法可以用于风信子杂种后代真实性的鉴定。

本试验利用12条ISSR引物对长瓣铁线莲8个杂交组合的30个子代进行鉴定，以确定杂交子代的真实性，缩短长瓣铁线莲新品种培育周期，期望为铁线莲属植物杂种后代快速鉴定、提高育种效率提供理论依据；对真杂种及亲本进行遗传多样性分析，明确真杂种间，子代与亲本的亲缘关系远近，以探究真杂种遗传性状的偏向性，可加速选育效率，降低育种成本。

1 材料与方法

1.1 材料

以引种自阜平野外的长瓣铁线莲（编号CL-MP01-CL-MP43）及长瓣铁线莲品种粉色之梦（Pink Dream）、粉红火烈鸟（Pink Flamingos）、梅德威尔（Maidwell Hall）、琥珀（Amber）为亲本材料，设计杂交组合，详细信息见表1。杂交获得的子代实生苗长至10 cm高时取0.2 g叶片提取DNA，亲本取0.5 g叶片提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及ISSR引物PCR扩增

利用试剂盒法（CW0531S，康为世纪）对亲本及杂交子代共42份材料提取DNA，DNA母液检测方法参考和文志［19］等，将合格DNA母液浓度稀释成40 ng/μL的工作液，引物浓度稀释成10 μmol/L。

参照王鑫等^［20］等筛选出的12条引物及退火温度进行试验。ISSR-PCR 反应体系为25.0 μL，具体包括：1.0 μLDNA工作液、2.0 μL 引物、12 μL 2×Es Taq Master Mix、10 μL dd H₂O。ISSR-PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s；最适退火温度下退火1 min；72 ℃延伸1 min；36个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.2 杂交子代鉴定标准

利用12条多态性引物，对杂交亲本进行PCR扩增，筛选出不同杂交组合中，产生父本特异性条带的引物。参考周宁宁等^［21］和胡文舜^［22］的判定标准，具有父本特异性条带的子代为真杂交种，为提高鉴定结果准确性，要求被两条及两条以上引物鉴定为真的子代为真杂种。

1.3 数据处理

依据人工读带原则，同一引物扩增出来的条带，在同一位置上出现清晰无拖带条带记为“1”，无条带记为“0”，建立0、1矩阵。对比亲本和杂交子代的条带有无，判断鉴定结果。使用POPGENE软件计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon’s信息指数（I）、Nei’s基因多样性（H）等指标。利用NTsys软件计算所有真杂种及亲本的遗传相似系数，使用UPGMA法绘制聚类分析图，构建真杂种F1代及亲本的遗传关系树状图，分析杂交子代与亲本的遗传关系。

2 结果与分析

2.1 ISSR标记特异性条带鉴定

利用12条引物对8个亲本进行ISSR扩增，条带统计结果见表2，不同杂交组合筛选出具有父本特异性条带的引物7~10条不等，但每个组合具有的父本特异性标记位点均在15个以上。

图1为杂交组合CL-MP32×梅德威尔亲本间ISSR引物的多态性条带电泳图谱，图1显示，12条引物可用于长瓣铁线莲杂交子代真实性鉴定，其中10条引物即U815、U824、U834、U835、U836、U840、U841、U843、U845、U899具有父本特异性标记条带。

2.2 杂交子代的ISSR鉴定

由表3可知，8个杂交组合得到的30个杂交子代经鉴定有29个子代被确定为真杂种，杂交组合粉红火烈鸟（Pink Flamingos）×CL-MP12的唯一1个子代为假杂种。图2为具有父本特异性标记的8个引物对杂交组合CL-MP18×梅德威尔（Maidwell Hall）的子代X₃-3的鉴定结果，引物U815，U824，U835，U843均有两条以上父本特异性标记作为鉴定依据，而引物U815、U836、U843仅有一条父本特异性标记，为确保鉴定结果真可靠，确定引物U815，U824，U835，U843为鉴定子代X₃-3真实性的引物，其他子代鉴定同理。由表4可知，同一真杂种在不同引物的作用下，与亲本相比会出现不同数量、不同位置的新增带，真杂种出现了遗传分化。

2.3 亲本及杂交子代遗传多样性分析

利用12条引物对父母本及29个子代真杂种共38个样本进行PCR扩增，结果显示，12条引物共扩增出136条清晰条带，其中特异性条带135条，每个引物平均扩增出11.33个条带，平均特异性位点11.25个，多态性比率达到99.26%。单条引物可扩增出9~14条数量不等的条带，扩增条带片段大小为200~2 000 bp。利用POPGENE分析38份样本DNA多样性，长瓣铁线莲亲本及29个真杂种等位基因数（Na）为1.992 6，有效等位基因数（Ne）为1.477 8，Nei’s基因多样性（H）为0.293 7，Shannon’s多样性信息指数（I）为0.453 1，表明38个样本具有较高的DNA多态性和丰富的遗传多样性。

利用12条引物扩增出来的136个条带构建0、1矩阵，导入Ntsys建立38个样本遗传相似系数矩阵，38个样本的遗传相似系数在0.152 9~0.737 7之间，表5为遗传相似系数矩阵中截取的29个真杂种与父母本的遗传相似系数。由表5可知，有5个真杂种与母本的遗传相似系数大于与父本的遗传相似系数，其余24个真杂种与父本的遗传相似系数大于与母本的遗传相似系数，可知，82.76%真杂种与父本的亲缘关系较近，相同亲本的真杂种间遗传相似系数存在一定差距，但遗传相似系数都在0.500 0上下浮动。

38个样本的UPGMA法的聚类结果表明（图4），在相似系数为0.39处，可将38个样本划分5大类，梅德威尔与野生种的全部真杂种与野生种CL-MP20，CL-MP09号被划分为第一类，CL-MP13与琥珀的两个子代及琥珀被划分为第二类，CL-MP13号被划分为第三类，CL-MP18，CL-MP30，梅德威尔及所有野生种与梅德威尔的真杂种被划分为第四类，粉色之梦及粉色之梦与CL-MP18的全部真杂种被划分为第五类。综合来看，同一杂交组合后代间的遗传距离较近，都分别优先聚在一起，10.34%的子代与母划分为一类、10.34%的子代同时与父本和母本划分为一类，79.31%的子代与父本划分为一类，可见真杂种与父本的遗传距离较近。

3 讨论

杂交育种能将两个或两个以上具有优良性状的亲本进行杂交，创造新变异，是创造优良性状新品种的重要手段^［23］。本试验成功将我国河北阜平地区的野生长瓣铁线莲与长瓣铁线莲品种进行杂交，旨在选育兼具二者优良性状，且适宜我国栽培的铁线莲新品种。对具有生长周期长，杂交成功困难，价格珍贵等特点的植物进行早期杂交子代鉴定，确定杂交子代真实性，并预测其遗传性状的偏向性，可加速选育效率，降低育种成本，避免不必要的资源浪费^［24］。本试验通过ISSR分子标记成功且快速鉴定了29个长瓣铁线莲真杂种后代，遗传相似系数矩阵表明，82.76%真杂种与父本的亲缘关系较近，相同亲本的真杂种间遗传相似系数存在一定差距；38个样本的UPGMA法的聚类结果表明同一杂交组合后代间的遗传距离较近，都分别优先聚在一起，79.31%的子代与父本被划分为一类，可见真杂种与父本的遗传距离较近。后期对真杂种继续培养并观测表型性状，确定子代表型性状的偏向性，选育具有优良性状新种质，并对相关位点的分子标记进行深入研究。

本研究采用的12条多态性良好的ISSR引物对29个真杂种及亲本共38个样本进行PCR扩增，共扩增出136条清晰条带，多态性条带比率达到99.26%，扩增产物显示，绝大多数真杂种PCR条带与双亲条带表现出互补性，但仍出现了相当数量的新扩增条带，即亲本均未出现的条带，吴学蔚^［24］等在进行百合（Lilium oriental hybird）杂交子代鉴定时同样出现了该情况，可能是由于亲本长瓣铁线莲品种具有高度杂合性，配子形成过程中染色体的不等价交换产生了新片段，导致子一代发生遗传分化；此外，子一代中同样出现了亲本条带缺失的情况，陈琼等^［25］认为是由于配子形成过程中染色体的交换及DNA分子碱基修饰引起的突变造成位点丢失。田彦挺等^［26］利用SRAP法对窄冠型杨树杂交子代进行鉴定，与本试验的相同点是，不同引物对同一杂交子代扩增出不同的父本特异性条带，这是由于不同引物表现为不同的DNA聚合酶结合位点。每个真杂种均有两条及两条以上父本特异性条带作为鉴定依据，鉴定结果真实可靠。前人利用分子标记方法进行子代鉴定时多采取单一方法，Liu等^［27］认为同时应用多种标记鉴定比单一标记鉴定结果更准确可靠，为确保鉴定结果准确性，后期可采用RAPD，SSR等分子标记方法进行佐证。本试验结果表明ISSR分子标记技术可作为鉴定长瓣铁线莲杂交子代真实性的有效手段。

此外，本研究发现，阜平长瓣铁线莲野生种和长瓣铁线莲品种间具有较高的遗传多样性，种群的遗传多样性决定了一个种群是否能够适应复杂环境^［28］。Hu等^［29］发现杏（Prunus armeniaca L.）的野生种群间具有较高的遗传多样性水平，群体内遗传分化水平较高，群体间遗传分化水平较低。张恒庆等^［30］在研究野生和栽培丁香（Syringa oblata）的遗传多样性时发现，野生种群比栽培种群表现出更高的遗传多样性。本试验中，同一居群不同个体的扩增条带存在一定差异，遗传相似系数在0.256 4~0.479 5之间，表明长瓣铁线莲野生种群内存在一定的遗传多样性。对比王鑫等^［20］的研究结果发现，引物U824对河北易县野生的长瓣铁线莲PCR扩增电泳图谱与本研究的扩增图谱存在差异，这可能是由于材料来源不同造成的，长瓣铁线莲野生居群间同样可能存在遗传多样性。广泛地调查、收集我国野生长瓣铁线莲资源，并筛选其中具有开发潜力的种质，有利于培育优良的长瓣铁线莲品种，扩充目前用于的栽培长瓣铁线莲的基因库。

4 结论

本试验通过ISSR分子标记技术在长瓣铁线莲8个杂交组合的30个子代中鉴定出了29个真杂种，ISSR分子标记技术可准确快速鉴定长瓣铁线莲杂交子代真实性，长瓣铁线莲同一杂交组合后代间的遗传距离较近，真杂种发生了一定的遗传分化，整体与父本保持更近的亲缘关系。

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基金资助

河北省铁线莲属植物种质资源收集与新种质创制项目(20326339D)