不同砧木对梅花椒果皮中挥发性物质的影响

Effects of different rootstocks on volatile components in fruit pericarp of Meihuajiao Zanthoxylum bungeanum

摘要

目的 探究不同砧木对梅花椒果皮中挥发性物质的影响，以期为梅花椒优良砧木的选择提供一定参考。 方法 以梅花椒3种砧穗组合：梅花椒/川陕花椒、梅花椒/七月椒、梅花椒/八月椒为材料，分别记为YJ、QJ、BJ。同时将实生繁育梅花椒作为对照（MJ）。采用固相微萃取结合气相色谱质谱联用仪的方法，分别比较了3 种砧穗组合与对照果皮中挥发性物质。 结果 4个品种的花椒果皮中共检测出10类210种挥发性物质，主要包括萜类、酯类、酮类、杂环化合物、烃类等。与对照相比，3种砧穗组（YJ、QJ、BJ）分别有4种、9种、9种差异挥发性物质。从特有差异挥发性物质方面来看：YJ更加接近对照材料；QJ中酯类物质积累更多；BJ中萜类物质含量提升。 结论 七月椒和八月椒作为砧木在提升梅花椒香气中有促进作用，可作为梅花椒嫁接时的优良砧木。

Abstract

Objective In order to provide the reference for the selection of rootstocks of Meihuajiao Zanthoxylum bungeanum，the study explored the effect of different rootstocks on volatile components in the pericarp of Z.bungeanum. Method Three kinds of scion/rootstock combinations，i.e.，Meihuajiao/Chuanshanhuajiao，Meihuajiao/Qiyuejiao and Meihaujiao/Bayuejiao，were used as the materials，which were denoted as YJ，QJ，and BJ，respectively，with the seedling of Meihuajiao as the control (MJ).The volatile components in the pericarp of different treatments were determined by using solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry. Result There were 10 categories of 210 volatile components detected in the pericarp of four varieties of Z.bungeanum，including terpenoids，esters，ketones，heterocyclic components，hydrocarbons，etc.Compared with the control，there were 4，9 and 9 different volatile components in three kinds of scion/rootstock combinations (YJ、QJ、BJ)，respectively.From the perspective of specific-differential volatile components，YJ was much closer to the control material.More esters were accumulated in QJ，and the content of terpenoids was increased in BJ. Conclusion The materials Qiyuejiao and Bayuejiao had a positive effect in enhancing the aroma of Meihuajiao Z.bungeanum，which therefore could be used as the ideal rootstocks for the grafting of Meihuajiao Z.bungeanum.

Graphical abstract

关键词

梅花椒 / 砧木 / 挥发性物质 / 气相色谱-质谱法

Key words

Meihuajiao Zanthoxylum bungeanum / rootstock / volatile components / GC⁃MS

Author summay

张春回，硕士，助理工程师，主要从事花椒栽培及良种选育。E-mail：[e-mail]

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim），落叶小乔木或灌木，芸香科（Rutaceae）重要的经济树种之一，在我国的种植历史可追溯到2000年前，主要产区集中在陕西、四川、甘肃等地^［1-2］。花椒果皮具有独特的香味和麻味，既能在烹饪中作为调味品，也能作为中药材在中医中使用，是典型的药食同源植物^［3］。其能作为典型的药食同源植物主要得益于花椒果皮中富含多种挥发性物质，主要为烯烃类、醇类、醛类、酮类和酯类等物质^［4］。这些挥发性物质的组成和含量受到花椒自身因素（品种）和环境因素（地理、土壤、光照等）的影响会产生一定的差异，这种差异导致其在应用价值、价格上差别较大^［5］。

顶空固相微萃取技术是基于固相萃取技术开发的一种样品前处理技术，该技术相较于传统的样品处理技术具有灵敏度高、操作简单、所需样品量少、成本低等优势^［6］。通过与气质联用仪相结合，已成为分析挥发性物质的常用方法，被广泛应用于花椒^［7］、玫瑰^［8］、苦荞^［9］等的挥发性物质分析中。

受花椒生殖方式为孢子体无融合生殖的制约，嫁接作为花椒常见的人工繁殖方法之一，可使花椒的产量及品质得到提升，并有助于花椒更好地适应环境，被广泛应用于花椒良种选育^［10］。嫁接技术通过改换根系影响接穗部分挥发性物质的含量和组成，从而影响了果实的品质^［11］。优良的砧木不仅能有效提高植株的抗逆性和产量，而且对果实风味品质的改善有帮助^［12-13］，因此可以通过对果实风味品质分析来选择优良砧木。近年来，花椒中挥发性物质的研究主要集中在产地溯源^［14-15］、种间^［16］和种内^［17］差异分析、挥发油分析^［18］等方面。截至目前，不同砧木对花椒果皮中挥发性物质的影响鲜有报道。本研究拟采用顶空固相微萃取－气质联用技术，以梅花椒为接穗，以川陕花椒、七月椒和八月椒为砧木材料，探讨不同砧木材料对梅花椒果皮挥发性物质的影响，以期为梅花椒的砧木选择提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试花椒果皮样品采自以川陕花椒、七月椒和八月椒为砧木（表1），陇南当地优良品种梅花椒为接穗的嫁接花椒，分别记为YJ、QJ、BJ；以实生繁育的梅花椒作为对照，记为MJ。于2021年7月果实成熟后，每个品种各选5株生长健康、长势及坐果基本一致的植株，分别采集果皮后将其混合，再将每个品种果皮均匀分为3份（3次重复），用于后续检测。

氯化钠（分析纯）来自国药公司；正己烷（色谱纯）来自Merck公司；标准品（色谱纯）来自Sigma公司，由正己烷配置而成，在-20℃下保存。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

将样品研磨成粉末状，称取1g样品置于顶空瓶中，加入饱和NaCl溶液和10 μL内标溶液（50 μg/mL），放入固相微萃取装置，在100 ℃恒温条件下，顶空萃取15 min，于250 ℃下解析5 min，然后进行GC-MS分离鉴定。

1.2.2 GC-MS分析

数据采集仪器：通过气相色谱-质谱联用仪（Agilent 8890-5977B）进行色谱质谱采集。

气相和质谱条件：参考GC-MS检测相关文献的方法，并对具体参数稍作调整。

定性和定量：基于自建数据库MWGC （武汉迈特维尔生物科技有限公司），对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。用MassHunter定量软件处理样本下机质谱文件，选择定量离子进行色谱峰的积分和校正工作，增强定量的准确性。

1.3 数据统计与分析

分别将YJ、QJ、BJ中挥发性物质与对照MJ进行两两比较，记为MJ_vs_YJ、MJ_vs_QJ、MJ_vs_BJ。首先，利用R3.6.1及相关数据包（ropls）进行主成分分析、层次聚类分析和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），用来初步确定不同品种组间的总体代谢特征和组内的变异性。其次，根据 OPLS-DA 模型的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值≥1.0 和差异倍数（Fold change，FC）值≥2.0（上调）或≤0.5（下调）筛选组间差异代谢物，代谢物含量差异是否显著则用t-检验（P<0.05）来评估^［19］。

2 结果与分析

2.1 花椒果皮挥发性物质

从4个品种的花椒果皮中共检测出210种挥发性物质（表2），主要包括萜类、酯类、酮类、杂环化合物、烃类等10类物质。4个品种中萜类、酯类、酮类、杂环化合物4类物质的含量之和均占其总含量的90%以上。其中萜类70种（47.68%~53.55%），酯类52种（23.68%~28.00%），酮类17种（6.12%~7.27%），杂环化合物16种（7.98%~9.64%）。

2.2 主成分分析和层次聚类分析

对4个品种的花椒果皮中的挥发性物质进行主成分分析（图1-A），结果显示：各品种组内样本均较为聚集，说明组内重复性和稳定性较好。YJ、QJ、BJ与MJ相比，组间存在明显的分离趋势，说明不同品种间存在差异。层次聚类分析（图1-B）表明：BJ和MJ聚为一类，YJ和QJ聚为一类，说明它们之间的挥发性物质的种类和含量较为相近。将主成分分析和层次聚类分析结合来看，4个品种的花椒果皮中的挥发性物质具有不同的代谢特征。

2.3 差异挥发性物质筛选

OPLS-DA可以使组间区分最大化，有利于寻找差异挥发性物质。分别对MJ_vs_YJ 、MJ_vs_QJ和MJ_vs_BJ组合进行OPLS-DA 模型验证（表3），3个分组的模型预测能力Q²均大于0.9，说明该模型预测度优良。差异挥发性物质筛选结果显示（表4），MJ_vs_YJ 有4种差异挥发性物质，均为上调；MJ_vs_QJ 有9种差异挥发性物质，其中上调7种，下调2种；MJ_vs_BJ 有9种差异挥发性物质，其中上调7种，下调2种。与MJ相比，差异挥发性物质的数量表现为QJ = BJ＞YJ。

2.4 差异挥发性物质分析

2.4.1 共有差异挥发性物质

从韦恩图中可以看出（图2-A），MJ_vs_YJ、MJ_vs_QJ和MJ_vs_BJ 3个分组间存在1种共有差异挥发性物质：己醛。其在BJ中的相对含量最高（图2-B），为MJ的14倍；在YJ、QJ中的相对含量较为相近，为MJ中的5~6倍。己醛属于C₆醛类化合物，气味特征为青草味，在苹果挥发性物质研究也有报道^［20］。

2.4.2 特有差异挥发性物质

根据韦恩图可知（图2-A），特有差异挥发性物质在MJ_vs_BJ最多（7种），MJ_vs_QJ次之（5种），MJ_vs_YJ最少（1种）。MJ_vs_YJ中仅存在1种特有挥发性物质（表5），2，6-双（1，1-二甲基乙基）-2，5-环己二烯-1，4-二酮，为酮类物质。在MJ_vs_YJ中上调表达，为MJ的6.5倍。MJ_vs_QJ中的特有差异挥发性物质（表6）主要包括3种酯类、1种酮类、1种杂环化合物，其中酯类（甲酸异冰片酯、4-甲基-3-戊烯酸甲酯、苯丙酸甲酯）和酮类（4，6-二甲基-2，7-壬二烯-5-酮）含量显著上升（P<0.05），为MJ的2倍；而杂环化合物（N，N-二丁基-2-（2-硫代苯基）-乙胺）的含量显著下降（P<0.05），且仅为MJ的2/5。MJ_vs_BJ的特有差异挥发性物质（表7）以萜类（4种）为主，还有酯类 （1种）、醇类（1种）、杂环化合物（1种），其中萜类（1-（（（1S，3aR，4R，7S，7aS）-4-羟基-7-异丙基-4-甲基八氢-1H-茚满-1-基）乙酮、CIS-橙花叔醇、（1R，3E，7E，11R）-1，5，5，8-四甲基-12-氧杂双环［9.1.0］十二烷基-3，7-二烯、8-异丙基-2，5-二甲基四氢萘）含量显著上升（P<0.05），为MJ的2~2.5倍左右；酯类（十六酸甲酯）和醇类（2-甲基丙基醚-（2-氟苯基）甲醇）同样在MJ_vs_BJ中上调表达，为MJ的2~3倍；杂环类化合物（双（η--5-哌啶基环戊二烯基）钴）的含量显著下降（P<0.05），为MJ的1/2。

3 讨论

挥发性物质是果实品质的重要组成部分，而果实品质又是农产品的重要评价指标，所以挥发性物质与农产品的经济效益密切相关^［21］。本研究从4个品种的花椒果皮中共检测出210种挥发性物质，主要包括萜类、酯类、酮类、杂环化合物、烃类等10类物质。与实生对照相比，3种不同砧木“梅花椒”果皮中各类挥发性物质的差异主要体现在萜类、酯类和酮类等与香气密切相关的化合物方面，该结果与在不同砧木“美早”大樱桃果实中发现的主要挥发性物质相近^［22］。

花椒香味物质的研究对花椒的质量分级、优质优价、定向应用等具有重要意义^［17］。花椒香味含量与花椒遗传背景有关^［23］。萜类、酯类和酮类物质是本研究中不同砧木嫁接梅花椒与对照相比有显著差异的重要组分。萜类物质是植物中结构最多样、含量最丰富的次生代谢产物之一，目前已发现5万多个萜类化合物^［24］。萜类物质影响水果的风味特征和品质，是水果香气的主要成分。草莓有丰富的香气成分，其中反式橙花醇的释放水平就特别高^［25］。酯类物质在水果香气中是含量最多的物质，它是果实香气的内在体现，不同种类果实的酯类物质组分不尽相同，使得果实呈现出多种多样的香味，菠萝的挥发性香气主要有42种酯类物质所贡献^［26］。酮类物质根据C数的多少分为低级酮和高级酮，其中低级酮具有令人愉快的香味。酮类物质化学性质活泼，可还原成醇^［27］。虽然在4个品种花椒中含量较少，但也是花椒挥发性物质的重要构成部分，对于果皮香气的保持具有积极作用。张正武等^［28］利用电子鼻技术对陇南34个花椒品种进行区分时发现，嫁接梅花椒果实香味含量最高，其次是八月椒、川陕花椒等，这与本研究结果一致。此外，萜类物质广泛应用于医学，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗肿瘤活性^［29］。酯类除了提供香气外，番茄、杏等果实的酯类还能增强对病菌的抗性^［30］。因此不同砧木对梅花椒果皮的影响还需要从药理和抗性角度进一步研究。

花椒麻味物质是以山椒素为代表的一类链状不饱和脂肪酸酰胺^［31］，其作为花椒特有的辛麻味成分，是花椒品质鉴定的重要指标之一，具有麻醉、兴奋、抑菌、祛风除湿、杀虫和镇痛等功效^［32］。花椒中所含酰胺的种类和含量，不仅受花椒品种影响，也受生长部位和生长期的影响^［33］。朱建朝等^［34］对陇南9个品种花椒麻味物质的含量进行测定后发现，梅花椒和七月椒差异不显著，本研究中显著差异物质中也未见麻味物质。

4 结论

本研究中不同砧木对梅花椒果皮挥发性物质有显著的影响，分别将YJ、QJ、BJ中挥发性物质与对照MJ进行两两比较，从特有差异挥发性物质方面来看：YJ更加接近对照材料；QJ中酯类物质积累更多；BJ中萜类物质含量提升。综上所述，七月椒和八月椒作为砧木在提升梅花椒香气中有促进作用，可作为梅花椒嫁接时的优良砧木。

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基金资助

甘肃省科技计划项目(20YF8NK161)

陇南市社会化出资科技计划项目（2022- S·SZ-06）

陇南市其他科技项目（2022-S·QKJ-03）

陇原青年创新创业人才个人项目(2021LQGR42)