超声辅助提取火棘干果的总黄酮及其体外抗氧化作用

Ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from dried Pyracantha fortuneana fruit and in vitro evaluation of their antioxidant activity

摘要

目的 为优化火棘干果总黄酮超声辅助提取工艺条件，掌握其抗氧化活性。 方法 在单因素试验的基础上，采用正交试验设计研究了料液比、乙醇浓度、超声功率和时间对总黄酮提取率的影响，并对总黄酮清除·DPPH自由基、ABTS⁺ 自由基、·OH自由基和NO₂^-能力进行了测定。 结果 火棘干果总黄酮的最佳提取条件为料液比1∶30 g∶mL、乙醇浓度60%、超声功率720 W、超声时间40 min，在此条件下，火棘干果总黄酮提取率为2.96%；10 mg/mL浓度下对·DPPH自由基、ABTS⁺ 自由基、·OH自由基和NO₂^-清除率分别为85.26%、84%、64.8%、87%，相同浓度下清除效果略低于芦丁、山奈酚和VC标准品。 结论 研究结果为火棘干果总黄酮的提取及利用提供了参考。

Abstract

Objective This study aimed to optimize the ultrasonic extraction conditions for total flavonoids from dried Pyracantha fortuneana (TFDPF) and to evaluate its antioxidant activity. Method Following initial single-factor experiments，the effects of solid-to-liquid ratio，ethanol concentration，ultrasonic power，and ultrasonic time on the yield of TFDPF were investigated.An orthogonal experimental design was employed to refine the ultrasonic extraction parameters for TFDPF.The antioxidant capacity of TFDPF was assessed by measuring its scavenging ability against DPPH，ABTS⁺，hydroxyl (·OH) radicals，and NO₂^-. Result The optimal ultrasonic extraction conditions were identified as a solid-to-liquid ratio of 1∶30 g∶mL，an ethanol concentration of 60%，an ultrasonic power of 720 W，and an ultrasonic duration of 40 minutes.Under these conditions，the TFDPF yield was approximately 2.96%.Antioxidant assays revealed that TFDPF exhibited scavenging rates of 85.26%，84%，64.8%，and 87% against DPPH，ABTS⁺，hydroxyl (·OH) radicals，and NO₂^-，respectively，at a concentration of 10 mg/mL. Conclusion The findings of this study establish a basis for the extraction and potential utilization of Pyracantha fortuneana.

Graphical abstract

关键词

火棘干果 / 总黄酮 / 超声辅助提取 / 抗氧化活性

Key words

Dried Pyracantha fortuneana / total flavonoids / ultrasonic-assisted extraction process / antioxidant activity

Author summay

刘威良，讲师，博士，主要从事植物基功能食品药品研发。E-mail：[e-mail]

火棘［Pyracantha fortuneana（Maxim.） Li］作为云南一种特色药食同源植物，为蔷薇科火棘属的常绿小灌木，生长于海拔200~2 800 m的丘陵、山地、灌丛草地和河沟旁，以野生为主，资源丰富 ^［1］。火棘浑身是宝，火棘果为火棘的成熟果实，又名赤阳子、火把果、救军粮等，相关研究表明云南和贵州两地鲜果年产量均在2.5万kg以上^［1］，据《农部琐录》记载早在1 700年前的三国时代就以火棘果代粮食用。《滇南本草》《云南中草药》等古籍记载火棘具有极高的药用保健功效，如清热解毒、健脾消积、生津止渴等，其根、茎、叶、花、果等部位均可入药^［2］。

火棘果富含18种人体必需氨基酸（含量达1.658 g/100 g）、多种维生素（VB₁、VB₂、VE和VC，其中VC含量颇高达36.32 mg/100 g）、矿物质、脂肪（约含4.7%）和膳食纤维等营养物质^［3-5］。对火棘果化学成分国内外学者亦有所研究，主要为金丝桃苷、异槲皮苷、山奈酚、柚皮素、芦丁、圣草酚、槲皮素、绿原酸等黄酮类化合物^［6］，其具有抗氧化、抗肿瘤、减肥等生物功效亦与这些活性物质相关^［7-8］。研究表明黄酮类化合物具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等功效，其提取方法主要有有机溶剂浸提法、超声辅助提取法、酶解提取法及超临界流体萃取法等，各种方法都有优缺点^［9-12］。基于系统有效地研究火棘果总黄酮提取率及体外抗氧化方面的报道颇少，考虑本实验室条件，本文以火棘干果为原料，采用超声辅助提取总黄酮，并对提取工艺进行优化，通过体外抗氧化试验考察总黄酮的抗氧化能力，为天然抗氧化剂的开发提供理论依据，同时提高火棘果的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

火棘鲜果：于2022年8月采摘自曲靖师范学院校园内，经生物资源与食品工程学院蔡建副教授鉴定为蔷薇科植物火棘的成熟果实；DPPH、维生素C （VC）、ABTS、芦丁标准品（纯度99%），上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、水杨酸，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.1.2 仪器

CP214型电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；UV-5600PC型可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；DHE-9101-3型电热鼓风干燥箱，金坛市杰瑞尔电器有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅，上海右一仪器公司制造；RE-52CS型旋转蒸发仪，上海亚荣仪器公司制造；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司；JK-G-350A3高速多功能粉碎机，上海精学科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 火棘干果总黄酮（TFDPF）超声辅助提取流程

新鲜火棘果→50 ℃条件下恒温烘干→粉碎后过80目药筛→称量→乙醇溶解→超声辅助提取→真空抽滤→滤液定容至250 mL容量瓶→用NaNO₂-Al（NO₃）₃-NaOH分光光度比色法显色→最大吸收波长处测定吸光度A→计算火棘干果总黄酮提取率^［9］。

1.2.2 单因素试验

参考Zhang等^［13］的试验方法略作改进，在料液比1∶10 g∶mL、超声时间30 min、超声功率600 W、乙醇浓度60%的基础条件下，保持其他条件不变，只改变其中一个因素，以总黄酮提取率为指标，设置料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g∶mL，超声时间10、20、30、40、50 min，乙醇浓度40%、50%、60%、70%、80%，超声功率520、600、750、900 W进行单因素试验，每组重复3次。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验所得结果和正交表进行4个因素3水平正交试验设计，如下表1。计算该条件下TFDPF的提取率，在对所得数据进行方差分析，得最佳提取工艺。

1.2.4 验证试验

对正交试验所得的最佳提取工艺条件进行验证试验。

1.2.5 TFDPF的测定

参考文献并改进^［14］，对所提取的总黄酮含量测定，精密吸取0.2 mg/mL的芦丁标准溶液0、1、2、3、4、5 mL分别置于25 mL比色管中，依次加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀并静置5 min，再加入1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀并静置5 min，然后加入10 mL 4%氢氧化钠溶液，最后用30%乙醇定容至刻度线，摇匀，显色15 min。空白管调零，以芦丁标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光值A为纵坐标，在最大吸收波长387 nm处比色测定不同浓度的吸光度，绘制标准曲线，可得回归方程为y=0.944 1x+0.003 6，R²=0.999 7。

按照上述方法，调整适当的样品浓度，进行总黄酮提取率的计算，公式如下：

总黄酮提取率（%）=\frac{e\times v\times n}{\mathrm{1}\mathrm{000}\times m}×100%

式中：c为总黄酮浓度，mg/mL；V为样品溶液体积，mL；n为稀释倍数；m为火棘干果粉末质量，g^［15］。

1.2.6 TFDPF抗氧化试验

1.2.6.1 ·DPPH自由基清除率的测定

参考黄梅桂等人的试验方法并改进^［16-17］，用无水乙醇配制浓度为0.2 mmol/L·DPPH溶液，现用现配。量取2 mL不同浓度（10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL）的待测液，加入·DPPH溶液2 mL，室温下避光反应30 min，以无水乙醇为空白对照，VC为阳性对照，于517 nm处测吸光度值。每个样品重复测3次，按照下列公式计算·DPPH溶液清除率：

清除率（%）=［1-(\frac{A_i-A_j}{A_{\mathrm{0}}})］×100%

式中：A_i 代表加入待测液的吸光度值；A_j 代表待测液的本底值；A₀为不加待测液的对照值。

1.2.6.2 ABTS⁺自由基清除率的测定

参考张轶斌等人的试验方法^［18-19］，略作改进。取7 mmol/L ABTS⁺ 5 mL和140 mmol/L过硫酸钾 88 μL 混合均匀，配制成ABTS⁺自由基储备液，避光保存备用。取0.1 mL不同浓度（10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL）待测液，加入3.9 mLABTS⁺工作液，振荡30 s，室温下静置6 min后，以无水乙醇为对照，于734 nm处测吸光度，采用VC作为阳性对照。每个样品重复测3次，按照下列公式计算ABTS⁺自由基的清除率：

清除率（%）=［1-(\frac{A_i-A_j}{A_{\mathrm{0}}})］×100%

式中：A_i 代表加入待测液的吸光度值；A_j 代表待测液的本底值；A₀为不加待测液的对照值。

1.2.6.3 ·OH自由基清除率的测定

参考焦岩等人的试验方法^［20］，略作改进。于若干个准备好的比色管中依次加入10 mmol/L水杨酸溶液0.5 mL，量取不同浓度的（10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL）待测液0.5 mL，然后加入10 mmol/L FeSO₄溶液0.5 mL、3.5 mL蒸馏水混匀后加入88 mmol/L过氧化氢溶液5 mL，启动Fenton反应，混匀后于510 nm波长下测定吸光度值D₁；量取0.5 mL蒸馏水代替10 mmol/L FeSO4溶液，510 nm波长下测定吸光度值D₂；量取0.5 mL蒸馏水代替样品溶液，510 nm波长下测定吸光度值D₃。每个样品重复测3次，按照下列公式计算·OH自由基清除率：

羟自由基清除率（%）=［1-(\frac{D_{\mathrm{1}}-D_{\mathrm{2}}}{D_{\mathrm{3}}})］×100%

1.2.6.4 亚硝酸根（NO₂^-）离子清除率的测定

参考童钰琴等人的试验方法，略作改进^［21］。以NaNO₂标准溶液浓度（μg/mL）为横坐标，以吸光值A为纵坐标，在最大吸收波长538 nm处比色，绘制标准曲线，可得回归方程为y=0.282x+0.013，R²=0.999 8；分别吸取不同浓度（10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL）待测液置于比色管中，加入5 μg/mL的NaNO₂溶液2 mL，37 ℃恒温水浴30 min，取出立即加入1 mL 0.4%对氨基苯磺酸，混匀，反应5 min后加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液0.5 mL，加水至10 mL，混匀反应15 min，以不加NaNO₂溶液的管为空白，在538 nm处测定各管的吸光度，每个样品重复测3次。通过NaNO₂标准曲线得出残留的NaNO₂量，按照下列公式计算NO₂^-清除率：

NO₂^-清除率（%）=

(\frac{\mathrm{加入}\mathrm{标准}\mathrm{亚硝}\mathrm{酸钠}\mathrm{量}-\mathrm{亚硝}\mathrm{酸钠}\mathrm{残留}\mathrm{量}}{\mathrm{加入}\mathrm{标准}\mathrm{亚硝}\mathrm{酸钠}\mathrm{量}})×100%

1.3 统计学分析

数据用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，采用t检验法、LSD法对数据进行显著性分析。采用Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对超声辅助提取TFDPF的影响

由图1可以看出，在料液比1∶10~1∶20 g∶mL时，黄酮提取率随料液比增加呈上升趋势，这是因为溶剂量的加大，增加了溶液浓度差，利于物质的传递^［22］。在1∶20 g∶mL以后总体呈现平缓下降，可能由于此时料液比已经达到饱和状态，溶剂量继续增加只会使其他可溶性杂质被提取出来，导致总黄酮提取率下降^［23］。因此，当料液比为1∶20 g∶mL时火棘干果总黄酮提取率达到最大。这与张薇等人研究结果规律相似^［24］。

2.1.2 乙醇浓度对超声辅助提取TFDPF的影响

由图2可以看出，在乙醇浓度为40%~60%时，总黄酮提取率随着乙醇浓度的递增呈逐渐增加的趋势，这可能由于在此范围内当乙醇浓度低时，乙醇浓度的增加会加大乙醇与溶质的接触，同时乙醇浓度不同其极性不同，此时更有利于黄酮物质溶出^［25］；当乙醇浓度为60%~80%时，总黄酮提取率逐渐下降，其原因是乙醇浓度增加，提取样品中亲脂性成分如鞣质等会与黄酮类化合物竞争溶剂，阻碍其溶出，导致黄酮得率降低^［26］。因此60%的乙醇浓度为火棘干果总黄酮的最适提取条件。这与李亚军等人研究结果规律相似^［27］。

2.1.3 超声功率对超声辅助提取TFDPF的影响

由图3可以看出，在最小的超声功率为520 W时随着功率的逐渐增加总黄酮的提取率逐渐下降，这可能由于超声波处理有助于破坏火棘干果内部分子结构，有助于黄酮类物质的溶出，但随着功率增大会导致高温的产生，进而导致黄酮类物质被破坏，降低了总黄酮的提取率。这与张倩倩等人研究结果规律相似^［28］。因此520 W的超声功率最有利于总黄酮的提取。

2.1.4 超声时间对超声辅助提取TFDPF的影响

由图4可以看出，超声时间在10~30 min时，超声时间的逐渐延长，总黄酮提取率也逐渐增加，这是由于适当延长超声时间，超声波对火棘干果细胞壁组织的破碎程度也会增大，随着时间的增加溶剂的渗透及扩散作用增强更有利于黄酮类物质进入溶液^［25］。在30 min时提取率达到最大，过了30 min后，延长时间总黄酮提取率反而减小了，这是因为超声时间的不断延长，会造成乙醇蒸发过快，造成黄酮结构的破坏^［29］。这与黄梅桂等^［16］研究结果规律相似。因此，在其他条件不变时，超声辅助提取火棘干果总黄酮时超声时间在30 min可以有最高提取率。

2.2 正交试验

以单因素试验得到的总黄酮提取率为指标，通过4个因素的试验变化范围，以料液比、乙醇浓度、超声功率、超声时间为正交试验因素。正交试验设计及结果见表2。

依据表2中的极差R可以得到不同因素对试验结果影响的大小顺序依次是A>C>B>D，也就是料液比>超声功率>乙醇浓度>超声时间。同时，从4个因素水平的平均值K₁、K₂、K₃可以得到提取火棘干果总黄酮的最佳工艺是A₃B₂C₃D₃，也就是料液比1∶30（g∶mL）、乙醇浓度60%、超声功率750 W、超声时间40 min。

2.3 验证试验

通过上述优化试验得到的TFDPF提取最佳组合为A₃B₂C₃D₃，分别做3组平行试验，得火棘干果总黄酮提取率为2.96%，高于正交试验表2中TFDPF提取率2.78%最高组合A₃B₂C₁D₃，说明验证试验结果具有可靠性。

2.4 TFDPF体外抗氧化活性

2.4.1 对·DPPH自由基清除效果

DPPH 是一种比较稳定的脂性自由基，在517 nm处有最大吸收，具有典型的紫色，加入抗氧剂后，DPPH捕捉一个电子配对，紫色褪去，溶液变浅，可依据此原理来检测待测物的抗氧化能力^［29］。由图5可知，TFDPF、芦丁和山奈酚体外对DPPH自由基有显著的的清除能力，随着浓度的增大清除作用也增大，达到一定程度后趋于平缓，在0.625~10 mg/mL范围内，呈良好的量效关系，在2.5 mg/mL时，TFDPF对·DPPH自由基的清除率达到最高约为85.26%，而后趋于平稳；芦丁、山奈酚和VC在5 mg/mL时，对·DPPH自由基的清除率达到最大分别约为93.40%、93.34%、92.4%，而后趋于平稳，在试验浓度范围内，清除力随着浓度增加不断提高。薛菁等研究表明^［30］，柿子总黄酮在0~5 mg/mL时对·DPPH有很好的清除效果；李伟等^［15］用溶剂浸提法得到火棘果总黄酮，在0~8 μg/mL范围内对·DPPH有很好的清除效果。本试验结果与这些研究结果规律基本一致。

2.4.2 对ABTS⁺ 自由基清除效果

ABTS法常用于评价样品的抗氧化能力，ABTS经活性氧氧化后产生稳定的蓝绿色阳离子ABTS⁺·，向其中加入待测样品，若该样品中存在抗氧化成分，则会与ABTS⁺·发生反应使反应体系褪色^［31］。相比其他几种抗氧化能力测定方法，ABTS法更快速、便捷，且与抗氧化剂的生物活性相关性强，因此被广泛用于物质的抗氧化能力测定。

由图6可知，当质量浓度为0.625~10 mg/mL时，随着浓度增大，TFDPF对ABTS⁺·的清除能力增强，有明显的量效关系，且质量浓度为10 mg/mL时，其清除率达到最高约为84%，而之后表现出平稳趋势。芦丁和山奈酚在10 mg/mL时，对ABTS⁺·的清除能力达到最高分别为86.4%、86.4%，而后趋于平稳，在试验浓度范围内，清除力随着浓度增加不断提高且呈现良好的量效关系。VC作为阳性对照在0.625~10 mg/mL时，对ABTS⁺·的清除率为89%，且一直处于平稳状态，表现出良好的抗氧化效果。马雪洁等人研究表明^［32］，异叶青兰总黄酮在0~1 mg/mL范围内对ABTS⁺·有很好的清除作用，清除能力随着浓度增大而升高，而后趋于平稳，与本研究结果规律相似。

2.4.3 对·OH自由基清除效果

·OH自由基是最活泼的、毒性最大的自由基，与活细胞的任何分子发生反应，引起组织细胞病变进而导致疾病的发生和机体的衰老。黄酮类抗氧化作用是通过酚羟基与自由基反应，形成共振稳定的半锟式自由基而中断链式反应^［33］。由图7可知，在0.625~10 mg/mL范围内，TFDPF对·OH自由基的清除能力呈正相关，当质量浓度为10 mg/mL时，清除率达到最大约为64.8%，而后趋于平缓。芦丁、山奈酚和VC在10 mg/mL时，对·OH自由基的清除率分别为62.4%、79.2%、98.4%，而后趋于平稳，在试验浓度范围内，清除力随着浓度增加不断提高且呈现良好的量效关系。白生文等人研究表明^［33］，沙棘果渣总黄酮对·OH自由基有很好的的清除作用，在质量浓度为2.49 mg/L时，清除率达到42.01%，之后趋于平稳，本实验研究结果规律与其相似。

2.4.4 对NO₂^-离子清除效果

研究表明^［21］，在胃部酸性条件下，亚硝酸盐与胺类同时存在形成公认的致癌物亚硝铵，严重危害人体健康，亚硝酸盐作为影响食品安全的重要指标，本次试验通过对NO₂^-离子清除效果检验TFDPF抗氧化作用。由图8可知，在0.625~10 mg/mL范围内，TFDPF对NO₂^-离子清除能力呈正相关，当质量浓度为10 mg/mL时，清除率达到最大约为87%。芦丁、山奈酚和VC在10 mg/mL时，对NO₂^-离子清除率分别为97.3%、97.6%、98.7%，在试验浓度范围内，清除力随着浓度增加不断提高。李米等人研究表明^［34］，姜辣素在浓度为15 mg/mL时对NO₂^-离子清除率为98.74%，与本试验研究结果规律相似。

3 讨论

相关研究表明，火棘果富含黄酮类物质^［6］，本试验采用超声辅助提取法对火棘果总黄酮提取进行研究，该法操作简便，提取率高。刘小娟等的研究发现^［35］，超声辅助提取衢枳壳总黄酮，在最佳工艺条件下，提取率达6.21%。张薇等的研究表明^［24］，以乙醇为溶剂提取火棘果总黄酮，在最佳工艺条件下，提取率达2.34%。本试验在最佳提取条件下，火棘果总黄酮提取率高于张薇等的试验结果，可能因为火棘果产地和提取方式不同，亦说明火棘果黄酮含量高。

本研究采用4种目前常用的自由基体系如·DPPH、ABTS⁺、·OH自由基和NO₂^-离子，对TFDPF的体外抗氧化活性进行评价。Sarikurkcu等^［36］研究了土耳其火棘果提取物体外抗氧化活性，对·DPPH和ABTS⁺具有良好的清除作用，与提取物中黄酮类物质相关，这与本实验结果一致，但抗氧化强弱方面有所差异，可能因为云南火棘果和土耳其火棘果的生长环境不同，使得所含黄酮种类和数量不同，导致抗氧化结果的差异。

综上所述，TFDPF在体外抗氧化体系中发挥良好的抗氧化性能，可能与火棘果中富含芦丁、槲皮素、山奈酚等活性成分相关，本试验所提火棘果总黄酮为粗提物，含有些许杂质，后期需进一步纯化及采用体内动物试验进一步验证其抗氧化作用。

4 结论

通过火棘果总黄酮提取单因素试验，确定比较好的因素水平为料液比1∶10（g∶mL）、乙醇浓度60%、超声功率600 W、超声时间30 min。采用超声波辅助提取法对火棘果总黄酮进行提取，并通过正交试验对工艺优化，得到影响黄酮提取率的提取因素影响力大小为：料液比>超声功率>乙醇浓度>超声时间，得到最佳提取条件为料液比1∶30 g/mL、乙醇浓度60%、超声功率750 W、超声时间40 min。在此条件下得到的TFDPF提取率为2.96%，与理论预测值相近，表明利用正交分析法优化TFDPF超声提取工艺条件切实可行，操作简单便捷具有实用价值。与已有的研究报道相比，本次试验已经达到提取火棘果黄酮的目的。抗氧化试验结果表明TFDPF在一定浓度范围内（0.625~10 mg/mL）具有良好的抗氧化活性，可能与其所含黄酮类活性成分（芦丁、山奈酚）相关，与已有的研究结果保持一致性。

总之，本研究结果表明，云南火棘果中含有较丰富的黄酮类化合物，基于黄酮类化合物既能够作为食品添加剂延缓脂肪氧化，又可用于防治自由基引发的多种疾病。因此，云南火棘果在天然抗氧化剂、功能食品和药品方面具有较好的开发前景，拓展该资源的合理利用空间，亦为进一步深入研究其应用价值提供理论支持。

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基金资助

2022年云南省科技厅青年基础研究专项(2106150068Y615)

曲靖师范学院校2021年校级项目(2107410131X741)

曲靖师范学院2022年校级大学生创新创业训练计划项(2022106841037)

曲靖师范学院2022年校级大学生创新创业训练计划项(2022106841010)

曲靖师范学院2022年校级大学生创新创业训练计划项(2022106841065)

云南省地方本科高校（部分）基础研究联合专项资金资助(2018FH001-040)