苜蓿素对LPS诱导HUVECs炎症反应的消除作用

Roles of tricin in eliminating LPS-induced inflammatory response in HUVECs

摘要

目的 研究苜蓿素对脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）炎症损伤的保护作用。 方法 以HUVECs为研究对象，用MTT法确定苜蓿素的处理浓度，用酶联免疫分析法确定LPS建模浓度以及检测HUVECs炎症相关因子（TNF-α、iNOS、COX-2、IL-1、IL-6）表达，用Western-blot法测定NF-κB和MAPK信号通路蛋白（β-Actin、P65、IKB、P-P65、P-IKB、P38、JNK、ERK1/2、P-P38、P-JNK、P-ERK1/2）表达。 结果 不同浓度的LPS均能促进TNF-α的表达（P<0.01），其中LPS浓度在2.5~7.5 μg/mL时TNF-α的表达量最高，选用2.5 μg/mL作为建模浓度，在该浓度下LPS促进炎症相关因子和炎症相关通路蛋白表达（P<0.01），而作为阳性对照辛伐他汀能抑制LPS诱导的炎症相关因子和炎症相关通路蛋白表达（P<0.01）；苜蓿素浓度在3 μg/mL之内对HUVECs活性无显著差异，因而选用3、2、1 μg/mL作为苜蓿素高、中、低剂量组；苜蓿素高、中、低剂量组均能下调LPS诱导的炎症相关因子和炎症相关通路蛋白表达（P<0.01），而且苜蓿素对炎症相关因子的抑制效果弱于辛伐他汀，而对炎症相关通路蛋白的抑制效果强于辛伐他汀，各炎症相关因子表达随苜蓿素浓度升高而降低（P<0.01），炎症相关通路蛋白表达情况也有这个下降趋势。 结论 苜蓿素能够通过抑制NF-κB和MAPK信号通路消除LPS对HUVECs诱导的炎症损伤。

Abstract

Objective This study aimed to evaluate the protective effect of tricin on inflammatory injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by lipopolysaccharide (LPS). Method HUVECs were used as the research subject.The MTT method was employed to determine the optimal concentration of tricin for treatment.ELISA was utilized to determine the appropriate LPS concentration for modeling and to assess the expression of inflammation-related factors (TNF-α，iNOS，COX-2，IL-1，IL-6) in HUVECs.Western blot analysis was performed to detect the protein expression of NF-κB and MAPK signal pathways (β-Actin，P65，IKB，P-P65，P-IKB，P38，JNK，ERK1/2，P-P38，P-JNK，P-ERK1/2). Result Different concentrations of LPS were found to promote the expression of TNF-α (P<0.01)，with the highest expression observed at LPS concentrations between 2.5 μg/mL and 7.5 μg/mL.Therefore，2.5 μg/mL was chosen as the modeling concentration.At this concentration，LPS induced the upregulation of inflammation-related factors and pathway proteins (P<0.01)，while simvastatin，used as the positive control，inhibited the expression of these factors and proteins induced by LPS(P<0.01).HUVECs exhibited no significant difference in activity within tricin concentrations up to 3 μg/ml; therefore，tricin high (3 μg/mL)，medium (2 μg/mL)，and low (1 μg/mL) dosage groups were selected.Tricin in these dosage groups effectively downregulated the expression of inflammation-related factors and pathway proteins induced by LPS (P<0.01).Tricin showed a weaker inhibitory effect on inflammation-related factors compared to simvastatin，while its inhibitory effect on inflammation-related pathway proteins was stronger than that of simvastatin.The expression of inflammation-related factors decreased with increasing tricin concentration (P<0.01)，and a similar downward trend was observed for inflammation-related pathway proteins. Conclusion The findings indicated that tricin can attenuate LPS-induced inflammatory damage in HUVECs by inhibiting the NF-κB and MAPK signaling pathways.

Graphical abstract

关键词

苜蓿素 / 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） / 炎症 / 脂多糖（LPS）

Key words

tricin / human umbilical vein endothelial cells / inflammation / lipopolysaccharide

Author summay

郭海海，硕士研究生。E-mail： [e-mail]

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种困扰人类健康的血管疾病，而心脑血管疾病已经成为当前造成人类死亡率最高的疾病。动脉粥样硬化首先是由于血脂异常导致血管内皮受损，然后血液中的脂质沉积到内膜下层，血液中粘附因子的表达增多，而单核细胞巨噬细胞受粘附因子的影响粘附在受损的内皮表面，并进入内膜层吞噬大量被氧化的脂质形成泡沫细胞，促进斑块的生长和发展^［1］。近年来，人们逐渐发现除了高脂血症外，炎症反应还介导了动脉粥样硬化并且伴随其发生发展的全过程，炎症反应依靠炎症介质来参与调控血管内皮细胞以及其他参与粥样硬化形成的细胞的增殖和凋亡，促进粥样硬化斑块的形成^［2-3］。

苜蓿素（tricin）又名麦黄酮，是一种从植物中分离得到的黄酮类化合物，由于苜蓿素最早发现于小麦，随后又在苜蓿中提取得到，因此得名麦黄酮、苜蓿素^［4］，而苜蓿素根据其化学结构（图1）又可以被命名为5，7-二羟基-2-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯基）-4H-苯并吡喃-4-酮。苜蓿素分布广泛，目前已在豆科、菊科、禾本科、毛茛科、胡桃科、石竹科等植物中发现，同时苜蓿素还具有显著的抗炎作用^［4-5］。已有研究发现，苜蓿素能够显著降低牛乳腺上皮细胞^［6］、小鼠肺泡巨噬细胞^［7］、小鼠单核巨噬细胞^［8-9］中炎症因子的表达量，并且还能够通过NF-κB和MAPK信号通路发挥其在外周血单核细胞（PBMC）中的抗炎作用^［10-11］。且目前已发现苜蓿素在人外周血单核细胞（HPBMCs）和小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7）中都具有调控炎症通路蛋白的作用^［11-12］。然而并未发现有关苜蓿素对血管内皮细胞炎症的报道，而人脐静脉内皮细胞（HUVECs）通常被作为研究动脉粥样硬化的的细胞模型。本研究以HUVECs为细胞模型，以苜蓿素为试验药物，探讨苜蓿素对人脐静脉内皮细胞炎症损伤保护机制。

1 材料与方法

1.1 主要药物与试剂

苜蓿素（纯度＞98.0%）为供试药物，购自上海泰坦科技股份有限公司；辛伐他汀（Simvastatin，SIM）为阳性对照药物，购自北京索莱宝科技有限公司；脂多糖（LPS）为细胞建模诱导剂，购自Sigma公司。

MTT试剂盒、胰蛋白酶-EDTA消化液购自北京索莱宝科技有限公司；F12培养液、磷酸盐缓冲液（PBS）均购自Hyclone公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；人肿瘤坏死因子（TNF-α）、一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶（COX-2）、白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒均购自重庆博诺恒生物科技有限公司；PVDF膜购自红荣微再生物工程技术有限公司；β-Actin、P65、IKB、P-P65、P-IKB、P38、JNK、ERK1/2、P-P38、P-JNK、P-ERK1/2 兔抗鼠一抗、HRP标记山羊抗兔IgG二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 供试细胞株

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自上海青旗生物技术发展有限公司，使用胰蛋白酶-EDTA消化液传代，在含10%新生牛血清的F12培养基中置于培养箱（37℃，5% CO₂）常规培养。

1.3 主要仪器设备

CO₂恒温培养箱购自德国Thermo公司；倒置荧光显微镜购自德国Leica公司；SDS垂直电泳系统、酶标仪购自美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机购自德国Sartorius公司。

1.4 MTT法筛选苜蓿素处理浓度

将HUVECs按每孔1×10³个细胞的密度接种于96孔培养板，在培养箱（37 ℃，5% CO₂）中培养24 h后，将细胞分为11组［苜蓿素（0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5 μg/mL）+F12培养基］，每组设置5个复孔。在培养箱（37 ℃，5% CO₂）中孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h后，弃去细胞培养液，每孔加入Formazan 110 μL，溶解结晶，于水平摇床振荡混匀10 min后于490 nm处测定各孔吸光度。

1.5 LPS诱导炎症模型的建立

将HUVECs以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于无菌12孔板中，待细胞生长至80%细胞密度时，将细胞分为6组［LPS（0，1，2.5，5，7.5，10 μg/mL）+F12培养基］，每组设置3个复孔，在培养箱（37 ℃，5% CO₂）中培养24 h。取细胞上清液，用酶联免疫分析法检测TNF-α的表达量。

1.6 试验设计

确定苜蓿素低、中、高处理组浓度以及LPS建模浓度，将生长至80%的细胞分为空白组（F12培养基）、模型组（LPS+F12培养基）、阳性对照组（辛伐他汀+F12培养基）、苜蓿素（低1 μg/mL、中2 μg/mL、高3 μg/mL）处理组（苜蓿素+F12培养基），每组设置3个复孔，在培养箱（37 ℃，5% CO₂）中培养24 h。

1.7 炎症相关因子与炎症相关信号通路蛋白表达量的测定

1.7.1 酶联免疫分析法检测炎症相关因子的表达水平

将HUVECs以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于无菌12孔板中，分组培养方法、条件、时间均依据试验方法1.6。取细胞上清液，用酶联免疫分析法检测各个炎症相关因子的表达量。

1.7.2 Western-Blot检测苜蓿素对炎症相关信号通路蛋白的影响

将HUVECs以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于无菌6孔板中，分组培养方法、条件、时间均依据实验方法2.3。弃上清，PBS清洗2遍，加入PBS刮细胞，离心收集细胞，加入裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度并定量，10 % SDS-PAGE电泳后将蛋白电转到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h（磷酸化蛋白封闭4 h），一抗4℃孵育过夜，TBST室温避光洗涤5 min，洗6次，二抗室温避光孵育1 h，TBST洗涤同前，使用ECL显色液显色，使用化学发光成像系统拍照，采用Image Lab软件进行分析，蛋白表达量用吸收度表示，结果为目标条带吸收度与内参吸收度的比值。

1.8 数据处理

数据均以作图的形式表示，采用Prism统计分析软件分析试验数据。

2 结果与分析

2.1 LPS诱导HUVECs炎症模型的建立

如图2所示，当细胞培养液中加入不同浓度的LPS经过24 h后，与空白对照组相比，LPS处理组中TNF-α的表达量均出现极显著升高（P<0.01），而且总体随着LPS浓度的升高，TNF-α的表达量先升高再降低，其中LPS的浓度在2.5、5和7.5 μg/mL时TNF-α的表达量达到最高，且极显著高于其他处理组（P<0.01），并且这三者之间没有显著差异，但LPS的浓度在2.5 μg/mL时，TNF-α的表达量相对略高于其他2个浓度，因此选定2.5 μg/mL作为LPS诱导HUVECs建立炎症模型的浓度。

2.2 苜蓿素浓度筛选

如图3所示，与空白对照组相比，细胞培养液中在添加苜蓿素24 h后，随着苜蓿素浓度的升高，HUVECs细胞活性在0~3 μg/mL阶段无明显变化，3~3.5 μg/mL阶段迅速降低，3.5~4 μg/mL阶段无明显变化，4 μg/mL阶段之后缓慢降低，且苜蓿素浓度超过3 μg/mL之后，细胞活性均出现极显著降低（P<0.01），而苜蓿素浓度在3 μg/mL之前时，细胞活性之间没有显著差异，这说明苜蓿素的浓度在3 μg/mL之前对HUVECs没有发现毒性，因此选取3，2，1 μg/mL作为高、中、低给药剂量。

2.3 苜蓿素对炎症相关因子表达的影响

由图4可以看出，与空白对照组相比，模型组中各个炎症相关因子（包括TNF-α、iNOS、COX-2、IL-1、IL-6）的表达量均出现极显著升高的现象（P<0.01），与模型组相比，辛伐他汀组中各个炎症相关因子的表达量均出现极显著下降的现象（P<0.01），而且苜蓿素（低、中、高剂量）组中各个炎症相关因子的表达量与模型组相比也均出现极显著下降的现象（P<0.01）。随着苜蓿素浓度的升高，各个炎症相关因子的表达量均呈现出显著降低（P<0.05），其中iNOS和TNF-α的表达量随着苜蓿素浓度的升高出现极显著降低（P<0.01），但是苜蓿素（低、中、高剂量）组降低炎症相关因子的效果不如阳性对照（辛伐他汀）组，这说明苜蓿素具有极显著的消炎作用，并且随着苜蓿素浓度的升高，其消炎效果也会更明显，但是苜蓿素的消炎效果没有辛伐他汀好。

2.4 苜蓿素对炎症通路的影响

2.4.1 苜蓿素对MAPK信号通路蛋白的影响

如图5所示，与空白对照组相比，LPS组6种蛋白（P38、JNK、ERK1/2、P-P38、P-JNK、P-ERK1/2）的表达量均极显著升高（P<0.01），与LPS组相比，辛伐他汀组6种蛋白的表达量均出现极显著下降的现象（P<0.01），苜蓿素（低、中、高剂量）组6种蛋白的表达量也均出现极显著下降的现象（P<0.01），而且随着苜蓿素浓度的升高，这六种蛋白的表达量均出现极显著降低（P<0.01）。与辛伐他汀组相比，除了苜蓿素低剂量组中JNK和P-ERK的表达量方面与辛伐他汀组无明显差异外，以及苜蓿素低剂量组中P-JNK显著低于辛伐他汀组外（P<0.05），其他苜蓿素组6种蛋白的表达量均极显著低于辛伐他汀组（P<0.01），这说明苜蓿素能够抑制MAPK信号通路蛋白的表达，而且随着苜蓿素浓度的升高，其抑制效果逐渐增强，并且该浓度下苜蓿素对MAPK信号通路蛋白抑制效果优于辛伐他汀。

2.4.2 苜蓿素对NF-κB信号通路蛋白的影响

图6表明，与空白对照组相比，LPS组4种蛋白（包括P65、IKB、P-P65、P-IKB）的表达量均出现极显著升高（P<0.01），与LPS组相比，辛伐他汀组4种蛋白的表达量均出现极显著下降的现象（P<0.01），而苜蓿素（低、中、高剂量）组4种蛋白的表达量也均呈现出极显著降低的现象（P<0.01）。随着苜蓿素浓度的升高，除了P65的表达量出现先升高再降低外，其他3种蛋白的表达量均呈现出极显著降低的现象（P<0.01）。与辛伐他汀组相比，这4种蛋白中除了苜蓿素低剂量组在P-P65的表达量方面与辛伐他汀组无显著差异外，其他苜蓿素组4种蛋白的表达量均极显著低于辛伐他汀组（P<0.01），这说明苜蓿素能够抑制NF-κB信号通路蛋白的表达，而且这3种浓度下的苜蓿素抑制NF-κB信号通路蛋白表达的能力比辛伐他汀好。

3 讨论

动脉粥样硬化是一种全身慢性炎症性疾病，发生机制复杂，脂质沉积、炎症和氧化应激是其主要病理因素^［13］。当动脉血管发生炎症时，血清中炎症因子的含量就会明显增多，而这些由炎症细胞分泌的炎症因子正是进一步激活局部组织发生炎症的信号。在机体中促炎因子主要包括TNF-α、iNOS、COX-2、IL-1、ILv6等，除了作为传递炎症的信号外，它们在血管炎症的形成过程中也发挥了巨大的作用^［14］。LPS（脂多糖）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，它能够诱导细胞组织发生炎症反应。TNF-α是典型的促炎因子，它能够直接引起血管内皮细胞的损伤，使局部组织发生炎症^［15］，在本研究中，加入LPS使人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分泌在培养液中的TNF-α极显著增多，而同时加入LPS和阳性对照药物辛伐他汀后，TNF-α的表达量又极显著下降，这种现象表明该浓度下的LPS能使HUVECs产生可治疗的细胞炎症反应，因此，这也间接表明HUVECs炎症模型建立成功。苜蓿素是一种黄酮类化合物，研究发现，黄酮类化合物中的芹菜素^［16］、木犀草素^［17］、槲皮素^［18］对HUVECs均具消炎作用，而且苜蓿素在其他细胞中已发现具有抗炎作用^［3-6］。本试验以HUVECs作为细胞模型，当培养液中同时加入苜蓿素和LPS后，与模型组相比，治疗组中各个细胞炎症相关因子（包括TNF-α、iNOS、COX-2、IL-1、IL-6）的表达量均出现极显著降低，这与Takuji等^［19］和占今舜等^［11］发现苜蓿素能抑制小鼠体内炎症因子表达的结果一致，而且在研究中，随着苜蓿素浓度的升高，苜蓿素组各个细胞炎症相关因子的下降效果均显著降低，并逐渐接近辛伐他汀组，促炎因子是引起局部组织产生炎症的关键，它是导致炎症发生发展的媒介，其表达量的高低直接决定组织机体是否会发生炎症反应，因此，从炎症因子的表达量来看，苜蓿素（低、中、高剂量）组均具有显著的抗炎效果。

NF-κB和MAPK信号通路是介导动物体内炎症反应的重要通路，MAPK家族主要包括ERK、JNK和p38MAPK，分别介导3条并行的MAPK信号通路，其中，ERK1/2通路、JNK通路以及p38MAPK通路均参与炎症反应^［20-21］。有研究指出，抑制NF-κB和MAPK信号通路就能够减轻炎症反应^［22-23］，而细胞内的炎症通路主要是依靠炎症通路蛋白（主要包括JNK、ERK、P38MAPK、NF-κB P65、IKB及其磷酸化形式等）传递炎症信号来发挥功能，因此，降低炎症通路蛋白的表达就能削弱炎症通路的信号传递，起到减轻炎症的作用。本研究发现，与炎症模型组和阳性对照组相比，除了苜蓿素低剂量组在P-P65、JNK、P-ERK1/2的表达方面与阳性对照组无明显差异外，其他苜蓿素组各种炎症蛋白（包括JNK、ERK、P38、P65、IKB及其磷酸化形式）的表达量均极显著低于炎症模型组和阳性对照组，而且苜蓿素（中、高剂量）组各种炎症蛋白的表达量均极显著低于空白对照组，这表明苜蓿素能抑制炎症通路蛋白表达，使细胞内部的炎症信号传递受阻，从而导致这两条炎症通路受到抑制，这与Lee等^［24］和Yue等^［25］的结果一致。此外，NF-κB和MAPK信号通路除了参与机体内的炎症反应外，还参与了细胞的生长、分化、凋亡等过程^［26-28］，所以NF-κB和MAPK信号通路受到过度抑制也必定会影响细胞其他的生理活动，本试验结果表明，苜蓿素浓度升高的同时这两条通路被抑制的程度也逐渐加强，因此可进一步通过控制药物剂量来达到更好的治疗效果。

从炎症通路蛋白的表达量来看，LPS能够极显著促进NF-κB和MAPK炎症通路蛋白的表达，而苜蓿素对NF-κB和MAPK这2条炎症通路均具有显著的抑制作用，且苜蓿素的抑制效果甚至明显优于辛伐他汀。从炎症相关因子的表达量来分析，LPS均能极显著促进各个炎症相关因子的表达，而辛伐他汀和苜蓿素均能极显著抑制各个炎症相关因子的表达，但辛伐他汀的抑制效果要优于苜蓿素。此外，各组（LPS组、辛伐他汀组、苜蓿素组）中各个炎症相关因子相对于空白对照组的上升趋势要高于各个炎症通路蛋白的上升趋势（如：LPS组各个炎症因子相对于空白对照组上升了3倍以上，而LPS组各个炎症通路蛋白相对于空白对照组上升了不足1倍），这可能是因为LPS还能够通过JAK1/STAT3^［29］、TLR4^［30］、NLRP3^［31］等多条通路发挥促炎作用，而辛伐他汀不仅是降脂药物，而且还能通过NF-κB^［32］、MAPK^［33］以及TLR4^［34-35］信号通路发挥良好的抗炎作用，所以即使苜蓿素在抑制NF-κB和MAPK信号通路方面优于辛伐他汀但抗炎效果仍没有辛伐他汀好。除了NF-κB和MAPK这两条炎症通路外，细胞内还存在其他多条炎症通路，因此推测辛伐他汀通过抑制其他炎症通路发挥抗炎的效果要优于苜蓿素，但是苜蓿素与模型组相比仍能极显著降低炎症相关因子的表达量，所以从总体来看，苜蓿素在消除LPS诱导的HUVECs的炎症反应中具有极显著的效果，同时苜蓿素对NF-κB和MAPK信号通路均具有极显著的抑制作用。

4 结论

综上所述，苜蓿素在消除LPS诱导的HUVECs炎症反应中具有极显著的作用，并且苜蓿素能够通过抑制NF-κB和MAPK信号通路发挥其抗炎作用。

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基金资助

西南山地生态循环农业国家级培育基地项目

国家重点基础研究发展规划项项目(2014CB138701)