富含羟基酪醇和玉米黄质色素橄榄油对衰老小鼠影响的比较

Comparative study of the effects of olive oil rich in hydroxytyrosol and zeaxanthin pigment on aging mice

摘要

目的 研究富含羟基酪醇橄榄油（olive oil rich in hydroxyl tyrosol，OHT）和富含玉米黄质色素橄榄油（olive oil rich in zeaxanthin，OZT）对衰老小鼠的影响。 方法 利用0.5 mL/10g剂量颈部皮下注射5%的D-半乳糖（D-galactose）溶液42 d构建亚急性衰老模型，建模成功后，将小鼠随机分成5组，分别为模型组（Model group）、维生素E对照组（VE group）、普通橄榄油组（olive oil group，OL）、OHT组和OZT组，以生理盐水对照组CK（0）。连续灌胃28 d后，检测小鼠体质量、血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）、白细胞介素-2（IL-2）、和干扰素-γ（IFN-γ）生成水平等指标的影响，观察肝组织形态学变化。 结果 D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型中，OHT和OZT均能控制衰老小鼠体质量（P<0.05），降低血清中的SOD、CAT、GSH-Px、ALT和AST的活性（P<0.05，P<0.01），能显著提高IL-2和IFN-γ生成（P<0.05，P<0.01），降低MDA含量（P<0.05，P<0.01），肝脏病理变化得到改善，OZT干预效果显著优于OHT。 结论 OHT和OZT对D-半乳糖致亚急性衰老动物模型均有很好的干预效果，能有效提高小鼠机体抗氧化能力，延缓衰老的作用。

Abstract

Objective To study the effects of olive oil rich in hydroxyl tyrosol (OHT)and zeaxanthin (OZT) on aging mice. Method A subacute aging model of mice was established by subcutaneous injection of 5% D-galactose solution in the neck at a dose of 0.5 mL/10 g for 42 days，the mice were randomly divided into model group (model group)，vitamin E control group (VE group) ，olive oil group (OL)，OHT group and OZT group，normal saline was used as CK(0) group，After continuous gavage for 28 days，to analysis the effects of different doses of OHT and OZT on body weight，serum levels of SOD，CAT，GSH-PX，ALT，AST and MDA，IL-2 and IFN-γ in aging mice were analyzed. Result In D-galactose-induced aging mice，OHT and OZT controlled the body weight of aging mice (P<0.05)，decreased the activities of SOD，CAT，GSH-Px，ALT and AST in serum (P<0.05,P<0.01)，IL-2 and IFN-γ production were significantly increased (P<0.05，P<0.01)，the contents of MDA were decreased (P<0.05,P<0.01)，The pathological changes of liver were improved，and the effect of OZT was significantly better than that of OHT. Conclusion OHT and OZT have a good therapeutic effect on the subacute aging model induced by D-galactose，which may be attributed to their ability to effectively improve the antioxidant capacity of mice and enhance the effect of delaying aging.

Graphical abstract

关键词

羟基酪醇 / 玉米黄质色素 / 橄榄油 / 衰老小鼠 / 抗氧化 / 抗衰老

Key words

hydroxytyrosol / zeaxanthin / olive oil / aging mice / antioxidant / anti-aging

Author summay

叶文斌，硕士，副教授，研究方向为天然产物化学与动物药理、果蔬保鲜及功能食品。E-mail：[e-mail]

橄榄油是木犀科木犀榄属的一种常绿经济乔木油橄榄（Olea europaea）所结新鲜的油橄榄果实直接冷榨而获取的果汁油^［1］，因其加工方式独特，保留了油橄榄果中的甾醇类、类胡萝卜素、三萜类、角鲨烯、脂溶性维生素、多酚类、不饱和脂肪酸、酚类化合物和其它色素等多种天然营养成分^［1］，被誉为“飘香的软黄金”^［2-3］，是可以直接饮用的健康油脂。而且它还是一种不干性食用油，人体消化吸收率高达90%以上，是食用油脂中最有益于人体健康的植物油之一^［2-3］，近年来研究发现，橄榄油具有调节肠道菌群、降低血糖血脂、养肤护肤、预防心脑血管疾病、阿尔茨海默病、癌症、糖尿病和骨质疏松症等保健功能和预防疾病的功效^［4-8］，是理想的高级食用油。

羟基酪醇是存在于油橄榄果和叶中的多酚类化合物，具有抑菌消炎、抗癌和改善心脏的血流^［9-11］、防治生殖系统疾病^［11-13］等方生物活性，而且可有效去除外源性和内源性自由基和氧化物，是一种自由基清道夫，生物利用度和安全性高。玉米黄质是广泛存在玉米、水果、蔬菜、鸡蛋黄等食品中的天然色素，为类胡萝卜素家族成员，人体不能合成^［11-14］，尤其在增强视觉功能，治疗老年性黄斑变性、白内障和明目方面具有独特的功效^［15］。动物机体衰老会产生的大量自由基和过氧化氢，导致机体细胞通透性增大，引起脂质过氧化产物MDA含量的升高^［15-16］，而SOD、CAT和GSH-Px是清除自由基、过氧化氢和降低MDA含量的主要酶^［17-20］。ALT和AST是反映机体衰老过程中肝脏代谢的指标^［21］，IL-2和IFN-γ是机体参与免疫应答的重要成分^［22-23］，所以检测以上指标就可反应衰老动物的治疗和恢复情况。

我国橄榄油产率低、国际竞争力弱和市场占有率低，而国内对橄榄油保健食品研究更少，产值不明显，限制了我国油橄榄产业的发展。因此关注对国内橄榄油及衍生的保健食品研究，是提升我国橄榄油国际市场竞争力的重要举措。因此，本文研究富含羟基酪醇和玉米黄质色素橄榄油对衰老小鼠的影响，为开发富含羟基酪醇和玉米黄质色素抗衰老油橄榄保健产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普通橄榄油由甘肃时光油橄榄科技有限公司提供；SPFKM小鼠，雌雄各半，体质量22~28 g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，许可证号：SCXK（甘）2020-0002，玉米黄质色素，中国科学院兰州化学物理研究所西北特色植物资源化学重点实验室提供。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）丙二醛（malondialdehyde，MDA）、白细胞介素-2（IL-2）、和干扰素-γ（IFN-γ）检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；综合24项检查盘片购自天津微纳芯科技有限公司；D-半乳糖，购自江苏鹏翔生物医药有限公司；维生素E，购自成都乐美天医药科技有限公司。R35组织切片机，购自德国徕卡仪器有限公司；BZ-X一体化显微成像系统，购自基恩士 （中国） 有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅，购自上海一恒仪器有限公司；Sorvall ST8台式离心机，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UV759紫外-可见分光光度计，购自上海精密科学仪器有限公司；FA1204万分之一电子分析天平，购自上海力辰仪器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 富含羟基酪醇和玉米黄质色素橄榄油制备

取干净新鲜去核的油橄榄果粉碎后，加入质量比为1∶6的纯净水，混合均匀，在转速为16 000 r/min的条件下高速剪切，破碎10 min，形成果浆，然后在常温下压榨处理，用20 000 r/min高速离心机离心5 min，弃掉果渣，在上清液加入质量比为1∶10的硫酸钠静置25 min，再进行油水分离，得到富含羟基酪醇橄榄油^［11］。在富含高含量羟基酪醇橄榄油中添加玉米黄质色素静置24 h后，得富含羟基酪醇和玉米黄质色素功能特级初榨橄榄油，用高效液相测定橄榄油中羟基酪醇的含量为20 mg/100 g，玉米黄质色素的含量为400 mg/100 g，普通橄榄油中羟基酪醇的含量约为2.5 mg/kg，玉米黄质色素的含量为3.08 mg/kg。

1.2.2 衰老小鼠动物模型建立

参照叶文斌等^［16-17］的方法有改动，称取5 g D-半乳糖加入到质量分数为0.9%的生理盐水中，充分溶解配制成质量分数为5%溶液，4 ℃冰箱保存。将出生7周的健康小鼠60只（雌雄各30只）适应性喂养1周，随机抽选雌雄各5只小鼠作为 CK（0）组，将剩余的50只小鼠按照0.5 mL/10 g BW剂量颈部皮下注射备用的D-半乳糖溶液42 d后，观察到小鼠饮水、进食和活动量明显减少，皮毛干枯、稀疏、脱落，测定小鼠体质量和血清中SOD、CAT、GSH-Px酶活性和MAD含量，两者相比显著差异，则亚急性衰老小鼠造模成功。

1.2.3 衰老小鼠灌胃和指标的测定

将建模成功的亚急性衰老小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。1组设为模型组（Model group），1组以170 mg/kg剂量灌胃维生素E，设为阳性对照组（VE group），1组以200 mg/kg剂量灌胃普通橄榄油，设为普通橄榄油对照组（OL group），以200 mg/kg剂量分别灌胃（olive oil rich in hydroxyl tyrosol，OHT）和富含玉米黄质色素橄榄油（olive oil rich in zeaxanthin，OZT）为OHT和OZT处理组（OHT group），以200 mg/kg剂量灌胃生理盐水为CK（0）组，1次/d；连续灌胃28 d，试验观察期间小鼠自由饮食和饮水^［11］。在灌胃0、7、14、21、28 d称量体质量，28 d后将各处理小鼠放置在密闭的干燥瓶中观察小鼠活动情况，以小鼠静卧3 min为界视为缺氧表现，记录小鼠从进入到静卧前的时间为耐缺氧时间^［16-17］；参考叶文斌等^［16-17］的方法测定小鼠游泳的时间。28 d后末次灌胃后禁食不禁水12 h后，用10%水合氯醛，按照0.1 mL/20 g小鼠体质量腹腔注射，麻醉后眼眶静脉丛采血，用肝素抗凝管收集，4 ℃低温4 000 r/min，离心3 min后，收集血清依照试剂盒方法测定SOD、CAT、GSH-Px、ALT和AST活性和MAD、IL-2以及IFN-γ含量。断颈处死，进行剖检观察小鼠的肝脏，迅速固定在4%多聚甲醛溶液内，经过修块、脱水、透明、包埋后切片，37 ℃烘箱内过夜，H＆E染色，中性树胶封片后，显微镜下观察，拍照。

1.3 数据统计

试验数据分析采用SPSS 25.0软件进行，显著性分析采用One-way ANOVA中的Tukey’s多重比较进行，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 对衰老小鼠体质量的影响

对衰老小鼠体质量的影响如图1所示。衰老小鼠建模成功后，Model组小鼠与CK（0）组小鼠相比饮水和进食明显减少，活动量减少，体质量增加较慢（P<0.05）；而Model组小鼠与其他4组之间相比体质量无显著差异（P>0.05）；灌胃给药干预28 d后，所有小鼠的体质量均逐渐增加，但Model组小鼠体质量增加缓慢，与CK相比差异极显著（P<0.01），而OZT组和OHT组小鼠之间的体质量相比均存在显著差异（P<0.05），且OZT组体质量增加较快，与VE组相比无显著差异（P>0.05）。结果表明富含羟基酪醇和玉米黄质色素橄榄油均具有恢复衰老小鼠的体质量功效。

2.2 对衰老小鼠耐缺氧和抗疲劳作用的影响

对衰老小鼠耐缺氧和抗疲劳作用的影响如图2所示。Model组小鼠的耐缺氧时间和游泳时间最短，而灌胃给药干预28 d后，除CK（0）组外OL组小鼠时间最短，OHT组次之，OZT组时间最长，三者之间相比存在显著差异（P<0.05），VE组时间虽短于CK（0）组，但两者相比无差异（P＞0.05）。结果表明富含羟基酪醇和玉米黄质色素橄榄油可有效的延长衰老小鼠抗疲劳时间和常压耐缺氧时间。

2.3 对衰老小鼠抗氧化作用的影响

对衰老小鼠抗氧化作用如图3所示。建模成功的Model组小鼠血清中的SOD、CAT和 GSH-Px活性与MDA含量与CK（0）组急剧升高（P<0.01），连续灌胃给药干预28 d 后衰老小鼠血清中的SOD、CAT和GSH-Px活性和MDA含量显著降低，OL组小鼠的3种关键酶活性和MDA含量降低最缓慢，虽然 VE组的抗氧化能力优于OZT组，但两者无显著性差异（P＞0.05），OZT组的干预效果优于OHT组（P>0.05）。以上结果表明，富含羟基酪醇和玉米黄质色素橄榄油具有较好的抗氧化作用。

2.4 对衰老小鼠血清中ALT和AST活性的影响

对衰老小鼠血清中ALT和AST活性的影响如图4所示。建模成功后小鼠血清中ALT和AST的活性最高；Model小鼠灌胃给药干预28 d后，OZT组的小鼠血清中ALT和AST的活性均显著低于OL组（P<0.01）和OHT组（P<0.05），且OZT组低于VE组，但二者无显著性差异（P>0.05）。以上结果表明，富含羟基酪醇和玉米黄质色素橄榄油对衰老小鼠血清中ALT和AST活性具有很好的降低作用。

2.5 对衰老小鼠血清中细胞因子含量的影响

对衰老小鼠血清中细胞因子IL-2和IFN-γ含量的影响如图5所示。衰老小鼠建模成功后，Model组小鼠血清中IL-2和IFN-γ 含量最低，与CK（0） 组相比存在极显著差异（P<0.01），通过灌胃干预28 d后，2种血清细胞因子含量明显升高，且OZT和OHT组小鼠血清中IL-2和IFN-γ的含量均高于OL组，其中OZT高于OHT组。说明羟基酪醇和玉米黄质色素的橄榄油能有效提高小鼠的免疫应答能力。

2.6 对衰老小鼠肝组织结构的影响

小鼠肝细胞HE染色结果如图6所示。衰老Model组小鼠与CK（0） 组小鼠相比，肝脏结构异常，脏细胞排列松散，细胞结构不清晰，肝血窦消失，胞质淡染，着色不强，肝细胞索排列不规则，脂肪颗粒散见；灌胃干预28 d后，VE组小鼠肝细胞核位于中央，细胞质充盈，细胞索排列正常，血窦正常，OZT和OHT组小鼠肝细胞和肝细胞索排列整齐，肝血窦均匀散在，而OL组小鼠肝组织和部分模糊，肝血窦可见微扩，肝组织嗜酸性减弱。结果表明富含羟基酪醇和玉米黄质色素的橄榄油具有保护衰老小鼠肝脏的作用。

3 讨论

半乳糖诱导亚急性衰老小鼠是造模的经典方法^［18-19］，小鼠在D-半乳糖的诱导下，体内产生了大量的自由基，促使衰老进程加速降低抗氧化能力，体质量增加缓慢；体内血液中SOD、CAT和GSH-Px活性显著升高，而应激对应的MDA含量也显著升高^［15-16］。SOD和CAT两种酶是评价小鼠氧化损伤后的主要指标，其中SOD是细胞内负责清除超氧阴离子自由基的重要内源性抗氧化剂，是反映机体抗氧化能力的敏感指标^［18-20］，而CAT可以将过氧化氢分解成氧和水，降低过氧化氢在细胞内的水平，GSH-Px是清除细胞产生的脂质过氧化产物的主要保护酶，也是监测细胞膜完整性的重要指标^［18-20］。过多的过氧化氢和氧自由基会导致脂质过氧化，从而导致细胞损伤，这些破坏过程的最终产物就是MDA，因此MDA的含量可以直接反映机体脂质过氧化和组织过氧化损伤程度^［18-20］。半乳糖诱导小鼠应激产生大量的的MDA，而清除自由基和MDA所对应的SOD、CAT和GSH-Px活力也会随之升高，这是Model 组小鼠对D-半乳糖的诱导的特殊应激反应，所以3种抗氧化酶的异常升高就是为了清除大量氧自由基、降低MDA的含量。小鼠耐缺氧和抗疲劳作用是评价衰老小鼠恢复作用的常用手段，而且用游泳时间来进行抗疲劳的评价是科学有效的，衰老Model造模成功的小鼠身体机能发生了重大的变化，高强度的游泳和缺氧环境势必会增加衰老小鼠的生理负担，会影响肝脏脂质代谢，而ALT和AST 2种主要的酶是反映机体肝脏代谢最敏感的指标，D-半乳糖的诱导作用会影响小鼠肝脏的代谢功能，还会破坏肝细胞引起小鼠血清中的ALT和AST活性升高^［21］。本研究表明在富含羟基酪醇和玉米黄质色素分别灌胃治疗28 d后衰老小鼠ALT和AST活性水平显著降低，这说明富含羟基酪醇的橄榄油对衰老小鼠有清除堆积在肝脏的脂肪，减轻对肝脏的损伤。IL-2和IFN-γ是动物血清中各种细胞因子是构成机体免疫的重要组成部分，细胞因子之间相互协同配合共同作用于免疫应答，尤其在细胞增殖与分化和免疫球蛋白的释放等有很重要的作用，其含量水平可以直接反映动物参与体液免疫和细胞免疫的状态^［22-23］。

4 结论

通过用富含羟基酪醇和玉米黄质色素的橄榄油分别对衰老小鼠进行28 d的灌胃干预，各组都不同程度地降低了衰老小鼠的SOD、CAT和GSH-Px活性和MDA的含量，还能有效控制衰老小鼠体质量，降低了血清中的ALT和AST活性，促使IL-2和IFN-γ生成水平升高，很好地保护小鼠肝脏，而且OZT治疗最好，接近VE治疗组，明显优于OHT组和OL组。综上，富含羟基酪醇和玉米黄质色素的橄榄油对D-半乳糖致亚急性衰老动物模型有很好的治疗效果，能有效提高小鼠机体抗氧化能力并延缓衰老，是具有很好辅助治疗作用的橄榄油保健食品。

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基金资助

甘肃省科技重大专项“高品质橄榄油关键技术开发、集成示范与应用”(21ZD4NK045)

甘肃省重点研发计划项目“具有‘明目’和‘降血脂’活性的橄榄油功能食品的研发及生物功能评价”(22YF7FK220)

甘肃省高校教师创新基金项目“富含主米黄质色素橄榄油延缓D-半乳糖诱导衰老小鼠的作用研究”(2024B-335)