7种细菌性虫媒病病原体的反向线状印迹杂交检测技术的建立

Establishment of reverse line blot hybridization for detection of seven bacterial insect-borne disease pathogens

摘要

目的 建立快速高效的细菌性虫媒病的检测方法。 方法 运用反向线状印迹杂交技术（reverse line blot，RLB），通过对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、福氏志贺菌（Shigella flexneri）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）7种细菌的核糖体16S RNA进行序列比对，利用 DNAStar和 Primer premier软件设计出了用于PCR-RLB杂交反应的基因组DNA样品进行PCR扩增的通用引物（RLB-F，RLB-R），和特异性探针以及通用探针（Catch-all），通用下游引物（RLB-R）5' 端用生物素标记和探针5' 端连接氨基团（NH₂⁺）。 结果 成功建立高效、快速、特异且能同时检测7种细菌PCR-RLB的方法，并确定了通用引物最佳浓度为25 μmol/L，金黄色葡萄球菌和福氏志贺菌探针的最佳浓度分别为50 μmol/L，其他5种病原探针的最佳浓度为100 μmol/L。使用PCR-RLB检测方法，可对上述7种细菌的检测敏感性可达到10^-6~10^-11 ng/μL，远远高于PCR的10^-3~10^-8 ng/μL。 结论 首次同时对7种细菌进行检测，并确定了不同引物及探针的最佳浓度。该方法不仅提高了检测效率，同时还提高了检测的灵敏度，为开发新的检测手段提供了理论依据。

Abstract

Objective The study aimed to establish a rapid and efficient method for the detection of bacterial insect-borne diseases. Method Reverse line blot (RLB) was used to detect Staphylococcus aureus，Shigella flexneri，Aeromonas caviae，Vibrio vulnificus，Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，Proteus vulgaris，and Yersinia enterocolitica.The 16sRNA sequences were compared，and universal primers (RLB-F，RLB-R) for the PCR-RLB hybridization reaction were designed using DNA Star and Primer premier software.Specificity probes，universal probes (Catch-all)，universal downstream primers (RLB-R)，and biotin-labeled 5' end probes linked with an amino group (NH₂⁺) were developed. Result A highly efficient and rapid assay with a 25 μmol/L concentration was successfully developed for the simultaneous detection of the seven targeted bacteria.The concentrations for Staphylococcus aureus and Shigella flexneri probes were 50 μmol/L，while the other five pathogen probes had concentrations of 100 μmol/L.The sensitivity of PCR-RLB was 10^-6 to 10^-11 ng/μL，significantly higher than that of PCR (10^-3 to 10^-8 ng/μL). Conclusion This study presented the simultaneous detection of seven different bacteria for the first time using RLB.Optimal concentrations for primers and probes were determined.The developed method not only improves detection efficiency but also enhances detection sensitivity.These findings provided a theoretical basis for the development of new detection methods for bacterial insect-borne diseases.

Graphical abstract

关键词

细菌性虫媒病 / 反向线状印迹杂交技术 / PCR扩增

Key words

bacterial insect-borne diseases / reverse line blot / PCR amplification

Author summay

李雅琪，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

PCR-反向线状杂交技术（Reverse line blot，RLB）是一种敏感的高通量检测方法。1988年由Saiki等人发明并用于镰刀形细胞贫血症和β-地中海贫血的检测中，该方法原则上能区分一个碱基的差别^［1］。PCR-RLB检测方法主要通过印迹仪实施，首先将设计的带有负电荷的特异性寡核苷酸探针通过化学反应共价结合在带负电的尼龙膜（Biodyne^®C，0.45 µm）上。其次，将带有生物素标记的PCR产物高温解单链后垂直于探针的方向进行杂交。最后，将杂交结果通过化学曝光的方式显示在胶片上。

PCR-RLB结合了核酸杂交、DNA探针和酶联显色技术于一体的核酸诊断方法。1994年首次将PCR-RLB用于链球菌血清型鉴定中，由于可以简单、快速通过多个特异性寡核苷酸探针检测多个样品，因此该方法自报道以后就广泛应用于各种分子生物学检测中如：Sanguinetti等将该项技术用于结核分枝杆菌菌株的区分^［2］。Schouls等将PCR-RLB技术用于埃里希体属病原的检测与鉴别^［3］ 。Najafzadeh等人利用PCR-RLB技术鉴定真菌性疾病^［4］。向国华等人在2009年使用PCR-RLB方法检测了白色念珠菌^［5］；同时还有基于16S-23S rRNA基因内转录间隔区序列对34种分枝杆菌的PCR-RLB快速鉴定方法^［6］；王晓彦等人以PCR为基础结合反向线点杂交检测5种少见类型的奴卡菌^［7］；曾宪玉等人使用该方法检测B族溶血性链球菌^［8］；Zerihun等^［9］在2013将该方运用于埃塞俄比亚地区蜱传疾病的研究中；严冰等^［10］运用该方法检测细菌性脑膜炎。单万水等^［11］和张太松等^［12］将PCR-RLB技术应用于乙肝病毒分型和耐药突变检测中，并评价该技术在乙肝基因分型的特异性和灵敏性。PCR-RLB具有高特异性、灵敏性和准确性，现已广泛应用于各种寄生虫的鉴别、分类及基因位点突变的研究^［13-17］。

蝇类作为一种广泛的卫生害虫，可携带100多种病原微生物引起人类腹泻、食物中毒和各种细菌性疾病如霍乱、菌血症、结核病、炭疽等，造成大范围的疾病感染与传播是人类健康的重要威胁之一^［18-20］。2005年2月24日（科学时报）报道在日本蝇类传播肠出血性大肠杆菌和禽流感。蝇类作为重要的虫媒病传播媒介，自身携带或传播多种细菌性病原微生物^［21-23］，已知对人类危害较大的致病性细菌主要有金黄色葡萄球菌，该细菌会导致菌血症、感染性心内炎以及导致各种皮肤病和软组织感染^［24-25］，也是造成动物乳房炎的病原之一^［26-27］；福氏志贺菌、沙门氏菌等肠道致病菌感染人类引起严重的腹泻病^［28-30］；创伤弧菌感染人类会导致败血症和蜂窝组织炎。周广响等人在对枣庄市蝇类携带病原菌的研究中共检出304株致病菌，涵盖了19个属44个种，其中包括肠沙门氏菌肠亚种、普通变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌^［31］。在我国蝇类被列入虫媒病重点防治对象。

截至目前，细菌性虫媒病的检测主要靠传统的细菌培养分离鉴定^［32］，培养鉴定最少需要一周左右，不仅费时费力，还对实验室要求严格，需在特定的实验室内完成，严重影响检测的效率，现阶段需要研制出快速高效的检测方法用于生产实践中。

本研究将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、福氏志贺菌（Shigella flexneri）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）7种细菌的核糖体16S RNA进行序列比对，利用 DNAStar和 Primer premier软件设计出了用于PCR-RLB杂交反应的基因组DNA样品进行PCR扩增的通用引物（RLB-F，RLB-R），和特异性探针以及通用探针（Catch-all），通用下游引物（RLB-R）5' 端用生物素标记和探针5' 端连接氨基团（NH₂⁺），建立高效、快速、特异的PCR-RLB检测7种细菌的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

试验所需材料及设备详见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 标准菌株的复苏培养

研究所采用的细菌标准菌株购自上海宝生物科技有限公司，每种菌株都带有鉴定报告，具体菌株信息见表2。

本研究配制了胰蛋白胨大豆琼脂、非选择性羊血琼脂培养基，高压灭菌备用。将标准菌株包撕开，将标签上的拉片贴于培养板上。释放安瓿瓶中水合液体，垂直握住试管并轻拍，待液体流入含小球的管底，挤捏压碎小球，使其与液体混合。立即将拭子浸于水合悬液中，挤压并旋转拭子，接种于培养平板。用一无菌接种环在先前接种区域划线10-20 次，促使其分离出单菌落，将培养皿放入恒温培养箱35℃培养24~48 h。

1.2.2 标准菌株的验证及DNA提取

利用甘肃省疾病预防控制中心卫生检疫所微生物室的VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定分析系统对复苏的菌株进行鉴定。利用革兰氏阴性菌DNA提取试剂盒（ABT）提取标准菌株的DNA。

1.2.3 引物和探针的设计与合成

查阅GenBank数据库发现细菌16S RNA具有高度保守性，因此本研究将7种细菌的核糖体16S RNA进行序列比对，利用 DNAStar和 Primer premier软件设计出了用于PCR-RLB杂交反应的基因组DNA样品进行PCR扩增的通用引物（RLB-F，RLB-R），和特异性探针以及通用探针（Catch-all），并利用NCBI BLAST程序数据库对所有的引物和探针进行了特异性比对。设计的PCR通用下游引物（RLB-R）5' 端用生物素标记和探针5' 端连接氨基团（NH₂⁺）交由生物工程（上海）股份有限公司合成，具体见表3。

1.2.4 PCR扩增标准菌株

利用通用引物PCR扩增标准菌株的16S RNA序列，PCR扩增条件为：94 ℃ 5 min，（94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1.45 s）进行35个循环，72 ℃ 10 min，12 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，将凝胶置于成像系统中拍照检测。

1.3 反向线状印迹杂交（RLB）方法的建立及其条件优化

1.3.1 含有7种标准菌株特异性寡核苷酸探针 Biodyne C 膜的制备

菌株的特异性寡核苷酸探针是根据每种标准菌株的16S RNA设计。以探针5' 端连接氨基团（NH₂⁺）修饰后合成，能够通过化学反应共价结合在带负电的尼龙膜（Biodyne^®C，0.45 µm）上，将制备好的Biodyne^®C膜用保鲜膜密封，4 °C保存直至使用。

1.3.2 标准菌株PCR 产物与膜探针特异性杂交试验

利用生物素标记的PCR产物与固定在膜上的特异性寡核苷酸探针杂交，然后用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶（Streptavidin-POD-conjugate）和免疫印迹发光氨试剂（A，B）孵育后暗室曝光将结果显影在胶片上。如果胶片上的信号太弱或太强，可延长或缩短曝光时间将薄膜直接曝光于另一张胶片。杂交过的 PCR 产物可以从膜上除去。一张膜可以重复利用约 15 次。

1.3.3 探针浓度的优化试验

将工作浓度为1 000 µmol/L的探针用去离子水稀释成800、500、200、100、50、25 µmol/L浓度，进行PCR扩增和RLB试验。

1.3.4 PCR-RLB 敏感性试验

用核酸浓度仪测定标准菌株的基因组DNA含量，将其统一定量到100 ng/µL，10倍稀释至10^-12~10^-1，进行PCR扩增和PCR-RLB试验。

2 结果与分析

2.1 标准菌株的鉴定结果

VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定仪分析了8种标准菌株的生化特征，发现其中一株菌株的结果与供应商提供的信息不相符，所检测的样品为副溶血性弧菌，但结果却是典型的少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）特征，上海宝生物科技有限公司所提供的8种标准菌株中副溶血性弧菌跟鉴定结果的生化指标不相符。因此，本研究将该菌株进行灭菌处理，不作为本试验的标准菌株，本研究选取了其他7株生化指标相符、背景清晰的标准菌株作为PCR-RLB试验中的标准阳性菌株。由以上结果说明在细菌试验中，菌株的鉴定是必不可少的一步。

2.2 目的序列片段的PCR扩增

用16S RNA通用上下游引物扩增所有标准菌株，结果如图1所示，M为Marker DL 2 000，1-7泳道分别为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、福氏志贺菌（Shigella flexneri）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）。PCR扩增产物的大小约为1 100 bp，这一长度跟所设计的引物区间内的核苷酸序列是一致的。因此本研究设计的上下游通用引物成功的扩增出目的序列片段。

2.3 最佳特异性探针的确定

如图2所示，探针 S.aureus-1、S.flexneri-1、Y.enterocolitica-1均与5号样品有交叉反应，A.caviae-1、P.vulgaris-2与所有样品均未杂交反应，这5种探针不能用于PCR-RLB实验。探针S.aureus-2、S.flexneri-2、A.caviae-2、V.vulnificus、S.enterica、P.vulgaris-1、Y enterocolitica-2与各自相对应的标准阳性样品PCR产物特异性杂交可用于同时检测的7种细菌性病原微生物的反向线状印迹杂交检测方法。

2.4 探针最佳终浓度的确定

PCR-RLB检测结果是通过化学发光信号来实现的，因此探针浓度的大小直接影响了PCR-RLB检测结果的效果。因此，将稀释好的不同浓度引物用于PCR-RLB试验，按照上述步骤进行实验。结果如图3所示，金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌的最佳浓度为50 μmol/L，豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型、普通变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌的最佳浓度均为100 μmol/L。

2.5 标准菌株PCR产物与特异性探针杂交结果

通过PCR扩增7种标准菌株16S RNA序列，产生的DNA扩增产物与结合到膜上的探针进行杂交，杂交产物通过化学发光作用，在胶片上显示出一定强度的信号。由PCR-RLB试验结果图4可知，特异性寡核苷酸探针与各靶序列相结合，不同菌株之间未产生任何交叉反应，探针与相应的标准菌株结合产生清晰的化学信号。

2.6 PCR-RLB敏感性试验

将定量至100 ng/μL的标准菌株基因组DNA进行连续10倍稀释成10^-1~10^-12 ng/μL浓度，并进行PCR扩增。不同浓度的PCR产物与结合在膜上的特异性探针进行杂交反应，测得7种菌株的敏感度，结果如图5所示：金黄色葡萄球菌10^-8 ng/μL、福氏志贺菌10^-8 ng/μL、豚鼠气单胞菌10^-6 ng/μL、创伤弧菌10^-6 ng/μL、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型10^-11 ng/μL、普通变形杆菌10^-6 ng/μL、小肠结肠炎耶尔森菌10^-11 ng/μL。而传统的PCR敏感性如图6所示，依次为金黄色葡萄球菌10^-4（图6-A）、福氏志贺菌10^-2（图6-B））、豚鼠气单胞菌10^-4（图6-C）、创伤弧菌10^-4（图6-D）、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型10^-7（图6-E）、普通变形杆菌10^-4（图6-F）、小肠结肠炎耶尔森菌10^-3 ng/μL（图6-G）。由此结果可知，PCR-RLB的敏感性明显高于PCR。

3 讨论

传统的细菌性虫媒病的检测主要是细菌培养分离鉴定，耗时长，对实验环境要求严格，具有很大的限制性，严重影响虫媒病的防治。据WHO报告，近年来细菌病在全球各地爆发，如2008年4月，美国43个州和首都华盛顿哥伦比亚特区发生圣保罗沙门菌暴发事件，实验室报告确诊病例超过1 400例；2008年7月，丹麦暴发15年来最大规模的沙门菌病疫情，全国有3 000~4 000人受到感染；2014年10月，德国的大肠杆菌爆发性感染事件等^［33］。这一系列细菌病的爆发均与蝇类的传播有密切的关系。因此，如何快速高效的检测虫媒细菌性疾病成为当前虫媒病防治的一大热门领域。

本研究将7种背景清晰的标准菌株的16S RNA基因序列进行序列比对，成功的设计了通用引物和探针，以及特异性寡核苷酸探针。利用通用引物进行PCR扩增，成功扩增出了所有菌株的目的序列，并成功筛选出了针对目的基因序列的特异性探针S.aureus-2、S.flexneri-2、A.caviae-2、V.vulnificus、S.enterica、P.vulgaris-1、Y enterocolitica-2，成功建立了PCR-RLB同时检测7种细菌的方法。将10倍稀释的不同浓度的PCR扩增产物进行敏感性试验，7种菌株的敏感度分别为金黄色葡萄球菌10^-8 ng/μL、福氏志贺菌10^-8 ng/μL、豚鼠气单胞菌10^-6 ng/μL、创伤弧菌10^-6 ng/μL、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型10^-11 ng/μL、普通变形杆菌10^-6 ng/μL、小肠结肠炎耶尔森菌10^-11 ng/μL，PCR敏感性分别为金黄色葡萄球菌10^-4 ng/μL、福氏志贺菌10^-2 ng/μL、豚鼠气单胞菌10^-4 ng/μL、创伤弧菌10^-4 ng/μL、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型10^-7 ng/μL、普通变形杆菌10^-4 ng/μL、小肠结肠炎耶尔森菌10^-3 ng/μL。由此可见PCR-RLB的敏感度远高于PCR。

本研究使用购自上海宝生物的标准阳性菌株进行了VITEK生化鉴定，该公司提供的副溶血性弧菌菌株信息与实际检测的生化指标有很大差异，因此该菌株不能作为阳性标准菌株用于PCR-RLB试验中。该结果进一步证明了细菌试验中对于长期保存的阳性菌株或购买的标准菌株作为实验标准品时，必须要进行菌株生化指标的鉴定来确定菌株是否出现变异等情况。综上所述本研究成功建立了高特异性和敏感性的PCR-RLB同时检测7种菌株的检测方法。这种大通量的检测方法省时省力，制备的含有特异性寡核苷酸探针膜可以反复使用，有效的缩短了细菌感染诊断所需时间，为蝇传细菌病防控提供有力的技术支持。然而，RLB技术是本研究团队自国外引进的，由于其原理是退火单链结合到膜上显示结果，因此无法将单链从膜上分离进行测序，故存在假阳性问题，本研究严格设计筛选高特异性的探针尽量避免假阳性的出现。该问题国内外至今还没研究出有效的解决方案，这一问题也将成为今后研究的重点方向。

4 结论

本试验成功建立高效、快速、特异且能同时检测7种细菌PCR-RLB的方法，并确定了通用引物最佳浓度为25 μmol/L。该方法不仅提高了检测效率，同时还提高了检测的灵敏度，并为开发新的检测手段提供了理论依据。

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基金资助

甘肃农业大学学科建设专项基金项目(GUA-XKJS-2018-073)

甘肃省科技厅重点研发项目(18YF1FA080)

国家自然科学基金项目(32160843)

甘肃省现代丝路寒旱农业科技支撑项目(GSLK-2021-18)

甘肃省科技厅国际合作项目(144WCGA169)

甘肃农业大学青年导师基金项目(GAU-QDFC-2020-11)

甘肃省自然科学基金项目(18JR3RA167)

甘肃农业大学人才专项经费项目(2017RCZX-11)