不同品种（系）马铃薯源葡萄糖培养基对腐生真菌的培养效果

Effect of potato dextrose agar medium （PDA）from different varieties（lines）on saprophytic fungi growth

摘要

目的 以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）为供试材料，筛选适合作为腐生真菌马铃薯葡萄糖培养基（potato dex-trose agar，PDA）原料的马铃薯品种。 方法 选用15个不同品种（系）的马铃薯，以商品PDA培养基为对照，初筛对比不同品种（系）马铃薯制备的PDA培养基上尖孢镰刀菌菌丝生长速度和产孢量；验证初筛得到的马铃薯品种（系）是否适宜其他镰刀菌株的生长。 结果 初筛得到马铃薯品种（系）17W-12和大西洋制备的PDA培养基对尖孢镰刀菌菌丝生长速度和产孢量的支持效果最好，菌丝密度、均匀度、边缘整齐度都优于其他品种（系）和商品PDA培养基；陇薯7号和青薯9号制备的PDA培养基表现较差。4种镰刀菌在大西洋品种制备的PDA培养基上生长速度和产孢量均显著高于其他处理组。与青薯9号制备的PDA培养基相比，在大西洋制备的PDA培养基上培养7 d，４种镰刀菌（尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌、茄病镰刀菌、三线镰刀菌）的菌丝平均生长速度分别增加了243.73%、243.75%、171.92%、126.28%，产孢量分别增加了18.59倍、4.49倍、1.27倍、2.19倍；与商品PDA培养基相比，在大西洋制备的PDA培养基上培养7 d，４种镰刀菌（尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌、茄病镰刀菌、三线镰刀菌）的菌丝平均生长速度分别增加了74.53%、78.33%、178.60%、145.09%，产孢量分别增加了6.57倍、2.14倍、24.64倍、1.57倍。 结论 大西洋是全世界广泛栽培的加工型马铃薯经典品种，可作为PDA培养基的优选原料使用。

Abstract

Objective Fusarium oxysporum，Fusarium avenaceum，Fusarium solani and Fusarium tricinctum were used as test materials for the screening of potato species suitable for use as saprophytic fungal potato glucose medium (potato dex-trose agar，PDA). Method Fifteen different potato varieties (lines) were selected and commercial PDA medium was used as the control group to compare the growth rate and spore production of F.oxysporum mycelia on PDA medium made from different potato varieties; on this basis，the suitability of the potato varieties(lines) for the growth of other Fusarium strains was further verified. Result The potato varieties (lines) 17W-12 and Atlantic PDA media were the most effective in supporting the growth rate and sporulation of F.oxysporum mycelium，and the mycelial density，uniformity and edge neatness were better than those of other varieties (lines).PDA medium of Longshu 7 and Qingshu 9 showed the worst performance.The growth rate and spore production of the four Fusarium species were significantly higher in the PDA medium of Atlantic than in the other treatment groups: compared with the PDA medium of Qingshu 9，cultured on Atlantic PDA medium for 7 days，the average mycelial growth rate of 4 Fusarium (F.oxysporum，F.avenaceum，F.solani and F.tricinctum) increased by 243.73%，243.75%，171.92%，and 126.28%，respectively.Sporulation yield increased 18.59 times，4.49 times，1.27 times and 2.19 times，respectively.Compared with commercial PDA medium，cultured on Atlantic PDA medium for 7 days，the average mycelial growth rate of 4 Fusarium(F.oxysporum，F.avenaceum，F.solani and F.tricinctum) increased by 74.53%，78.33%，178.60%，and 145.09%，respectively.The sporulation yield increased 6.57 times，2.14 times，24.64 times and 1.57 times，respectively. Conclusion Atlantic is a classic variety of processed potato widely cultivated around the world and can be used as a preferable raw material for PDA medium.

Graphical abstract

关键词

马铃薯品种（系） / 培养基 / 腐生真菌 / 菌丝生长速度 / 产孢量

Key words

potato varieties (lines) / medium / saprophytic fungi / mycelial growth rate / spore production

Author summay

王英，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

马铃薯葡萄糖培养基（potato dex-trose agar，PDA）是以马铃薯为主要原料的实验室基础培养基，被广泛用于酵母菌、霉菌及蘑菇等真菌的培养^［1］。Lazarev Vladimir S^［2］在PDA培养基上研究了真菌Fomitopsis pinicola（Sow.ex Fr.）Karst.重组菌丝体培养物的相互作用；丁浩等^［3］将PDA培养基制作方法改进为打浆的方式，并优化浓度，酵母检出率提高了67.2%；鲁任翔等^［4］选用马铃薯葡萄糖培养基分离纯化水蜜桃果腐病病原真菌；史红鸽等^［5］在常规PDA培养基上添加细木屑对香菇菌种起到了一定的复壮作用。可见，PDA培养基在真菌活化和培养方面起着非常重要的作用。本实验室在前期开展兰州百合枯萎病病原型连作障碍研究时，在致病镰刀菌培养过程中发现菌株在不同马铃薯品种制备的培养基上长势和生长速度存在较大差异，不同品牌、不同批次的商品PDA培养基的培养效果也存在差异，对试验结果的稳定性及可重复性造成了一定的影响。马铃薯营养丰富，可提供真菌生长所需要的碳源、氮源、营养元素和无机盐^［6］。目前，已有关于马铃薯皮培养基^［7］、当季现配马铃薯培养基^［8］、发芽马铃薯培养基^［9］等对真菌培养效果的研究，而对于不同品种（系）制备的马铃薯葡萄糖培养基对真菌的培养效果研究甚少。

马铃薯是全世界广泛种植的大宗农作物^［10］，其品种类型十分丰富，如淀粉型品种、加工型品种、菜用型品种等^［11-13］。马铃薯块茎除含淀粉和蛋白质外，还富含维生素、氨基酸、K、Ca、Mg、P和酚类化合物等营养元素^［14］，不同品种的马铃薯其淀粉、可溶性糖、蛋白质、矿物质都存在显著差异^［15］。甘肃省是全国马铃薯生产大省，马铃薯新品种培育和良种繁育工作在全国领先，栽培品种类型十分丰富^［16］。基于此，笔者选用全世界广泛栽培的马铃薯经典品种、甘肃省种植的马铃薯地方品种以及育成品系作为试验材料，以兰州百合4个枯萎病致病镰刀菌为供试菌种，研究腐生真菌在PDA培养基上的生长差异性，以期在不同品种（系）马铃薯中筛选出适宜腐生真菌生长的PDA培养基原料，为提高腐生真菌的培养效率和开发新的马铃薯产品提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

4种镰刀菌（保存于甘肃农业大学园艺学院实验室-20 ℃冰箱中）分别为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）。

1.1.2 马铃薯品种（系）

大西洋、陇薯3号、陇薯7号、陇薯9号、陇薯10号、陇薯12号、陇薯14号、陇薯15号、陇薯16号、新大坪、14W-3、17W-12、青薯9号、V7、希森6号，以上马铃薯品种（系）由甘肃省农业科学院马铃薯所和定西市农业科学研究院提供。

1.2 培养基制备

商品PDA培养基（Solarbio P8931马铃薯葡萄糖琼脂培养基，北京索莱宝科技有限公司）：按照使用说明书配置，加热溶化后分装至三角瓶后封口，放入高压灭菌锅（GR60DA全自动高压灭菌器，致微（厦门）仪器有限公司）内，121 ℃灭菌20 min后备用。

传统PDA培养基制备方法：不同品种（系）的马铃薯洗净去皮，称取20 g切成小块，加入100 mL新鲜蒸馏水煮烂（20 min）左右，用6层纱布过滤后收集滤液，2 g琼脂，2 g葡萄糖，搅拌均匀，补足水分至100 mL。pH为自然值，121 ℃灭菌20 min后备用。

1.3 供试菌株活化及培养

将灭菌后的培养基充分混匀后，分装至直径为9 cm培养皿中，每个培养皿加入20 mL培养基。待冷却至凝固状态时，无菌条件下，将-20 ℃保存的供试菌株用直径为4 mm的灭菌打孔器，在菌落边缘打取菌饼，用镊子将菌饼接种于含培养基的平板中央，盖上皿盖，封口倒置，于28 ℃恒温培养箱中暗培养7 d。

1.4 研究方法

1.4.1 不同马铃薯品种（系）PDA培养基对尖孢镰刀菌的培养效果

本研究采用单因素完全随机试验设计，以商品PDA培养基为对照组（CK），15个马铃薯品种（系）为各试验处理，分别为T₁（大西洋）、T₂（陇薯3号）、T₃（陇薯7号）、T₄（陇薯9号）、T₅（陇薯10号）、T₆（陇薯12号）、T₇（陇薯14号）、T₈（陇薯15号）、T₉（陇薯16号）、T₁₀（新大坪）、T₁₁（14W-3）、T₁₂（17W-12）、T₁₃（青薯9号）、T₁₄（V7）、T₁₅（希森6号）。每处理3次重复。

参考赵秉浩、韩星等^［17-18］方法。将尖孢镰刀菌接种于15个不同品种（系）的平板培养基中，28 ℃恒温暗培养7 d，拍照记录菌落形态。自第3 天开始每隔24 h用游标卡尺（宁波旗辰仪器有限公司）十字形测定菌落直径，计算菌丝生长速度。每处理3次重复。

菌丝生长速度（mm/d）=菌落直径（mm）/培养时间（d）

参考王文珠、牟晓玲等^［19-20］方法。第8天时测其产孢量，将培养至第8天的尖孢镰刀菌用载玻片将菌丝刮下置于锥形瓶中，用移液枪吸取20 mL无菌水稀释（以上步骤在无菌操作台完成）放置摇床摇10 min，从中吸取200 μL孢子悬浮液置于血球计数板的计数室内，盖上盖玻片，静置约5 min，观察并计数。每处理3次重复。

产孢量（个/mL）=（所测孢子数/80）×400×10 000×稀释倍数

1.4.2 代表性马铃薯品种（系）PDA培养基对4种镰刀菌的培养效果

为进一步验证不同品种（系）制备的PDA培养基对腐生真菌的培养效果。根据1.4.1的研究结果，从中选择1个优良品种（大西洋，T₁），3个一般品种（陇薯10号，T₂；新大坪，T₃；希森6号，T₄）和1个较差品种（青薯9号，T₅）作为代表性马铃薯品种（系），以商品PDA培养基为对照组（CK），接种4个镰刀菌株（尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌、茄病镰刀菌、三线镰刀菌）于代表性品种（系）PDA培养基上，28 ℃恒温暗培养7 d，测量菌落直径，计算菌丝生长速度和产孢量。测定指标及具体方法同1.4.1。

1.5 数据分析

数据采用Excel 2010整理，Origin 2018软件绘图，利用SPSS 22.0软件处理和分析数据。

2 结果与分析

2.1 不同马铃薯品种（系）PDA培养基对尖孢镰刀菌的影响

2.1.1 不同马铃薯品种（系）PDA培养基对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

由表1和图1可知，尖孢镰刀菌在不同马铃薯品种（系）PDA培养基上生长具有显著差异性（菌丝生长周期为7 d）。其中，T₁、T₂处理组菌丝长势最好，菌丝浓密且均匀，菌落边缘整齐；CK、T₂、T₅、T₁₁处理组菌丝长势一般，菌丝较浓密且较均匀；其余处理菌丝长势慢，菌丝密度一般或稀疏且不均匀，菌落边缘不整齐。

由图2可知，不同马铃薯品种（系）PDA培养基对尖孢镰刀菌菌丝平均生长速度有显著影响。15个品种（系）中，T₁、T₁₂处理组菌丝平均生长速度最快，两者差异不显著；T₃、T₄、T₁₃处理组菌丝平均生长速度较慢；与T₃相比，T₁、T₁₂处理组菌丝平均生长速度分别增加了367.94%、379.43%；与CK相比，T₁、T₁₂处理组菌丝平均生长速度分别增加了73.71%、77.98%，与CK相比，T₃、T₄、T₁₃处理组菌丝平均生长速度分别减少了62.88%、59.86%、60.21%。

2.1.2 不同马铃薯品种（系）PDA培养基对尖孢镰刀菌产孢量的影响

由图3可知，不同马铃薯品种（系）PDA培养基对尖孢镰刀菌产孢量有显著影响。15个品种（系）中，T₁、T₁₂处理组产孢量较多，T₃、T₁₃处理组产孢量较少；与T₃相比，T₁、T₁₂处理组产孢量分别增加了35.64倍、37.4倍；与CK相比，T₁、T₁₂处理组产孢量分别增加了7.5倍、7.91倍。

2.2 代表性马铃薯品种（系）PDA培养基对4种镰刀菌培养效果的研究

2.2.1 各处理对4种镰刀菌菌丝生长速度的影响

由图4可知，代表性马铃薯品种（系）PDA培养基对4种镰刀菌菌丝平均生长速度有显著影响。5个品种（系）中，4种菌株在T₁处理组菌丝平均生长速度最快，在T₅处理组菌丝平均生长速度最慢；图4-A中，与T₅相比，T₁处理组菌丝平均生长速度增加了243.73%，与CK相比，T₁处理组菌丝平均生长速度增加了74.53%，与CK相比，T₅处理组减少了49.23%；图4-B中，与T₅相比，T₁处理组菌丝平均生长速度增加了243.75%，与CK相比，T₁处理组菌丝平均生长速度增加了78.33%，T₅处理组平均生长速度减少了48.12%；图4-C中，与T₅相比，T₁处理组菌丝平均生长速度增加了171.92%，与CK相比，T₁处理组菌丝平均生长速度增加了178.60%，T₅处理组与CK无显著差异；图4-D中，与T₅相比，T₁处理组菌丝平均生长速度增加了126.28%，与CK相比，T₁处理组菌丝平均生长速度增加了145.09%，T₅处理组与CK无显著差异。

2.2.2 各处理对4种镰刀菌产孢量的影响

由图5可知，代表性马铃薯品种（系）PDA培养基对4种镰刀菌产孢量有显著影响。5个品种（系）中，4种菌株在T₁处理组产孢量最多，在T₅处理组产孢量最少；图5-A中，与T₅相比，T₁处理组产孢量增加了18.59倍；与CK相比，T₁处理组产孢量增加了6.57倍，T₅处理组与CK无显著差异；图5-B中，与T₅相比，T₁处理组产孢量增加了4.49倍；与CK相比，T₁处理组产孢量增加了2.14倍，T₅处理组与CK无显著差异；图5-C中，与T₅相比，T₁处理组产孢量增加了1.27倍；与CK相比，T₁处理组产孢量增加了24.64倍，与CK相比，T₅处理组增加了10.32倍；图5-D中，与T₅相比，T₁处理组产孢量增加了2.19倍；与CK相比，T₁处理组产孢量增加了1.57倍，T₅处理组与CK无显著差异。

3 讨论

本研究结果表明，品种（系）17W-12和大西洋制备的PDA培养基培养的尖孢镰刀菌菌丝浓密度、均匀度、菌落边缘整齐度、菌丝长势长速和产孢量是所有品种（包括商品PDA培养基）中最出色的；其次，品种（系）陇薯（3号、10号、14号）、新大坪、14W-3、V7、希森6号制备的PDA培养基培养的尖孢镰刀菌菌丝长势长速和产孢量较品种（系）17W-12和大西洋弱，但优于商品PDA培养基；陇薯7号和青薯9号制备的PDA培养基尖孢镰刀菌培养效果不佳。同时，在代表性马铃薯品种（系）对4种镰刀菌的对比试验中，再次验证了品种大西洋制备的PDA培养基对尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌、茄病镰刀菌、三线镰刀菌的菌丝生长速度和产孢量支持效果最好；品种青薯9号制备的PDA培养基上尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌、茄病镰刀菌、三线镰刀菌的菌丝生长速度和产孢量效果均不佳。

按照品种（系）用途分类，大西洋、青薯9号、陇薯7号分别属于食品加工型、高淀粉加工型、全粉加工型品种^［21-22］；有研究表明，大西洋还原糖含量（0.1%）显著低于青薯9号（0.2%）和陇薯7号（0.18%），大西洋干物质含量（27.44%）高于青薯9号（22.35%）和陇薯7号（25.2%）^{［23，25］}，由此推测营养成分及含量的差异可能是影响PDA培养基对镰刀菌培养效果的因素之一^［26-27］。另外，17W-12品系对尖孢镰刀菌培养效果良好，该品系是定西市农业科学研究院育成品系，其品质测定正在研究中，本研究可为其品质评价以及在生产上推广应用提供一定的参考。

林先锋等^［8］研究表明，米根霉、黑曲霉和酒精酵母在当季马铃薯现配PDA培养基上生长更快，酶活力更高，而在商品化速成PDA培养基上生长速度较慢，培养效果较差；这与本研究中商品PDA培养基对4种镰刀菌菌丝生长速度和产孢量的支持效果显著低于大西洋制备的PDA培养基结果类似。

4 结论

不同品种（系）PDA培养基对腐生真菌培养效果有显著差异。大西洋PDA培养基培养的腐生真菌菌丝长势长速、产孢量均显著优于其他品种和商品PDA培养基，是马铃薯PDA培养基的优选原料。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31860549)

旱地马铃薯绿色覆盖保墒技术集成与示范项目(2022CYZC-48-1)

通渭县马铃薯绿色覆盖保墒技术集成与示范项目(20220913000005)

食用百合功能微生物菌剂创制与绿色生产关键技术集成应用项目(22YF7NA108)