盐生草HgWRKY19和HgWRKY23基因的克隆及表达分析

Cloning and expression analysis of HgWRKY19 and HgWRKY 23 genes in Halogeton glomeratus

摘要

目的 WRKY转录因子在响应植物逆境胁迫过程中发挥重要的生物学功能。克隆盐生草（Halogeton glomeratus）HgWRKY19和HgWRKY23转录因子，分析其亚细胞定位及表达模式，为进一步探究其在盐胁迫响应中的分子机制奠定基础。 方法 基于盐生草全长转录组数据，采用RT-PCR法克隆得到HgWRKY19和HgWRKY23全长序列，通过烟草瞬时转化试验明确其亚细胞定位，并使用qRT-PCR方法分析其在不同盐胁迫时间下（0、6、24和48 h）盐生草叶片和根系中的相对表达量。 结果 成功克隆得到HgWRKY19和HgWRKY23基因，分别编码389和378个氨基酸；其编码蛋白均包含1个典型的WRKYGQK保守结构域和C₂H₂型（CX₅C₂₃HXH）的锌指结构，具碱性、不稳定性、亲水性、无信号肽和跨膜结构等特征；有65个磷酸化位点；二级结构预测均以无规则卷曲占比最大。系统进化分析发现HgWRKY19和HgWRKY23与藜麦、菠菜、甜菜头等藜科草本植物的WRKY蛋白同源性最高。亚细胞定位显示二者主要在细胞核和细胞膜中表达。qRT-PCR分析表明HgWRKY19和HgWRKY23主要在根系表达，具组织特异性，且表达量均在盐胁迫24 h达到峰值。 结论 HgWRKY19和HgWRKY23编码蛋白具典型的WRKY家族结构特征，属于Ⅱd亚类WRKY蛋白，进化高度保守，定位于细胞核和细胞膜上。HgWRKY19和HgWRKY23在根系中受盐胁迫诱导表达，且在不同胁迫时间下表达量差异显著（P<0.05），推测其在盐胁迫响应中发挥重要作用。

Abstract

Objective TheWRKY transcription factor has an important biological function in response to plant stress.The transcription factors HgWRKY19 and HgWRKY23 of Halogeton glomeratus were cloned，followed by analysis of their subcellular localization and expression patterns to provide a basis for further elucidation of their molecular mechanisms in response to salt stress. Method From the full-length transcriptome data of H.glomeratus，the full-length sequences of HgWRKY19 and HgWRKY23 were cloned by the method of RT-PCR，and their subcellular localization was carried out by the transient transformation test of tobacco leaves.Their relative expression levels in leaves and roots of H.glomeratus were then determined by qRT-PCR under different salt stress times (0，6，24 and 48 h). Result The HgWRKY19 and HgWRKY23 genes，encoding 389 and 378 amino acids，were successfully cloned.Their encoded proteins all contained a typical WRKYGQK conserved domain and a zinc finger structure of the C2H2 type (CX5C23HXH) and were characterized by alkaline，unstable，hydrophilic，no signal peptide and transmembrane structure.There were 65 phosphorylation sites.，and the secondary structure was dominated by random curls.Based on phylogenetic analysis，HgWRKY19 and HgWRKY23 had the highest homology with the WRKY protein of Chenopodium quinoa，Spinacia oleracea，Beta vulgarissubsp.Vulgaris and other herbs of Chenopodiaceae.Subcellularly，HgWRKY19 and HgWRKY23 were mainly expressed in the nucleus and cell membrane.The qRT-PCR results indicated that HgWRKY19 and HgWRKY23 were mainly expressed in the root system with tissue specificity，and the expression levels reached the peak at 24 h after salt stress. Conclusion HgWRKY19 and HgWRKY23 have typical structural features of the WRKY family and belong to the Ⅱd subclass of WRKY proteins.They are highly conserved during evolution and are localized in the nucleus and cell membrane.The expressions of HgWRKY19 and HgWRKY23 genes were induced by salt stress in roots，and the expression levels of them were significantly different at different stress times，suggesting that they play an important role in salt stress response.

Graphical abstract

关键词

盐生草 / 盐胁迫 / 基因克隆 / 亚细胞定位 / 表达分析

Key words

Halogeton glomeratus / salt stress / gene cloning / subcellular localization / expression analysis

Author summay

徐晓芸，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

土壤盐渍化严重制约植物的生长发育，是造成生态环境问题和限制全球农业发展的重要因素^［1］，而培育耐盐作物新品种是目前解决盐渍区农业生产问题的一种有效且低成本的方法。近年来随着人工固沙植被种植年限的增加，Na⁺、HCO^3-、Cl^-和SO₄^2-等盐分在土壤表层大量聚集^［2］，多数植物难以生存和扩张，而一年生草本植物却逐渐成为草本层的优势种群。盐生草（Halogeton glomeratus）为广布于我国甘肃、青海和内蒙等盐碱地的一年生藜科（Chenopodiaceae）草本植物，也是我国西北旱区特有的抗旱耐盐先锋植物^［3］。高度肉质化的叶片使盐生草具有适应高温、干旱及盐碱等逆境的特性，多分枝的茎使其具防风固沙和水土保持的能力，同时，盐生草又是金属矿区的优势种，即使在土壤Ni²⁺和Cu²⁺超标率达70%和57%的“镍都”金昌仍长势良好^［4］。研究发现，土壤盐分大量富集在盐生草的贮水组织细胞内，进一步区隔化在液泡中，从而保持了细胞质中的Na⁺浓度处于较低水平，使细胞代谢活动在盐胁迫下可以正常运行^［5］。因此，挖掘盐生草耐盐基因并将其应用于作物遗传育种，对耐盐种质改良与创新具有重要意义。

WRKY转录因子是植物信号网络的重要组成部分，可作为激活因子或阻遏因子参与各种细胞质和细胞核过程，包括从细胞器或细胞质到细胞核的信号传递事件^［6］，进而调控植物对生物和非生物刺激的许多反应过程，参与协调发育过程的内部信号。WRKY蛋白因其标志性的DNA结合序列而得名，具有高度保守的N端WRKYGQK七肽基序和C端锌指状基序C₂H₂（CX_4-5CX_22-23HXH）或C₂HC（CX_4-5CX_23-24HXC）^［7］，对结合靶基因启动子中的W-box（TTGACC/T）顺式元件至关重要。WRKY基因家族的进化通过多次基因复制产生，根据WRKY保守域的数量和锌指结构类型可以将其划分为三类^［8］，其中第Ⅰ类的C端WRKY保守域被认为是II和III类的原始祖先，早在原生生物蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）和盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum），以及莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中便发现了具有2个WRKY结构域的WRKY-like基因^［6］。随着测序技术的不断深入，在不同种类的植物中陆续发现与鉴定到WRKY家族成员，其中拟南芥（Arabidopsis thaliana）有74个^［9］、籼稻（Oryza sativa subsp.indica）101个^［10］、大麦（Hordeum vulgare）86个^［11］、胡萝卜（Daucus carota）95个^［12］、萝卜（Raphanus sativus）126个^［13］、藜麦（Chenopodium quinoa）92个^［14］、菠菜（Spinacia oleracea）48个^［15］等。

相关研究表明，WRKY转录因子在植物生长发育和逆境胁迫的响应中具有重要的生物学功能。苹果MdWRKY9通过抑制油菜素类固醇（BR）的形成，从而正向调控植株的矮化发育^［16］；过表达野大豆GsWRKY25的拟南芥株系在干旱胁迫下表现出低失水率、低气孔密度和较强的干耐受性^［17］；桃树PpWRKY转录因子对萜类、黄酮类次生代谢物的合成起正调控作用，进而增强植株抗性，参与植物的抗病反应^［18］。在盐胁迫响应过程中，苦荞麦（Tartary buckwheat）WRKY4过表达拟南芥，通过清除ROS表现出对盐胁迫的耐受性提高^［19］；毛竹（Phyllostachys edulis）PeWRKY83通过调节胁迫诱导的ABA合成基因表达，在响应盐胁迫中发挥重要作用^［20］；金柑（Fortunella crassifolia）FcWRKY40参与ABA信号通路，并通过调节参与离子稳态和脯氨酸生物合成的基因，作为正调控因子发挥耐盐作用^［21］。而盐生草作为研究抗旱耐盐特性的重要野生资源，关于其WRKY转录因子耐盐机制的研究却未见报道。

基于此，本研究拟从盐生草根系中克隆盐生草HgWRKY19和HgWRKY23基因，利用生物信息学方法对其编码蛋白进行初步解析，结合亚细胞定位和qRT-PCR技术分析其响应盐胁迫的细胞部位及表达模式，以期为盐生草WRKY基因的功能鉴定奠定基础，为作物耐盐性遗传改良提供基因资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料的培养和处理

试验所用的盐生草种子采收自甘肃省会宁县盐碱地区。选取均匀饱满的盐生草种子点播于沙子和蛭石体积比为2∶1的混合介质中，置于空气相对湿度为60%的人工气候室培养，白色荧光灯光照强度为300 μmol/（m²·s），光照16 h（25℃）/黑暗8 h（18 ℃）。期间以1/2 Hoagland’s营养液供给养分，待两个月后使用200 mmol/L NaCl溶液进行盐胁迫处理，分别在胁迫0、6、24和48 h后采集其叶片和根系，3次生物学重复，将样品迅速置于液氮中速冻，后续保存到-80 ℃超低温冰箱用于提取RNA。

1.2 盐生草总RNA的提取

使用RNA Simple Total RNA Kit（TIANGEN，北京）提取上述样品的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳分析其完整性，并通过超微量紫外分光光度计（DNA/Proteins Analyzer P100+，美国）测量其浓度及纯度。运用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN，北京）反转录得到cDNA第一链。以上试验操作均参照试剂盒的说明书进行。

1.3 HgWRKY19和HgWRKY23基因克隆

根据基因序列设计特异性扩增引物（表1），上述cDNA稀释后作为模板进行PCR扩增，总反应体系为25 μL：Green Taq Mix 12.5 μL、ddH₂O 9.5 μL、正反向引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA（100 ng/μL） 1 μL，扩增程序为：94℃ 4 min，94℃ 50 s、退火50 s、72 ℃ 90 s，循环35次，72 ℃ 10 min，其中HgWRKY19和HgWRKY23的退火温度分别为60.6 ℃和58.0 ℃。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测和纯化回收，16 ℃条件连接克隆载体pMD^TM19-T Vector，热激法转化DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选及单克隆摇菌后进行PCR检测，选取5个阳性菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.4 HgWRKY19和HgWRKY23基因生物信息学分析

首先通过在线网站ExPASy-Translate tool（https：//web.expasy.org/translate/）分别对盐生草HgWRKY19和HgWRKY23的核苷酸序列进行氨基酸翻译并预测其CDS区。蛋白质的理化性质采用在线软件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）预测分析；保守结构域分析使用在线网址NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；蛋白二级和三级结构分别使用在线工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：// swissmodel.expasy.org/interactive）完成；信号肽和跨膜结构的预测分别使用SignalP-5.0（http：//www.detaibio.com/tools/index.php？r=signal-peptide%2Findex）和TMHMM（http：// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；亲疏水性分析和磷酸化位点信息的预测由ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）和Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/）完成。通过在线程序NCBI-blast寻找与HgWRKY19和HgWRKY23转录因子同源性较高的蛋白，利用DNAMAN 9.0进行其保守域的多序列比对，MEGA 7.0构建各同源蛋白的系统进化树。

1.5 HgWRKY19和HgWRKY23基因亚细胞定位

本研究以pCAMBIA1300-35s-EGFP为表达载体，分别选择BamH Ⅰ和Xba Ⅰ、Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ作为HgWRKY19、HgWRKY23基因的上下游限制性内切酶，同时加入相应的保护性碱基来设计用于亚细胞定位的特异引物（表1）。目的基因克隆的步骤同1.3，使用对应的限制性内切酶分别对检测成功的菌液质粒和载体质粒双酶切，T4 DNA连接酶分别连接胶回收成功的各基因片段和表达载体，连接产物再次转化大肠杆菌DH5α，提取阳性菌液质粒。重组质粒经双酶切验证后，采取冻融法（冰浴5 min、液氮速冻5 min、37 ℃水浴5 min、冰浴5 min）转化农杆菌感受态细胞EHA105，涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的LB固体培养基中，最后经菌液PCR和测序，于-80 ℃冰箱中保存转化成功的菌种。取上述农杆菌菌液制备重悬液，注射在烟草叶片下表皮，瞬时转染本氏烟草。以空载体pCAMBIA1300-35s-EGFP为对照，暗培养2~3 d后，在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM 800，德国）下观察绿色荧光信号的分布状况，具体方法参照彭亚萍^［22］。

1.6 盐胁迫下HgWRKY19和HgWRKY23基因的表达

基于盐生草全长转录组数据得到HgWRKY19和HgWRKY23基因的核苷酸序列，运用NCBI Primer-BLAST在线软件设计qRT-PCR特异性引物（表1），以盐生草Actin基因^［23］作为内参，使用SuperRealPreMix Plus （SYBR Green）（TIANGEN，北京）进行qRT-PCR反应，设置3次技术重复。反应总体系20 μL，具体为：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL、cDNA模板（80 ng/μL）1 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、RNase-free ddH₂O 7.4 μL。反应程序采用两步法：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火32 s，40个循环。基因的相对表达量使用2^-△△Ct公式计算^［24］。

1.7 数据处理

使用 Microsoft Excel 2016对试验数据进行统计作图，利用SPSS 17.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 HgWRKY19和HgWRKY23基因的克隆

以盐生草根系cDNA为模板，经PCR扩增得到与目标基因大小相近的条带（图1），纯化后连接克隆载体pMD^TM19-T Vector，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，菌液PCR鉴定为阳性菌。测序后使用DNAMAN 9.0进行序列比对，同源性达100%，长度分别为1 595 bp和1 533 bp，表明成功克隆到2个盐生草耐盐候选基因。

2.2 HgWRKY19和HgWRKY23基因的生物信息学分析

2.2.1 保守结构域和理化性质分析

在线工具ORF finderf分析表明，HgWRKY19和HgWRKY23基因的最大开放阅读框分别位于84~1 253 bp和123~1 259 bp，编码389和378个氨基酸。保守结构域分析发现2个WRKY蛋白均具有典型的N端WRKYGQK保守域和C端锌指结构域（CX₅CX₂₃HXH）（图2-A，图3-A）。ProtParam在线工具分析盐生草WRKY转录因子的理化性质表明，HgWRKY19和HgWRKY23编码蛋白的分子量分别为42 129.4和40 884.68 Da，理论等电点是9.56和9.60，均属于碱性蛋白；分子式为C₁₈₀₃H₂₉₁₀N₅₄₄O₅₈₀S₂₀和C₁₇₇₉H₂₇₉₇N₅₃₃O₅₅₅S₁₁，原子总数为5 857和5 675；氨基酸组成中均以丝氨酸（Ser）占比最大，脯氨酸（Pro）次之；带正电荷残基总数（Arg+Lys）分别为48和43，负电荷残基总数（Asp+Glu）为31和28；脂肪指数为60.15和55.74，亲水性平均值为-0.688和-0.742；不稳定指数达63.17和60.77，推测HgWRKY19和HgWRKY23均属于不稳定蛋白（Ⅱ>40）。

2.2.2 二级结构、磷酸化位点和亲疏水性分析

蛋白二级结构预测（图2-B，图3-B）表明，HgWRKY19蛋白的无规则卷曲（61.44%）占比最大，其余依次为α螺旋（23.39%）、延伸链（10.28%）和β转角（4.88%），HgWRKY23蛋白同样是无规则卷曲（53.17%）占最大比例，其次为延伸链（19.58%），α螺旋（17.20%）和β转角（10.10%）则占比最小。SignalP-5.0和TMHMM预测结果显示，2个WRKY蛋白均未发现信号肽和跨膜结构。利用SWISS-MODEL进行三维结构预测（图2-C，图3-C），结果表明HgWRKY19和HgWRKY23蛋白结构均为无规则卷曲。NetPhos 3.1 Server预测（图2-D，图3-D）表明，HgWRKY19和HgWRKY23蛋白均存在65个磷酸化位点，其数量由多到少分别是丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）。亲疏水性预测如图2-E，图3-E所示，峰值在0以上代表蛋白是疏水性，反之是亲水性蛋白，结合亲水性平均值推测，HgWRKY19和HgWRKY23编码的蛋白均属于亲水性蛋白。

2.2.3 HgWRKY19和HgWRKY23基因编码蛋白的同源序列比对及进化树分析

通过NCBI-blast在线比对，找到与HgWRKY19、HgWRKY23蛋白同源性较高的11条WRKY蛋白序列，共来自8个物种，分别是藜麦、菠菜、甜菜头（Beta vulgaris subsp.Vulgaris）、木槿（Hibiscus syriacus）、澳洲坚果（Macadamia integrifolia）、野大豆（Glycine soja）、灰绿藜（Oxybasis glauca）和玉米（Zea mays），在CDD数据库中分析其保守结构域，使用DNAMAN 9.0对其保守域进行多序列比对（图4），同时运用MEGA 7.0对13个氨基酸进行系统进化树的构建（图5）。结果表明：13个蛋白均具有1个典型的WRKYGQK保守结构域和C₂H₂型的锌指结构（CX₅C₂₃HXH），属于第Ⅱ类WRKY蛋白。HgWRKY19与荞麦、菠菜和甜菜头的WRKY7蛋白聚为一支，亲缘关系较近；HgWRKY23则与以上3个物种以及灰绿藜的WRKY51蛋白进化关系更近；而HgWRKY19和HgWRKY23归属于不同分支。

2.3 HgWRKY19和HgWRKY23基因亚细胞定位

GenScript预测结果表明，HgWRKY19和HgWRKY23基因主要在细胞核中表达，为进一步验证其亚细胞定位，本研究使用空载体pCAMBIA1300-EGFP（对照）和带有上述过表达载体的农杆菌菌液进行了烟草瞬时转化试验。避开叶脉，在其周围剪取一小块侵染的烟草叶片，置于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞（图6）。结果显示，对照pCAMBIA1300-EGFP在细胞核、细胞质与细胞膜中均有荧光信号，而融合载体pCAMBIA1300-HgWRKY19-EGFP和pCAMBIA-HgWRKY23-EGFP主要在细胞核和细胞膜上发出绿色荧光，细胞质中则无荧光出现。结合预测结果，HgWRKY19和HgWRKY23初步定位于细胞核和细胞膜上。

2.4 盐胁迫下HgWRKY19和HgWRKY23基因的表达分析

利用qRT-PCR方法分析200 mmol/L NaCl胁迫下不同组织不同时间（0、6、24和48 h）HgWRKY19和HgWRKY23基因的相对表达量（图7）。结果表明，HgWRKY19和HgWRKY23在盐生草根系中有较高表达，具有明显的组织特异性；随着盐胁迫时间的延长，2个盐生草WRKY基因在叶片和根系中的表达量均呈现“先升后降”的趋势；基因表达量均在盐处理24 h时达到峰值，此时HgWRKY19和HgWRKY23在盐生草叶片中的表达量分别为0 h的1.72和1.82倍，在根系中的表达量则达到0 h的20.39和19.64倍；当盐胁迫48 h时，HgWRKY19和HgWRKY23的相对表达量显著降低（P<0.05），在叶片中仅为0 h的0.68和0.49倍，在根系中为0 h的8.43和8.93倍。

3 讨论

生物与非生物胁迫影响着植物的整个生长发育阶段，严重威胁了植物的生存与繁衍。植物通过激活或抑制基因的转录从而进化出复杂的信号调控网络，以尽可能适应并产生相应的胁迫应答，进而抵御严峻的逆境胁迫^［25］。WRKY转录因子不仅参与调控植物对生物与非生物刺激的许多反应过程，还与植物生长发育、衰老、碳水化合物和次生代谢物的合成密切相关^［26］。近年来，WRKY转录因子受到了众多学者的关注，已经鉴定得到超过14 500个WRKY基因，涉及了165种植物，其中多为双子叶植物，紧接着是单子叶和绿藻植物^［27］，然而在抗旱耐盐先锋植物盐生草中，极少见到关于WRKY转录因子的研究。

本研究成功克隆了盐生草HgWRKY19和HgWRKY23基因，通过初步了解其结构特征，发现二者均包含1个WRKY保守基序和1个C₂H₂（CX₅CX₂₃HXH）锌指基序，具备第Ⅱ类WRKY蛋白的结构特点，进一步根据其氨基酸编码序列划分为第Ⅱd亚类。2个HgWRKYs蛋白均具有碱性、不稳定性、亲水性等特征，存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点，这与甘蔗中Ⅱd类ScWRKY6蛋白的研究^［28］结果相一致。蛋白二级结构对于维持稳定的空间构象至关重要，而相较于无规则卷曲，α螺旋和β转角一般被认为更加稳定^［29］，本研究中HgWRKY19和HgWRKY23蛋白无规则卷曲和延伸链总占比均在72%左右，α螺旋和β转角仅占28%，进一步证明了其不稳定性。

系统进化分析表明，藜麦、菠菜和甜菜头的WRKY7蛋白与盐生草HgWRKY19聚为一支，藜麦、菠菜、甜菜头和灰绿藜的WRKY51蛋白则与HgWRKY23亲缘关系较近，而以上4个物种与盐生草同属藜科草本植物，说明WRKY转录因子在藜科植物的进化过程中较为保守，其行使的生物学功能可能相似。Ca²⁺是植物在各种胁迫下调节细胞过程的主要离子之一^［30］，而钙结合蛋白的含量与植物对干旱、盐碱和寒冷等逆境的耐受性有关^［31］。Park等人^［32］在拟南芥表达文库中分离到了编码WRKY7蛋白的cDNA，发现包括AtWRKY7在内的Ⅱd亚类WRKY成员均具有Ca²⁺依赖的钙调蛋白结合域（calmodulin-binding domain，CaMBD）。Dong等^［33］报道，病原体和水杨酸可诱导Ⅱd亚类WRKY基因的转录，并产生作为第二信使的Ca²⁺。粟颖^［34］研究表明，小麦TaWRKY51在NaCl或低温胁迫下上调表达，可与典型的W-box结合，具有转录激活活性，属于第Ⅱ类WRKY转录因子。水稻OsWRKY51首先被确定为ABA介导的糊粉细胞萌发诱导的调节因子^［35］，Hwang等^［36］发现过表达OsWRKY51的转基因株系对水稻白叶枯病菌具有更高的抗性，认为OsWRKY51正向调控水稻的防御反应。因此，本研究推测盐生草Ⅱd亚类蛋白HgWRKY19在CaM介导的Ca²⁺信号通路中可能发挥一定作用，HgWRKY23可能参与盐、低温和病原菌等胁迫响应，这为下一步研究工作提供了重要方向。

通过在水稻原生质体中瞬时表达35S-YFP-OsWRKY51融合蛋白，发现Ⅱ类OsWRKY51定位于细胞核内^［36］；苹果MdWRKY74主要在细胞核中表达，该Ⅱd类WRKY基因受到盐胁迫的诱导表达，可能通过参与SOS1和NHX1基因的表达调控进而提高植株的耐盐能力^［37］；甘蔗ScWRKY6与pCAMBIA1300-GFP构建亚细胞定位载体，发现仅在细胞核中表达^［28］。经烟草瞬时转化试验，本研究发现HgWRKY19和HgWRKY23主要分布在细胞核和细胞膜上，这与GenScript的预测结果具有一致性，同时与前人的研究结果相似，也符合WRKY蛋白在植物体中的转录调节功能，但其在细胞核中行使怎样的功能还有待进一步验证。qRT-PCR分析HgWRKY19和HgWRKY23基因在200 mmol/L NaCl胁迫下的表达模式，发现二者均有较强的组织特异性，主要在根系中表达，且相对表达量在24 h达到峰值，为0 h的20倍左右，表明HgWRKY19和HgWRKY23基因可能参与盐生草对盐胁迫的响应过程。

4 结论

本研究利用RT-PCR方法从盐生草中成功克隆HgWRKY19和HgWRKY23基因，预测均编码碱性不稳定亲水蛋白，主要在细胞核和细胞膜中表达，与多种藜科草本植物的WRKY序列高度同源，进化较为保守。其根系表达量受盐胁迫的诱导显著上调，且在24 h达到最高值，推测在盐生草耐盐胁迫中发挥重要作用，研究结果为下一步功能鉴定奠定了基础，同时为作物耐盐性育种提供了候选基因。

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基金资助

甘肃省教育厅：产业支撑计划项目(2021CYZC-12)

国家自然科学基金项目(31960072)

国家自然科学基金项目(32001514)

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系项目(CARS-05-04B-2)

甘肃省自然基金项目(20JR10RA507)

甘肃农业大学伏羲青年英才计划项目(Ganfx-03Y06)

甘肃农业大学国家级大学生创新创业训练计划重点支持领域项目(202110733001)