独脚金内酯参与富氢水增强番茄幼苗根系的耐盐性

nvolvement of strigolactone in hydrogen-rich water enhanced salt tolerance in tomato seedling roots

摘要

目的 研究盐胁迫下氢气（H₂）和独脚金内酯（SLs）在番茄幼苗根系中的调控作用及其相互关系。 方法 以番茄（Solanum lycopersicum L.‘Micro-Tom’）为试材，采用人工培养室基质栽培方式，确定最适浓度富氢水（75%）的基础上，设置如下处理：100%霍格兰营养液（CK）、盐胁迫（NaCl）、NaCl + HRW、NaCl +GR24（独脚金内酯合成类似物）、NaCl+HRW+TIS108（独脚金内酯合成抑制剂）。测定根系相关指标以及SLs含量及其相关合成基因表达量。 结果 盐胁迫下，75% HRW处理能显著增加番茄根系的长度、鲜质量和干质量。同时，GR24和HRW促进了盐胁迫下番茄幼苗的根系形态参数（根长、根表面积、根体积、平均直径等）和根系活力。然而，HRW的积极作用被SLs合成抑制剂TIS108所抑制。所以H₂调节的番茄幼苗根系耐盐性可能SLs与有关。此外，HRW处理增加了盐胁迫下番茄幼苗根系的内源SLs含量。在盐胁迫下，HRW处理也显著上调了SLs生物合成相关基因SlCCD7、SlCCD8、SlD14和SlMAX1的表达水平。 结论 SLs可能参与了H₂诱导的番茄幼苗根系的耐盐性。

Abstract

Objective To investigate the regulatory roles of hydrogen (H₂) and strigolactones (SLs) and their interaction in the roots of tomato seedlings under salt stress. Method Tomato (Solanum lycopersicum L.‘Micro-Tom’) was used as the experimental material，and was grown in an artificial culture chamber substrate.Based on the optimum concentration of hydrogen-rich water (75%)，the treatments are as follows:100% Hogland (CK)，salt stress (NaCl)，NaCl + HRW，NaCl + GR24 (SLs synthesis)，NaCl + HRW+ TIS108 (SLs synthesis).Root related parameters，SLs content，and the expression of SLs biosynthesis related genes were determined. Result Under salt stress，75% HRW treatment significantly increased root length，fresh weight，and dry weight of tomato seedling roots.Meanwhile，GR24 and HRW promoted root morphological parameters (root length，root surface area，root volume，root/shoot ratio，etc.) and root activity of tomato seedlings under salt stress.However，the beneficial roles of HRW were blocked by TIS108 (SLs inhibitor).Thus，SLs may be responsible for H2-regulated salt stress tolerance in the root of tomato seedlings.Additionally，HRW treatment increased endogenous SLs levels in tomato seedling roots under salt stress.HRW treatment significantly up-regulated the expression levels of SLs biosynthesis-related genes SlCCD7，SlCCD8，SlD14 and SlMAX1 under salt stress. Conclusion SLs may be involved in H₂-induced salt tolerance in the root of tomato seedlings.

Graphical abstract

关键词

番茄 / 盐胁迫 / 富氢水 / 独脚金内酯 / 根系活力 / 基因表达

Key words

tomato / salt stress / hydrogen rich water / strigolactones / root activity / gene expression

Author summay

叶福金，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

氢气（H₂）作为一种多功能信号分子，在植物的生长发育过程中发挥重要作用。如参与种子萌发^［1］、幼苗发育^［2］、不定根形成^［3］和果实成熟。富氢水处理可以提高植物对各种逆境胁迫的耐受性。独脚金内酯（SLs）是近期被确定为一类新的植物激素，在植物生长发育过程中起调节作用，包括叶片衰老^［4］、根系结构形成^［5］和幼苗生长^［6］。此外，SLs作为一种胁迫因子，参与多种非生物胁迫过程。有研究发现^［5］外源GR24（独脚金内酯的一种合成的三萜内酯）可以增强早期拟南芥的耐旱性和耐盐性，且GR24是多个独脚金内酯人工合成类似物中最有效的一个，并广泛应用于植物生长发育^［7］。因此，H₂和SLs在调节植物生长过程中都起着关键作用。

SLs来源于类胡萝卜素途径，由类胡萝卜素合成^［8］。其中类胡萝卜素裂解双加氧酶7（CCD7）和类胡萝卜素裂解双加氧酶8（CCD8）作为独脚金内酯合成过程中必不可少的酶，发挥着十分重要的裂解作用^［9］。MAX1是细胞色素P450单加氧酶，在类胡萝卜素异构酶D27的催化下生成9 -顺式- β -胡萝卜素，最终催化该化合物转化为SLs^［10］。

高盐分对植物的生长发育造成严重的毒性影响，例如严重限制生产力、降低作物产量和质量^［11］。目前，还没有关于植物中H₂和SLs之间关系的报道，尤其是关于两者缓解植物盐胁迫的机制和相互关系有待更深层次的探索。因此，本试验研究H₂和SLs对盐胁迫下番茄幼苗根系的影响及两者的关系，以期为深入研究非生物胁迫下植物根系生长发育过程H₂和SLs信号转导机制的理解提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

本试验采用番茄（Solanum lycopersicum L.‘Micro-Tom’）种子，选择大小一致，子粒饱满番茄种子用3%（W/V）次氯酸钠进行表面消毒20 min，然后在蒸馏水中浸泡4 h。植物幼苗在含有无菌蒸馏水的培养皿中萌发，植物培养室条件设为：白天温度（25±2）℃ 保持14 h、夜间（20±2）℃ 保持10 h、光照强度为200 μmol/（m²· s）、相对湿度为70%。将发芽的幼苗转移到含有1/2霍格兰溶液的锥形瓶中培养4 d，然后转移到100% 霍格兰溶液中7 d。在生长了大约1个月后（四叶期），选择生长情况相似的幼苗进行后续处理。

设置100% 霍格兰溶液（Hogland）为对照（CK）；盐胁迫（NaCl）；10%、25%、50%、75%、100%（HRW根施） 为HRW浓度筛选。然后从以上处理中筛选出最适HRW浓度（75%），其中NaCl、GR24（独脚金内酯合成类似物）和TIS108（独脚金内酯合成抑制剂）的物质浓度分别是150 mmol/L、15 μmol/L和3 μmol/L； 基于以上处理在接下来的试验中HRW和GR24单独或者共同使用，即NaCl+HRW、NaCl +GR24、NaCl+ HRW+ TIS108和HRW。每个处理3个重复，每个重复由30个幼苗根组成，每个重复中的植物幼苗根系储存在-80 ℃的超低温冰箱中，用于后续试验分析。

1.2 富氢水的制备

HRW（99.99%，V/V）用氢气发生器（QL-300，Cyclos氢气能源有限公司，济南，中国）以320 mL min^-1的速度连续60 min吹入1 000 mL蒸馏水制得^［2］。最后，HRW被迅速稀释到相应所需浓度。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 根系形态指标

番茄幼苗处理7 d后，用清水清洗根部，用吸水纸吸干表面残留水分。用分析天平称取鲜质量，之后放入烘箱中烘干至恒质量，称取根干质量。番茄根系用根系扫描仪（TD4800，Canada）扫描番茄植株的根部并保存图片，用Win RHIZO（Pro 2.0 Version 2005； Regent Instruments，Quebec，QC，Canada）软件对根的图片进行批量分析，进而获得根系长度、表面积和体积等相关指标。

1.3.2 根冠比和根系活力

根/冠比=根干质量/地上部干质量，根系活力采用TTC^［12］法测定。

1.3.3 SLs含量和实时定量PCR

SLs含量测定采用高效液相色谱法，SLs提取方法参照Liu等^［6］的方法。采用TRIzol方法提取总RNA^［13］。用于PCR分析的引物见表1。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0软件进行数据处理、制图，利用Duncan检验对各处理间的差异显著性进行分析 （P <0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同浓度富氢水对盐胁迫下番茄幼苗根系长度、鲜质量和干质量的影响

从图1可见，NaCl 处理对番茄幼苗根长、鲜质量和干质量的增长具有显著的抑制作用，主要表现为NaCl处理的番茄幼苗根长、鲜质量和干质量显著低于对照。盐胁迫下，10%、25%、50%、75%、100% HRW处理的番茄幼苗根长显著高于NaCl处理，其中75% HRW处理的番茄幼苗根长比较NaCl处理最显著，增加了35.3%（图1-A、D）。同时，与NaCl处理相比，75%和100% HRW处理的番茄幼苗根系鲜质量和干质量显著增加，其中75% HRW处理的鲜质量和干质量比较NaCl处理显著增加了41.5%和45.1%（图1-B、C）。因此，75% HRW可作为提高番茄幼苗根系抗盐性的最适浓度用于后续试验。

2.2 富氢水、GR24及SLs抑制剂TIS108对盐胁迫下番茄幼苗根系形态的影响

施用HRW、GR24（SLs合成类似物）和TIS（SLs抑制剂）初步探究H₂与SLs在盐胁迫下的作用及关系。如表2所示，与对照相比，NaCl处理显著抑制了根系形态参数。如根长、平均直径、根尖数和分根数，分别下降65.1%、38.4%、37.7%、42.5%。同时，与NaCl处理相比，NaCl + HRW和NaCl + GR24处理显著增加了番茄幼苗根长，表面积和体积。此外，NaCl + HRW和NaCl + GR24处理根表面积和根长、根尖数和分根数无显著差异。但与NaCl + HRW相比，NaCl + HRW+ TIS108处理显著降低了根表面积，体积，根尖数和分根数分别降低了44.4%、35.2%、40.6%、43.8%。表明TIS减弱了HRW对根系生长的积极作用。这些结果揭示SLs可能参与HRW缓解盐胁迫下番茄幼苗根系生长。

2.3 富氢水、GR24及SLs抑制剂TIS108对盐胁迫下番茄幼苗根冠比和根系活力的影响

不同处理下番茄幼苗根系的根冠比的变化情况与表面积和体积的变化情况基本一致。如图2-A所示，与对照相比，NaCl处理下的根冠比显著降低了6.6%。NaCl+HRW和NaCl+GR24处理均能显著缓解盐胁迫对根冠比的抑制作用。此外，NaCl+HRW+TIS处理的番茄幼苗根系的根冠比相比较NaCl+HRW处理的根冠比明显降低，降低了64.4%。

如图2-B所示，与对照相比，NaCl处理显著降低了根系活力。但与NaCl处理相比，NaCl+HRW和NaCl+GR24显著提高了番茄幼苗根系活力，分别提高了53.2%和42.2%。NaCl+HRW和NaCl+GR24处理之间根系活力没有差异。此外，与NaCl+HRW处理相比，NaCl+HRW+TIS处理显著降低了根系活力。表明SLs和HRW能有效缓解番茄幼苗根系的盐胁迫。

2.4 富氢水对盐胁迫下番茄幼苗根系内源独脚金内酯含量的影响

如图3所示，与对照相比，NaCl处理显著增加了内源SLs含量，增加了37.0%。NaCl+HRW显著提高番茄幼苗根系内源SLs含量，相比NaCl处理增加了42.2 %。此外，单独HRW处理显著增加了内源SLs含量。.

2.5 富氢水对盐胁迫下番茄幼苗根系SLs生物合成相关基因表达的影响

如图4所示，与对照相比，盐胁迫下番茄幼苗根系SlCCD7、SlCCD8、SlD27和SlMAX1的表达水平显著上调，分别为对照的22.6%、37.7%、30.1%、37.8%。与NaCl处理相比，NaCl+HRW处理显著上调了SlCCD7、SlCCD8、SlD27和SlMAX1基因的表达。此外，单独HRW处理显著上调了SlCCD7、SlCCD8、SlD27和SIMAX1的表达水平。因此，HRW可能通过提高SLs合成相关基因的表达增加了内源SLs含量，从而缓解了番茄幼苗根系中的盐胁迫。

3 讨论

根系作为植物重要的营养器官之一，是感应土壤盐分的主要部分同时对植物起机械支撑的作用^［11］。H₂作为植物抵御逆境胁迫的重要调节因子，在调节盐胁迫过程中发挥着重要作用^［2］。本试验中，75% HRW可显著增加盐胁迫下番茄幼苗根系的根长、鲜质量和干质量。这与前人^［14］研究结果一致，随盐浓度的升高，草地早熟禾幼苗的根长、苗长、相对含水量呈下降的趋势。Yang等^［15］报道，HRW处理显著增加了玉米根系的表面积、根体积和平均直径，从而缓解盐胁迫。

在本试验中，HRW显著增加了番茄幼苗的根长、平均直径、根尖数、分根数、面积和体积来增强耐盐性。这与李嘉炜等^［16］的研究一致，HRW能够显著增加冬瓜和黄瓜幼苗的生物量、根长、根体积、根表面积。同时，GR24处理也增强了盐胁迫下番茄幼苗的根长、表面积、根体积和平均直径。独脚金内酯作为一类新的植物激素，可调节植物不同生长发育过程^［10］。本试验中，研究结果表明加入TIS （ SLs抑制剂） 后则阻断了HRW对根系形态特征的积极作用，进而表明SLs可能参与H₂诱导盐胁迫。有研究发现，10 μmol/L GR24处理显著增加了樱桃砧木的根长、根数和平均直径，从而促进了樱桃砧木不定根的发育^［5］。另外，Liu等^［6］同样研究报道，SLs可能是NO下游重要的信号分子，从而增强了番茄幼苗对盐胁迫的抗性。

根系活力标志着根系吸收水分、养分的强弱，是反映根系吸收功能的重要指标，也是植物在长期进化过程中形成的遗传特征之一^［2］。本试验中，盐胁迫阻碍了番茄植株根系的正常生长，使其根冠比和根系活力降低。陈晓晶等^［17］研究发现，高浓度的盐主要积累在燕麦根部，降低了根系吸收水分的能力，从而影响了燕麦的正常生长。Wu^{等［18］发现在镉胁迫下，HRW处理提高了大白菜中的根系活力。本试验中，HRW和外源GR24处理均可显著提高盐胁迫下番茄幼苗根系的根系活力和根冠比。朱思雅等［19］研究发现，外源GR24可缓解盐胁迫下对月季花的根系活力。同时，GR24处理还显著提高了根系的相对含水量，来缓解镉胁迫对柳枝稷幼苗的抑制作用［5］，本试验同样研究发现TIS108显著抑制了HRW缓解盐胁迫的积极作用。因此SLs可能通过提高番茄幼苗的根冠比和根系活力来参与H₂响应盐胁迫。}

目前，SLs已被认为是一类主要在植物根部合成的植物生长调节剂。研究发现，SLs来源于类胡萝卜素途径，由质体中的类胡萝卜素合成^［8］。其中类胡萝卜素裂解双加氧酶7（CCD7）和类胡萝卜素裂解双加氧酶8（CCD8）作为独脚金内酯合成过程中必不可少的酶，发挥着十分裂解作用。β-类胡萝卜素异构酶D27作为独脚金内酯合成过程中的关键酶，也是独脚金内酯生物合成途径中的第一个酶。MAX1作为独脚金内酯合成过程中的下游基因，也在独脚金内酯合成中发挥着重要作用^［10］。本试验研究表明，在盐胁迫条件下，与对照相比，番茄幼苗根系中的SlCCD7、SlCCD8、SlD27、SlMAX1基因表达显著上调。与Ren等^［20］的研究结果一致，即与对照相比，干旱显著上调了番茄芽的SlCCD7、SlCCD8 基因表达量。Yu等^［21］最近报道，在葡萄根中VvD27和VvCCD8的表达量显著上调，且与根系SLs含量呈正相关。低磷、高浓度CO₂和高比例的红光、远红光条件下也能提高番茄根部SLs合成基因CCD7、CCD8、MAX1的表达水平^［22］。此外，IAA 处理增加蒙古黄芪幼苗根系SLs含量，并上调蒙古黄芪 AmCCD8、AmD14和AmMAX1的表达水平^［23］。最近一项研究证明，NO显著提高了盐胁迫下番茄叶片内源SLs含量，并上调了SlD14、SlMAX1、SlD14和SlCCD7的表达水平^［6］。这与本研究结果一致。我们发现，在盐胁迫下，HRW处理显著上调番茄幼苗根系中的SlCCD7、SlCCD8、SlD27和SlMAX1基因表达量。本试验结果进一步表明，HRW可能通过上调SLs合成相关基因的表达，诱导盐胁迫下内源SLs的产生。因此，SLs可能在H₂诱导的抗盐信号通路中发挥重要作用。

4 结论

综上所述，H₂在盐胁迫下番茄幼苗根系生长中发挥重要作用。此外，SLs和HRW均缓解了盐胁迫下番茄幼苗根系形态特征、根系活力和根冠比的不利影响。而，TIS108抑制了盐胁迫下HRW在根中的正调控作用，暗示SLs可能响应盐胁迫下H₂调控的根系生长。此外，HRW还可能通过提高盐胁迫下番茄幼苗根系中SLs合成基因的表达来增强SLs的生物合成，进一步证明SLs可能参与H₂缓解盐胁迫。因此，本试验为阐明H₂和SLs在响应胁迫中的关系及机制提供了理论依据。

参考文献

[1] Huang P P， Li C X， Che P P，et al.Hydrogen cas enhanced seed germination by increasing trehalose biosynthesis in cucumber［J］.Journal of Plant Growth Regulation，2022：1-15.

[2] 闫梅，姚彦东，牟开萍，等.脱落酸通过提高抗氧化酶活性与基因表达参与富氢水增强番茄幼苗抗旱性［J］.浙江农业学报，2022，34（9）：1901-1910.

[3] Zhao Z X， Li C X， Liu H W，et al.The involvement of glucose in hydrogen gas-medicated adventitious rooting in cucumber［J］.Plants，2021，10（9）：1937.

[4] 魏如月，张慧兰，阚文杰，等.外源独脚金内酯缓解小麦干旱胁迫的机制研究［J］.安徽大学学报（自然科学版），2021，45（5）：98-108.

[5] Tai Z L， Yin X Q， Fang Z G，et al.Exogenous GR24 alleviates cadmium toxicity by reducing cadmium uptake in switchgrass （Panicum virgatum） seedlings［J］.International Journal of Environmental Research and Public Health，2017，14（8）：852.

[6] Liu H W， Li C X， Yan M，et al.Strigolactone is involved in nitric oxide-enhanced the salt resistance in tomato seedlings［J］.Journal of Plant Research，2022，135（2）：337-350.

[7] Ha C V， Leyva MA， Osakabe Y，et al.Positive regulatory role of strigolactone in plant responses to drought and salt stress［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，14；111（2）：851-6.

[8] Jiang L， Liu X， Xiong G，et al.DWARF 53 acts as a repressor of strigolactone signalling in rice［J］.Nature，2013，504（7480）：401-405.

[9] Jiu S T， Xu Y， Xie X N，et al.Strigolactones affect the root system architecture of cherry rootstock by mediating hormone signaling pathways［J］.Environmental and Experimental Botany，2022，193：10466.

[10] 吴转娣，胡鑫，昝逢刚，等.独脚金内酯的生物合成及其调控［J］.中国农业大学学报，2020，25（12）：97-110.

[11] Petricka J J， Winter C M， Benfey P N.Control of Arabidopsis root development［J］.Annual Review of Plant Biology，2012，63：563.

[12] Yan M， Yao Y D， Mou K P，et al.The involvement of abscisic acid in hydrogen gas-enhanced drought resistance in tomato seedlings［J］.Scientia Horticulturae，2022，292：110631.

[13] Wang C L， Wei L J， Zhang J，et al.Nitric oxide enhances salt tolerance in tomato seedlings by regulating endogenous S-nitrosylation levels［J］.Journal of Plant Growth Regulation，2022：1-19.

[14] 刘燕，杨伟，马晖玲，等.盐胁迫对6种草地早熟禾幼苗生理特性的影响［J］.甘肃农业大学学报，2019，54（5）：140-150.

[15] Yang L Y， Tian J Y， Zhu M X，et al.Hydrogen-rich water improvement of root growth in maize exposed to saline stress［J］.Gereal Research Communication，2023（52）：581-590.

[16] 李嘉炜，张白鸽，陈潇，富氢水对蔬菜种子萌发和幼苗生长的影响［J］.长江蔬菜，2022（8）：10-14.

[17] 陈晓晶，徐忠山，赵宝平，盐胁迫对燕麦根系呼吸代谢、抗氧化酶活性及产量的影响［J］.生态学杂志，2021，40（9）：2773-2782.

[18] Wu Q，Su N，Huang X，et al.Hydrogen-rich water promotes elongation of hypocotyls and roots in plants through mediating the level of endogenous gibberellin and auxin［J］.Functional Plant Biology，2020，47（9）：771-778.

[19] 朱思雅，段建维，许彬，独角金内酯对盐胁迫下月季植株生长的影响［J］.现代园艺，2022，45（1）：13-15.

[20] Ren C G，Kong C C，Xie Z H.Role of abscisic acid in strigolactone-induced salt stress tolerance in arbuscular mycorrhizal Sesbania cannabina seedlings［J］.BMC Plant Biology，2018，18（1）：1-10.

[21] Yu Y Y，Xu J H，Wang C Y，et al.Genome-wide analysis of the strigolactone biosynthetic and signaling genes in grapevine and their response to salt and drought stresses［J］.Peer J，2022，10：e13551.

[22] 王月，王鲁鑫，李浩天，不同磷水平下CO₂浓度升高对番茄光合特性和抗氧化酶活性的影响［J］.江苏农业科学，2022，50（12）：163-167.

[23] 黄晓宇，庞娟，陈贵林.黄芪幼苗根系生长发育与GR24和IAA的关系［J］.广西植物，2022，42（5）：845-854.

基金资助

国家重点研发计划项目(2018YFD1000800)

国家自然科学基金项目(32072559)

国家自然科学基金项目(31860568)

国家自然科学基金项目(31560563)

国家自然科学基金项目(31160398)

中国博士后科学基金项目(20100470887)

中国博士后科学基金项目(2012T50828)

甘肃省自然科学基金项目(1606RJZA073)

甘肃省自然科学基金项目(1606RJZA077)

甘肃省教育厅创新创业团队项目(2018C-14)