45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对燕麦田土壤微生物群落的影响

Effect of a 45% pendimethalin capsule suspension on the soil microbial community

摘要

目的 研究45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对燕麦（Avena sativa）田土壤微生物群落的影响，为45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂应用于燕麦田提供依据。 方法 用扩增子测序评价45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对土壤微生物群落结构的影响。 结果 燕麦田表层土壤微生物多样性评价结果显示：施用二甲戊灵30 d后土壤微生物观察到的物种（Observed species）、Chao1、Shannon和Simpson多样性指数与对照之间均无显著性差异。用多重响应排列程序、相似性分析和置换多元方差分析3种方法对测序结果进行主成分分析，结果显示：二甲戊灵对土壤微生物多样性无显著影响。在内蒙古农业大学农场试验点，二甲戊灵施用后节杆菌属（Arthrobacter）内微生物种群丰度明显降低；在乌兰察布市农林科学研究所试验田，二甲戊灵施用后真菌出壳多孢菌属（Stagonosporopsis）内微生物种群丰度显著降低，镰刀菌属（Fusarium）和短梗蠕孢属（Trichocladium）内微生物种群丰度显著升高。 结论 节杆菌属（Arthrobacter）、出壳多孢菌（Stagonosporopsis）、镰刀菌属（Fusarium）和短梗蠕孢属（Trichocladium）内微生物对二甲戊灵相对敏感，但45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂不影响土壤微生物多样性指数。

Abstract

Objective To evaluate the safety of 45% pendimethalin capsule suspension on soil microbial diversity. Method The amplicon sequencing of the soil microbiology has been carried out. Result The sequencing results could reflect the microbial diversity of the soil samples.The 45% pendimethalin capsule suspension did not have a significant effect on soil microbial diversity based on the stability of the multiple diversity index，observed species，Chao1，Shannon and Simpson (P>0.05).Principal Component Analysis (PCA) also showed that the herbicide did not affect the soil microbial community.The abundance of bacteria in the genus Arthrobacter decreased significantly at the Ulanchap Institute of Agricultural and Forestry Sciences site.At the Inner Mongolia Agricultural University site，the abundance of fungi in the genus Stagonosporopsis decreased significantly，while the abundance of fungi in the genus Fusarium and Trichocladium increased. Conclusion 45% pendimethalin capsule suspension had no significant effect on the soil microbial community and diversity of the oat field.

Graphical abstract

关键词

二甲戊灵 / 燕麦 / 杂草 / 扩增子测序 / 土壤微生物群落

Key words

pendimethalin / oat / weeds / amplicon sequencing / soil microbial community

Author summay

东保柱，讲师，博士，研究方向为植物病害绿色防控。E-mail：[e-mail]

燕麦（Avena sativa）可分为皮燕麦和裸燕麦，具有喜冷凉、耐旱、耐贫瘠等特点，是重要的粮饲兼用作物^［1］。燕麦中含有β-葡聚糖和多种膳食纤维，具有较高的营养价值和保健功效^［2-3］；燕麦秸秆是重要的优质饲料，燕麦青干草和青贮燕麦草已成为高寒牧区枯草季节的重要饲草来源^［4］。燕麦产业在促进区域经济发展，推动乡村振兴中发挥着重要作用。燕麦田杂草包括狗尾草、野稷、藜、反枝苋、马唐等，严重影响着燕麦产业的可持续发展。不同的燕麦种植区，燕麦田杂草的群落结构、优势杂草种类不同，因此，燕麦田杂草防除的难度较大^［5-6］。

二甲戊灵属于二硝基苯胺类土壤封闭除草剂，用于播后苗前，主要通过抑制杂草分生组织的有丝分裂而发挥作用，能有效防除一年生杂草^［7］。45%的二甲戊灵微胶囊悬浮剂可用于大蒜、小麦、棉花等作物田除草^［8］。2019年《450 g/L二甲戊灵微囊悬浮剂行业标准（T/CCPIA015-2019）》在国内实施。与传统的农药剂型相比，微胶囊悬浮剂能够延长二甲戊灵的持效期，使药剂长效稳定，而且不易因淋溶产生药害^［9-10］。45%的二甲戊灵微胶囊悬浮剂对于燕麦田杂草有很好的防除效果，且对燕麦安全，可用于燕麦田除草^［11-12］。

除草剂是防除农田杂草的重要措施之一，然而除草剂的不合理使用不仅会造成农药残留，还会破坏土壤微生物群落结构，影响农业的可持续发展^［12-14］。土壤微生物群落是在生物和非生物因素的综合调控作用下，一定面积或体积土壤中的病毒、细菌、放线菌和土壤藻类等构成的生物群体。土壤微生物群落是土壤微生态的重要组成^［15］。研究表明：大量使用2，4-D、草甘膦会严重影响土壤中放线菌和真菌的种群密度^［16］。虽然，45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂能够用于燕麦田除草，但是作为一种土壤处理剂，它是否影响燕麦田土壤微生物还未见相关研究报道。本研究拟利用扩增子测序技术，评价45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对于燕麦田土壤微生物群落结构的影响。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

450 g/L二甲戊灵微胶囊悬浮剂，登记证号：PD2007456（巴斯夫欧洲公司）。供试品种：裸燕麦白燕2号。

1.2 试验方法

1.2.1 试验地点

乌兰察布市农林科学研究所试验田、内蒙古农业大学教学科研基地。

1.2.2 土壤处理

非沙地燕麦田处理方法：水浇地播前灌溉，旱地待自然降水后浅耕除掉已出苗杂草。播种量控制在15 kg/667m²，播幅控制在10 cm，行距20 cm。播种后喷施45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂，用量为180 mL/667m²，用水量为60 kg/667m²，均匀喷雾，按照杨平华的方法^［18］规范操作，未处理的地块为对照。

1.2.3 土壤微生物多样性分析方法

试验在乌兰察布市农科院和内蒙古农业大学教学科研基地进行。处理30 d后，用取土器收集燕麦田表层土（5 cm深）；未处理的燕麦田表层土壤作为对照。将土样置于超低温冰箱冷冻保存。

土壤总DNA用OMEGA土壤总DNA提取试剂盒提取。DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用双蒸水稀释到1 ng/μL。土壤总DNA作为模板，用于扩增土壤微生物细菌的16S rDNA和真菌的ITS区。细菌16S rDNA基因用通用引物515F/806R扩增，真菌ITS序列用特异性引物1737F和2043R扩增。用30 μL的PCR体系扩增目的片段，配置方法根据OMEGA土壤总DNA提取试剂盒说明书进行；引物浓度0.2 μmol/L，模板量10 ng。扩增程序：98 ℃预变性1 min，98℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用天根凝胶回收试剂盒纯化。用Illumina文库构建试剂盒构建测序文库，并利用NovaSeq平台测序。

根据Martin的方法从原始下机数据（raw data）中筛选高质量数据（clean data）。利用Silva数据库和UCHIME算法筛选并去除嵌合体序列（chimera）。相似性大于97%的序列被标记为同一个分类单元（OTUs）；具有代表性的序列会被进一步注释。代表性的序列通过Silva数据库，利用Mothur算法进行OTUs的注释。OTUs的丰度利用与序列最少的样本对应的序列号标准进行统一。利用统一后的数据进行α/β样性分析。

得到的有效数据用样本文库覆盖率指数（goods coverage）评价其测序深度。α多样性用观察到的物种（observed species）、Chao1、Shannon和Simpson多样性指数分析。利用QIIME和R软件中的主成分分析法（principal components analysis，PCA）分析群落结构。利用自定义R脚本构建热图。利用多重相应排列程序（multiple response permutation procedure，MRPP）、置换多元方差分析（Adonis）和相似性分析（analysis of similarities，ADOSIM）方法分析450 g/L二甲戊灵微胶囊悬浮剂是否对土壤微生物群落结构有影响。利用SPSS 18的Tukey’s多重比较方法对结果进行方差分析，显著水平α=0.05^［18］。

2 结果与分析

2.1 扩增子测序结果分析

2021年，为了检测45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对燕麦田土壤微生物群落的安全性，在乌兰察布农科院试验田和内蒙古农业大学农场试验田进行试验，并用扩增子测序检测土壤微生物多样性。测序结果经过序列装配以及初始数据筛选，从16S扩增序列中共得到773 695条有效数据，平均每个样品的有效数据为64 475条；从ITS扩增序列中共得到778 271条，平均每个样品的有效数据为64 856条。所有样品的稀释曲线中，OUT数量随着测序数量的增加最后都趋于平衡。测序结果表明测序数量能够有效地反映土壤中细菌和真菌的多样性（图1）。

2.2 二甲戊灵对于根际土壤微生物多样性的影响

不同土壤样品的微生物α多样性指数见表1。每个处理的样本文库覆盖率指数均大于0.98，表明测序深度能够代表各个土壤样品中的微生物群落结构特征。指标观察到物种和Chao1反映了土壤微生物的丰度，在两个试验地点，经过二甲戊灵土壤处理后，无论是细菌还是真菌，多样性指数观测到的物种和Chao1均没有显著性变化（P<0.05）。Shannon和Simpson多样性指数代表了土壤微生物多样性，在两个试验地点，二甲戊灵处理的根际土壤样品中，真菌和细菌的两个多样性指数与对照之间均无显著性差异，说明二甲戊灵处理对于土壤的微生物丰度和多样性均没有显著性影响。

2.3 二甲戊灵对于土壤微生物群落结构的影响

用主成分分析（PCA）方法分析土壤中主要的土壤微生物属内的差异，结果如图2所示。在两个试验地点二甲戊灵处理根际土壤细菌和真菌的主要微生物群落结构没有明显差异。MRPP、Adonis和ANOSIM分析结果如表2所示：在两个试验地点，二甲戊灵处理的根际土壤3种分析结果的差异不显著（P>0.05）。表明二甲戊灵处理对土壤中主要微生物群落结构无显著性影响。

2.4 二甲戊灵对于土壤主要微生物种群丰度的影响

被鉴定的主要真菌和细菌被分为10个门。在10个细菌门中，变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteria）和一类未被鉴定的细菌（Unidentified bacteria）是最主要的细菌种群，占细菌总量的60%以上。在10个真菌门中子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和丝孢菌门（Mortierellomycota）是最主要的真菌种群，占了真菌总量的60%以上。各个门内的微生物丰度与对照之间相比均无显著差异（P>0.05）。

被鉴定的最主要的土壤微生物属聚类分析如图4所示：在两个试验地点使用45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂只对个别属内微生物丰度有显著影响（P<0.05）。在内蒙古农业大学农场试验点，施用二甲戊灵，Arthrobacter属内微生物丰度明显降低。在乌兰察布市农林科学研究所试验田，施用二甲戊灵后土壤微生物出壳多孢菌属（Stagonosporopsis）内微生物丰度降低；镰刀菌属（Fusarium）和短梗蠕孢属（Trichocladium）属内微生物丰度明显升高（P<0.05）。以上结果表明：田间施用45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂，除影响细菌节杆菌属（Arthrobacter）和真菌出壳多孢菌属（Stagonosporopsis）、镰刀菌属（Fusarium）和短梗蠕孢属（Trichocladium）内微生物丰度外，对燕麦田其他主要属内土壤微生物的丰度均没有显著性影响。

3 讨论

3.1 45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对土壤真菌和细菌丰度的影响

45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对燕麦田表层土壤的微生物多样性以及主要门内微生物丰度均没有显著性影响；在乌兰察布市农林科学研究所试验点，对3个主要真菌属内微生物影响显著，但对该地点的土壤细菌无显著影响，对真菌影响的程度比细菌大。二甲戊灵通过抑制有丝分裂发挥作用^［19］，真核微生物和原核微生物相比，对二甲戊灵相对较敏感。以上研究结果表明，二甲戊灵抑制有丝分裂的作用机理，使土壤微生物中一些真菌对其更加敏感。

在乌兰察布市农林科学研究所试验田，45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对表层土壤中出壳多孢菌属（Stagonosporopsis）、镰刀菌属（Fusarium）和短梗蠕孢属（Trichocladium）属内微生物丰度有影响，且出壳多孢菌属（Stagonosporopsis）丰度降低，而镰刀菌属（Fusarium）和短梗蠕孢属（Trichocladium）微生物丰度升高；绝大部分土壤真菌没有明显变化。有研究表明：施用除草剂会增加谷物被镰刀菌侵染的几率^［20］。以上结果表明，田间施用除草剂会提高土壤中镰刀菌属一些致病种的微生物丰度。二甲戊灵在乌兰察布农林科学研究所试验田对3个属真菌有影响；而在内蒙古农业大学农场试验田，却没有显著性影响。由此推测：不同地点3个属内土壤真菌种类有差异，不同种的真菌对二甲戊灵的敏感程度不同。

3.2 45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂使出壳多孢菌属（Stagonosporopsis）内微生物丰度下降

45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂在乌兰察布市农林科学研究所试验点显著降低了出壳多孢菌属（Stagonosporopsis）内微生物丰度。出壳多孢菌属（Stagonosporopsis）内真菌生物学功能多样，蔓枯病菌（Stagonosporopsis citrulli）能够侵染西瓜，引起西瓜叶疫病^［21］；木瓜拟多隔孢（Stagonosporopsis caricae）侵染烟草引起烟草叶斑病^［22］；而木瓜拟多隔孢（Stagonosporopsis caricae）是霍山石斛重要的内生菌，能够产生多种抗癌物质^［23］。也有研究表明，壳多孢菌（Stagonosporopsis rhizophilae）能够分泌大量的吲哚丁酸和吲哚乙酸，显著促进树木根系发育^［24］。而高浓度吲哚乙酸会抑制尖孢镰刀菌（F.oxysporum）孢子萌发和鹰嘴豆枯萎镰刀菌（F.delphinoides）菌丝生长^［25］。推测在乌兰察布市农林科学研究所试验点土壤中的壳多孢菌（Stagonosporopsis rhizophilae）丰度较高，在二甲戊灵的胁迫作用下，壳多孢菌（Stagonosporopsis rhizophilae）产生大量的IAA，抑制了自身的生长，最终导致其丰度的显著下降。

3.3 45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂使Fusarium属内微生物丰度升高

镰刀菌属（Fusarium）内多种真菌是重要的土传植物病原菌，能够引起植物枯萎病、根腐病等^［26］。同属于二甲苯胺类除草剂氟乐灵处理棉花后的渗出物能够促进枯萎病菌孢子萌发和菌丝生长，从而够促进棉花枯萎病的发生^［27］；二甲戊灵、氟乐灵施用会使立枯丝核菌引起的大麦、小麦根腐病发生严重^［28］。表明二甲苯胺类除草剂可通过作用于植物产生有益于土传植物病原菌生长的物质。本研究结果显示，在二甲戊灵处理燕麦田土壤中镰刀菌属（Fusarium）内微生物丰度显著升高。推测二甲戊灵可能通过作用于燕麦，使燕麦产生了促进镰刀菌生长的次生代谢产物。

4 结论

45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂仅对燕麦田土壤中个别属内的微生物种群丰度有影响，对土壤微生物多样性、土壤中微生物群落结构无显著性影响，据此认为45%二甲戊灵微胶囊悬浮剂对土壤微生物安全。

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基金资助

国家燕麦荞麦产业技术体系草害及综合防控岗位(CARS-07-C-3)

内蒙古自治区科技重大专项燕麦新品种选育、绿色栽培技术与营养功能产品研究与示范项目(2021ZD0002)