两种矿物源农药与化学农药混配对百合灰霉病菌抑菌增效作用评价

Evaluation of the synergistic effect of two mineral and chemical fungicides mixed on Botrytis cinerea

摘要

目的 为明确矿物源农药与化学农药混配对百合灰霉病的防治效果。 方法 采用菌落生长速率法、黄瓜子叶法及喷雾法测定了氧化亚铜、石硫合剂分别与3种化学农药混配对百合灰霉菌的抑菌增效作用、离体防效、室内盆栽防效及持效期和对百合的安全性。 结果 混配剂86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）及混配剂29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP（9∶1）抑菌活性最强，EC₅₀分别为99.90 µg/mL、105.58 µg/mL，CTC分别为130.65、122.28，表现为增效作用，其中混配剂86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP以9∶1混配时对百合灰霉病的防效最好，保护作用防效为87.01%，治疗作用防效为81.81%，室内盆栽防效测定表明第7 天防效最大，为76.18%，持效期为7 d。 结论 试验所选药剂对兰州百合安全，86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）混剂防效高于单剂防效，而29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP（9∶1）混剂的防效则低于其单剂防效。

Abstract

Objective To determine the control effect of the mixture of mineral and chemical pesticides on the lily Botrytis cinerea. Method The inhibition synergistic effect，in vitro control effect，indoor pot control effect and duration of the mixture of cuprous oxide，lime-sulphur mixture and three chemical fungicides on B.cinerea on lily and their safety to lily were determined by using the colony growth rate method，the cucumber cotyledon method and the spray method. Result The mixtures of 86.2% cuprous oxide WP:70% oxazole SP (9∶1) and 29% sulphur mixture AS∶75% chlorothalonil WP (9∶1) had the strongest toxicity，EC₅₀ were 99.90 µg/mL and 105.58 µg/mL，and CTC were 130.65 and 122.28，respectively，showing a synergistic effect.Among them，the mixture of 86.2% cuprous oxide WP∶70% hymexazol SP (9∶1) had the best control effect on gray mold of lily，with the protection effect and treatment effect were 87.01% and 81.81%，the results of pot experiment in room showed that the largest control effect was 76.18% on the seventh day，with a persistent effect period of 7 d. Conclusion The fungicides selected in the trial was safe for Lanzhou lily in Lanzhou.The control effect of the mixture was higher than that of the single agents of 86.2% cuprous oxide WP∶70% hymexazol SP (9∶1)，while the control effect of the mixture of 29% lime-sulphur mixture AS:75% chlorothalonil WP (9∶1) was lower than that of the single agents.

Graphical abstract

关键词

矿物源农药 / 混配 / 百合灰霉病 / 抑菌增效作用 / 持效期 / 安全性

Key words

mineral pesticide / mixed / Botrytis cinerea / inhibition and synergistic effect / persistent period / safety

Author summay

王存颖，硕士研究生。E¬mail：[e-mail]

百合是百合科百合属多年生草本球根植物^［1］，因品种繁多，集食用、药用、观赏价值等为一身，深受人们喜爱，在全国多个地区内广泛种植，并成为其地区的重要产业支柱，兰州百合因其独特的口感闻名世界，远销海内外^［2-3］。但是，随着兰州百合栽培年限的延长与栽培面积的持续扩大，灰霉病发生日益严重。据报道，百合灰霉病主要由两种葡萄孢菌引起，分别是椭圆葡萄孢菌（Botrytis elliptica）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）^［4-5］。该病害引起百合叶片干枯，茎秆腐烂枯死、易倒伏，花器褐腐，鳞茎腐烂，染病后期植株似火烧状，地下鳞茎停止生长，可使百合减产20%~30%，严重流行时可造成绝收。

目前，百合灰霉病的防治仍以化学药剂防治为主，其中嘧霉胺、百菌清、腐霉利、吡唑醚菌酯等化学药剂常被用来防治灰霉病，表现出较高的防效^［6］。由于长期单一及不合理使用化学药剂，导致灰霉菌对许多常用化学药剂产生了抗药性，造成防治效果降低，且长期重复及大量使用化学药剂还会形成一定的农药残留，对人畜及周边环境造成一定的危害^［7-12］。在使用矿物源农药对兰州百合3种病害的防治中发现，86.2%氧化亚铜WP及29%石硫合剂AS同时使用对灰葡萄孢菌、交链格孢菌的防效较好^［13］。该类农药杀菌谱广，毒性较低，耐雨水冲刷，持效期长，符合新型农业发展趋势，近年来被广泛用于植物病害防治^［14］。

农药复配技术可以有效提高农药防效、延缓和阻止病原菌抗药性的产生和发展，是合理使用现有农药品种的有效途径。为了提高对百合灰霉病的防治效果，本试验用筛选出的对灰霉菌防治效果较高的矿物源农药86.2%氧化亚铜WP、29%石硫合剂AS^［15］和3种常用的化学农药进行混配，通过测定各配比药剂抑菌效果，筛选出具有增效作用的混配剂，评价其增效效果及其对百合灰霉病的室内防治效果和持效期，研究结果对指导铜制剂和硫制剂与化学农药的合理混配及其混配剂用于有效防治兰州百合灰霉病和延缓灰霉菌的抗药性等方面具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试病原菌

灰葡萄孢菌（B.cinerea ）由甘肃农业大学农药学实验室提供并保存。

1.1.2 供试药剂

见表1。

1.1.3 供试培养基

PDA培养基。

1.1.4 供试植株

子叶期黄瓜幼苗（津研4号购于天津市蔬菜研究所），兰州百合（购于兰州百合种球繁育基地）幼苗。

种植条件：恒温气候室（24±1）℃，L/D=16 h/8 h，湿度60%，每3 d浇水1次，使土壤保持湿润。

1.1.5 试验设备及用具

立式高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、电子天平、超净工作台，锥形瓶、烧杯、量筒、移液枪、直尺、滤纸、脱脂棉、培养皿等。

1.2 试验方法

1.2.1 对灰葡萄孢菌的最佳药剂混配配比的筛选

灰葡萄孢菌活化：挑取保存于4 ℃冰箱中的灰葡萄孢菌（B.cinerea），接种于PDA培养基中央，25 ℃恒温培养，待菌落长满3/4培养皿后备用。

运用Wadley的增效比率法进行最佳配比的筛选。于超净工作台将各药剂按照推荐用量扩大50倍用灭菌水配成药液，并以0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0的体积比设11个混配比例，用移液枪取1 mL配制好的药液加入到灭菌冷却至45 ℃左右的49 mL PDA培养基中，充分摇匀，倒入4个灭菌培养皿（90 mm）中制成含药培养基平板，使各药剂浓度为各自推荐使用浓度（表1）。以加入1 mL无菌水的PDA培养基为空白对照，做好标记。用打孔器（5 mm）在上述活化后的菌落边缘打取菌饼，菌丝朝下接入各平板中央，25 ℃恒温培养，每个处理重复4次。培养4 d后按十字交叉法测定病原菌的菌落直径，计算实际抑菌率、理论抑菌率、毒效比率，确定最佳增效配比，判定标准如下：毒效比率>1，为增效作用；毒效比率<1，为拮抗作用；毒效比率=1，为相加作用。

\mathrm{抑菌}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{对照}\mathrm{菌落}\mathrm{直径}(\mathrm{m}\mathrm{m})-\mathrm{处理}\mathrm{菌落}\mathrm{直径}(\mathrm{m}\mathrm{m})}{\mathrm{对照}\mathrm{菌落}\mathrm{直径}(\mathrm{m}\mathrm{m})-\mathrm{5}\mathrm{m}\mathrm{m}}\times \mathrm{100}

\mathrm{混剂}\mathrm{预期}\mathrm{抑菌}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{混剂}\mathrm{中药}\mathrm{剂}\mathrm{{\rm A}}\mathrm{实际}\mathrm{抑菌}\mathrm{率}\times \mathrm{混剂}\mathrm{中药}\mathrm{剂}\mathrm{{\rm A}}\mathrm{所占}\mathrm{比例}+\mathrm{混剂}\mathrm{中药}\mathrm{剂}\mathrm{{\rm B}}\mathrm{实际}\mathrm{抑菌}\mathrm{率}\times \mathrm{混剂}\mathrm{中药}\mathrm{剂}\mathrm{{\rm B}}\mathrm{所占}\mathrm{比例})\times \mathrm{100}^［1］

\mathrm{毒效}\mathrm{比率}=\frac{\mathrm{混剂}\mathrm{实际}\mathrm{抑菌}\mathrm{率}}{\mathrm{混剂}\mathrm{预期}\mathrm{抑菌}\mathrm{率}}

1.2.2 不同药剂混配对灰葡萄孢菌的协同增效作用测定

在1.2.1筛选出最佳配比的基础上，将各药剂按最佳配比配制成药液，再用无菌水稀释成5个浓度梯度，然后根据1.2.1中的方法制备含药培养基，以加入各单剂的含毒培养基为药剂对照，以加入无菌水的PDA为空白对照，做好标记，每个处理重复4次，接菌后置于25 ℃恒温培养4 d后，按十字交叉法测定病原菌的菌落直径，并计算混配剂及各单剂对病原菌菌落生长的抑菌率。

以药剂浓度对数为X轴，抑菌率几率值为Y轴，求出各混配剂和单剂的毒力回归方程及EC₅₀，根据孙云沛的方法^［16］，以混剂中A药剂作为标准药剂，计算各单剂毒力指数（TI）、混配剂的毒力指数（ATI）、混配剂的理论毒力指数（TTI），共毒系数（Co-Toxicity Coefficient，CTC），进一步判定混配剂的增效与否，标准如下：若CTC>120，为增效作用；若80<CTC<120，为相加作用；若CTC<80，为拮抗作用。

\mathrm{单剂}\mathrm{的毒}\mathrm{力指}\mathrm{数}(\mathrm{T}\mathrm{I})=\frac{\mathrm{标准}\mathrm{杀菌}\mathrm{剂的}E{C}_{\mathrm{50}}}{\mathrm{供试}\mathrm{单剂}\mathrm{的}E{C}_{\mathrm{50}}}\times \mathrm{100}

\mathrm{混剂}\mathrm{实际}\mathrm{毒力}\mathrm{指数}(\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{I})=\frac{\mathrm{标准}\mathrm{杀菌}\mathrm{剂}E{C}_{\mathrm{50}}}{\mathrm{混合}\mathrm{药剂}E{C}_{\mathrm{50}}}\times \mathrm{100}

\mathrm{混剂}\mathrm{理论}\mathrm{毒力}\mathrm{指数}(\mathrm{{\rm T}}\mathrm{{\rm T}}\mathrm{{\rm I}})=\mathrm{A}\mathrm{药剂}\mathrm{毒力}\mathrm{指数}\times \mathrm{A}\mathrm{药剂}\mathrm{在混}\mathrm{剂中}\mathrm{所占}\mathrm{比例}+\mathrm{B}\mathrm{药剂}\mathrm{毒力}\mathrm{指数}\times \mathrm{B}\mathrm{药剂}\mathrm{在混}\mathrm{剂中}\mathrm{所占}\mathrm{比例}

\mathrm{共毒}\mathrm{系数}(\mathrm{C}\mathrm{T}\mathrm{C})=\frac{\mathrm{混合}\mathrm{药剂}\mathrm{实际}\mathrm{毒力}\mathrm{指数}}{\mathrm{混合}\mathrm{药剂}\mathrm{理论}\mathrm{毒力}\mathrm{指数}}\times \mathrm{100}

1.2.3 几种混配药剂对兰州百合灰霉病室内防效测定

按1.2.2中筛选出的具有增效作用的混配剂，按其比例配制相应药液，供后续试验使用，以各单剂为药剂对照，无菌水为空白对照。采用黄瓜子叶法，摘取大小一致的黄瓜子叶，经75%酒精1 min、无菌水清洗3遍后晾干，置于垫有湿滤纸的灭菌瓷盘中，备用。

保护作用测定：取上述黄瓜子叶若干，分别浸入上述配制好的混配剂及各单剂中3 min，取出用滤纸吸掉多余药液，待药液稍干后正面朝上置于覆有湿滤纸的灭菌培养皿（90 mm）中，每皿4片子叶，用脱脂棉裹住叶柄保湿，在每个子叶中间接入菌饼（5 mm），每个处理重复3次，做好标记，在气候箱中（24±1）℃、L/D=16 h/8 h、加无菌水培养，4 d后，用十字交叉法测量每片子叶病斑直径，求其平均值，按下式计算防治效果。

\mathrm{防治}\mathrm{效果}(\mathrm{\%})=\frac{\mathrm{对照}\mathrm{病斑}\mathrm{平均}\mathrm{直径}(\mathrm{m}\mathrm{m})-\mathrm{处理}\mathrm{病斑}\mathrm{平均}\mathrm{直径}(\mathrm{m}\mathrm{m})}{\mathrm{对照}\mathrm{病斑}\mathrm{平均}\mathrm{直径}(\mathrm{m}\mathrm{m})-\mathrm{5}\mathrm{m}\mathrm{m}}\times \mathrm{100}

治疗作用测定：叶片接菌处理及培养条件同保护作用测定，36 h后取出黄瓜子叶，浸入上述配制的药液中3 min，以无菌水为空白对照，用滤纸吸掉多余药液，继续培养2 d后，按测定保护作用的方法进行测定，计算防治效果。

1.2.4 几种药剂混配剂对兰州百合灰霉病持效期测定

用1.2.2筛选出的具增效作用的混配剂及各单剂喷雾处理生长一致的兰州百合幼苗，分别于处理后第3、5、7、9、11天 接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液（1×10⁹ cfu/mL），每个处理3盆，重复3次，并做好标记，处理好的百合幼苗置于人工气候室中培养（25 ℃，湿度60%，L/D=16 h/8 h，浇水1次/3 d），7 d后调查发病情况，根据以下分级标准，计算病情指数及防病效果 ^［17］。

病害分级标准：0级，叶片表面未发现病斑；1级，病斑的面积占总叶片面积的0~1%；2级，病斑的面积占总叶片面积的1%~5%；3级，病斑的面积占总叶片面积的5%~20%；4级，病斑的面积占总叶片面积的20%~40%；5级，病斑的面积占总叶片面积的40%以上。

\mathrm{病情}\mathrm{指数}=\frac{\sum (\mathrm{各级}\mathrm{代表}\mathrm{值}\times \mathrm{发病}\mathrm{叶片}\mathrm{数})}{\mathrm{最高}\mathrm{级代}\mathrm{表值}\times \mathrm{调查}\mathrm{总叶}\mathrm{片数}}\times \mathrm{100}

防病效果（%）=\frac{(\mathrm{对照}\mathrm{组平}\mathrm{均病}\mathrm{情指}\mathrm{数}-\mathrm{处理}\mathrm{组平}\mathrm{均病}\mathrm{情指}\mathrm{数})}{\mathrm{对照}\mathrm{组平}\mathrm{均病}\mathrm{情指}\mathrm{数}}×100

1.2.5 几种药剂混配对兰州百合安全性测定

用1.2.2筛选出的具增效作用的混配剂喷雾处理生长一致的兰州百合幼苗，以喷无菌水作为空白对照，保证叶片正反面均匀布满药剂，分别于施药后第1、3、5、7、9、11天观察百合的生长情况。

1.3 数据分析

试验数据用Microsoft Excel 2019进行整理及绘图，利用SPSS 25.0软件中Duncan氏新复极差法对数据进行差异显著性检验、分析，将抑菌率转换为几率值，浓度转换为对数；采用几率值-浓度对数分析法（Dokersk），模拟出回归方程，求出EC₅₀。

2 结果与分析

2.1 两种矿物源农药与3种化学农药混配对灰葡萄孢最佳配比的筛选

通过混毒效比率测定结果表明，不同配比下的混配剂对灰葡萄孢菌的抑菌活性不同。当86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP在4∶6及9∶1、29%石硫合剂AS∶70%噁霉灵SP在1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4及8∶2、29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP在7∶3、8∶2及9∶1的混配比例下，毒效比率均大于1，表现为增效作用，当29%石硫合剂AS∶70%噁霉灵SP在7∶3、9∶1的混配比例下，毒效比率等于1，表现为相加作用，其他混配剂的毒效比率均小于1，表现为拮抗作用（表2、3）。综上，初步筛选出12种毒效比率大于1的增效配比。

2.2 两种矿物源农药与3种化学农药混配对灰葡萄孢的增效作用

共毒系数测定结果表明，86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP为9∶1时EC₅₀为99.90 μg/mL、CTC为130.65；29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP为9∶1混配时EC₅₀为105.58 μg/mL、CTC为122.28，这两种混配剂的共毒系数均大于120，表现为增效作用，两个混配剂的EC₅₀值均大于3种化学药剂，小于2种矿物源药剂，表明这两个混配剂的抑菌活性在两种药剂之间。其他配比的混配剂均表现为拮抗作用（表4）。综上，筛选出2种具有增效作用的混配剂，用于对灰葡萄孢菌引起的百合灰霉病的防治效果评价。

2.3 两种混配剂对兰州百合灰霉病室内防效测定

通过室内防效试验，发现2种具有增效作用的混配剂即86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）和29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP（9∶1）。86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）对兰州百合灰霉病具有较好的防治效果，且与各自单剂防效之间存在极显著差异，保护作用和治疗作用防效分别为87.01%、81.18%，比各单剂提高4.02%、6.90%和6.40%、10.66%；而29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP（9∶1）对百合灰霉病的防效较差，且与各自单剂防效之间具有极显著差异，保护作用和治疗作用防效分别为61.86%和49.44%，比各单剂防效降低13.4%、13.91%和17.7%、18.92%；其中混配剂86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）的保护作用与治疗作用的防效比混配剂29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP（9∶1）分别提高25.15%、31.74%。两个混配剂及各单剂保护作用防效均高于治疗作用防效（图1，表5）。综上，混配剂86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）对百合灰霉病具有良好的防治效果，可为其田间推广防治提供一定理论依据。

2.4 不同药剂混配对兰州百合灰霉病防病效果及持效期测定

通过对筛选出的具有增效作用的混配剂进行盆栽防效和持效期测定，结果表明，两种混配剂及其单剂防效在第3、5、7天逐渐增大，第7天达到最大。混配剂86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）处理的防效为76.18%，高于单剂86.2%氧化亚铜WP、70%噁霉灵SP处理的防治效果，分别提高4.43%、2.00%，随后在第9、11天防效逐渐降低，但总体高于50%；混配剂29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP（9∶1）的防效为53.70%，但与单剂29%石硫合剂AS、75%百菌清WP相比，其防效分别降低11.31%、14.92%，各混配剂防效及混配剂与其单剂防效之间均存在极显著差异；混配剂86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）及其单剂防效均大于混配剂29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP（9∶1）及其单剂。

在药剂处理相同时间后，混配剂86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）的防效均高于混配剂29%石硫合剂AS∶75%百菌清WP（9∶1）及其各单剂的防效，且在药剂处理第11天时对灰葡萄孢菌的防效仍大于50%，说明86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）的防效最好，防病持效期最长，为7 d（表6），综上，混配剂86.2%氧化亚铜WP∶70%噁霉灵SP（9∶1）的防治效果最好，该混配剂处理的百合幼苗叶色浓绿，长势良好，与对照比较，没有发生药害，说明供试药剂在试验剂量范围内对兰州百合安全。

3 讨论与结论

百合灰霉病是危害百合生产的主要病害，咯菌腈、腐霉利、嘧霉胺等化学药剂用于田间防治灰霉病，但因其长期不合理使用，抗药性问题严重。据报道，番茄、茄子和辣椒等作物的灰霉病病原菌对腐霉利的抗性频率高达98.21%，其次，番茄灰霉病菌、猕猴桃灰霉病菌对多菌灵、嘧霉胺、乙霉威、异菌脲、咯菌腈的抗性频率最高可达95.08%，最低为42.86%^［18］，致使病害越防越重，防效明显降低；矿物源农药氧化亚铜或纳米氧化亚铜对甜瓜果斑病、黄瓜霜霉病、柑橘炭疽病、苹果腐烂病、黄瓜枯萎病和小麦全蚀病均具有较好的防治效果，其防效为47.68%~94.9%^［19-20］；石硫合剂作为一种低成本高防效的传统矿物源农药，用于多种病虫害的预防与防治，可与多种药剂混合使用，其防效优于单一药剂，在处理桃树流胶病^［21］、马铃薯晚疫病^［22］及促进果树的生长等方面具有显著作用；矿物源农药86.2%氧化亚铜WP和29%石硫合剂AS对百合灰葡萄孢菌具有较好的室内抑菌活性，但离体防效较低^{，为 83.45%和74.68%［23］。}

药剂的合理混配可以发挥混配剂多位点、多途径作用的特点，在有效延缓病原菌抗药性发展、扩大防病谱、减少各单剂用药量、延长农药品种的经济使用寿命、降低成本、提高防治效果等方面具有重要作用。目前，有关化学药剂之间的混配研究较多，将啶酰菌胺与吡唑醚菌酯以2∶1、咯菌腈与氟硅唑以2∶1和1∶3复配时，对草莓灰霉病的防治具有明显的增效作用^［24-25］，百菌清与百里香酚和厚朴酚分别以5∶1、10∶1混配时对灰葡萄孢菌表现出较高的抑菌活性^［26］。

而有关氧化亚铜、石硫合剂两种矿物源农药与化学药剂混配防治百合灰霉病的研究鲜见报道，因此将这两种矿物源农药与几种化学药剂混配后研究其对百合灰霉菌的防治效果，结果表明86.2%氧化亚铜WP与70%噁霉灵SP的配伍性较好，按9∶1混配后对百合安全，对灰霉病的防效较高，为76.18%，在化学药剂噁霉灵的使用量降低90%的情况下，混剂的防效高于噁霉灵单剂防效，可减轻噁霉灵对灰霉菌的选择压力，起到延缓抗药性产生的作用，且混配剂的保护作用防效高于治疗作用防效；而29%石硫合剂AS与75%百菌清WP 按9∶1混配后尽管CTC大于120，表现为增效作用，但室内离体防治效果、保护治疗作用、防病持效期等均小于两种单剂，这是否与两种药剂的作用机理、有效成分及其含量、剂型以及防效试验测定的环境因素等有关，还有待于进一步探讨。

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[24] 冀俊.草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）对五种杀菌剂的抗性检测及增效组合物的筛选［D］.杭州：浙江农林大学，2021.

[25] 刘华琪，文梦梦，吴小新，等.3种防治草莓灰霉病化学杀菌剂的筛选及复配效果研究［J］.安徽农业科学，2021，49（18）：140-143.

基金资助

兰州市科技局项目(2018-4-78)

甘肃省科技重大专项(18ZD2NA010)

甘肃农业大学学科建设基金项目(GAU-XKJS-2018-155)

甘肃省农牧厅项目(GNSW-2016-25)