裸果木对模拟渗透胁迫的生理响应

Physiological responses of Gymnocarpos przewalskii to simulated osmotic stress

摘要

目的 探究裸果木幼苗叶片对PEG渗透胁迫的生理响应规律，为揭示裸果木抗旱生理机制提供理论依据。 方法 以裸果木幼苗为试验材料，采用不同浓度（0%，5%，10%，15%，20%）的PEG-6000分别处理8 h和24 h，测定叶片的部分水分生理指标和抗氧化指标。 结果 在PEG胁迫下，裸果木幼苗叶片的相对含水量显著下降。在胁迫24 h时，随PEG浓度增大，束缚水含量/自由水含量呈现先显著升高后降低的趋势。脯氨酸和可溶性糖含量在PEG胁迫时呈波动变化，但胁迫24 h时达到最大值。丙二醛（MDA）含量随着PEG胁迫程度的增加而上升，胁迫24 h时，所有处理的MDA含量均显著高于对照。过氧化氢含量在PEG胁迫8 h和24 h时均较对照显著升高。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性对8 h和24 h的PEG胁迫响应均达显著水平，过氧化物酶（POD）活性在胁迫24 h时显著增强。 结论 PEG渗透胁迫24 h对裸果木幼苗造成明显的过氧化伤害，增加叶片束缚水比例，主动积累脯氨酸和可溶性糖，增强SOD、CAT、APX和POD酶活性是裸果木适应渗透胁迫的主要方式。

Abstract

Objective To study the response of Gymnocarpos przewalskii seedlings to PEG stress in order to provide a reference for elucidating the drought resistance mechanism of G.przewalskii. Method Under drought stress，the relative water content of the leaves of G.przewalskii seedlings decreased significantly.The ratio of bound to free water content first increased significantly and then decreased with increasing PEG concentration under 24 h stress.The content of proline and soluble sugars fluctuated under PEG stress and accumulated significantly under 24 h PEG stress.The content of malondialdehyde (MDA) increased with the increase of PEG stress and was significantly higher than that of the control under 24 h stress.Hydrogen peroxide levels increased significantly under PEG stress for 8 h and 24 h compared to the control.The activity of superoxide dismutase (SOD),catalase (CAT) and ascorbic acid peroxidase (APX) reached the significant level compared to the control under PEG stress for 8 h and 24 h，and the activity of peroxidase (POD) increased significantly under 24 h stress. Conclusion PEG stress for 24 h caused significant peroxidative damage to G.przewalskii seedlings.The main adaptation of G.przewalskii seedlings to osmotic stress was to increase the amount of bound water，to actively accumulate proline and dissolved sugars，and to increase the activity of SOD，POD，CAT and APX.

Graphical abstract

关键词

裸果木幼苗 / 渗透调节物质 / 抗氧化酶 / PEG胁迫

Key words

Gymnocarpos przewalskii seedling / osmotic regulators / antioxidant enzymes / PEG stress

Author summay

张婷，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

裸果木（Gymnocarpos przewalskii）隶属石竹科裸果木属，是古地中海残遗珍稀濒危植物，在我国主要分布于甘肃河西走廊的大部、新疆部分区域及内蒙古和宁夏中西部，具有抗旱、抗风蚀沙埋、耐盐碱等特点，对研究我国西北和内蒙古地区旱生植物的演变、气候变化具有重要的科学意义^［1］。马松梅等^［2］预测未来裸果木适生区的降水量在40~200 mm，表明裸果木具有较强的干旱适应性。因裸果木分布区生境恶劣，加之人类活动的影响，其种群数量不断减少。干旱对植物的生长发育有着重要的影响^［3］，也是限制植物生长的主要因素^［4］。研究表明，在干旱环境条件下，植物会通过调节自身的生理生化特性，或启动自我防护机制，防止机体受到损伤^［5］，表现在水分代谢、渗透调节、抗氧化系统响应等方面。植物在遭受渗透胁迫时，能够主动积累可溶性糖（SS）、脯氨酸（Pro）以及可溶性蛋白（SP）等物质，实现渗透调节^［6］，保护细胞结构和功能。此外通过抗氧化酶系统来调节活性氧的平衡是植物适应干旱的另一重要机制^［7］。因此，研究植物体内水分代谢、渗透调节物质含量和抗氧化酶系统等的变化，可以有效了解植物应对干旱的生理响应机制。

聚乙二醇（PEG-6000）具有很强的渗透压，可使植物细胞失水，形成干旱胁迫的环境状态^［8］。PEG-6000渗透胁迫效果和植物正常生长干旱的过程类似 ^［9］。邱真静等^［10］用PEG-6000溶液对沙拐枣幼苗进行浸根培养，形成渗透胁迫的环境，研究其生理指标的变化。目前，对裸果木的研究主要涉及种子萌发^［11］、叶片的解剖结构以及生态适应性^［12］、种群结构和空间分布格局^［13-14］等方面，而有关逆境胁迫方面的研究较少，因此，本研究以裸果木幼苗为研究对象，分析其在不同PEG浓度，不同胁迫时间下的生理反应，以期探究其对渗透胁迫的生理适应机制。

1 材料与方法

1.1 苗木培育

裸果木种子采自甘肃安西极旱荒漠国家级自然保护区天然分布的裸果木种群（41°19′01.6"~41°19′31.3" N，95°14′49.9"~95°15′01.9" E）。播前将种子浸入10%的84消毒液3 min，用蒸馏水将消毒液冲洗干净。基质配比为草炭∶蛭石∶珍珠岩=2∶2∶1，用10%多菌灵溶液对基质消毒后，装于发芽盒，每盒种植10穴，每穴3~5粒，深度为1 cm，播种后浇水100 mL，将其置于人工气候培养箱 （托普，GTOP-310Y，浙江托普云农科技股份有限公司 ）内进行培养，培育条件为：25 ℃恒温，光强为4 800 Lx，光照时间为12 h/d，湿度为60%。将裸果木幼苗在人工气候箱培育2个月，待幼苗根茎处木质化时，将其移植于25 cm×30 cm花盆内，室内管理，于五月中旬移至室外，在自然状况下生长。

1.2 试验设计

苗木生长到八月份，选取长势一致的幼苗，洗净根系上的泥土，分别用0%（CK）、5%、10%、15%、20%的聚乙二醇（PEG-6000）溶液进行处理，每处理5个重复，每个重复3株，分别胁迫处理8、24 h后，采集叶片测定各生理指标，重复3次。试样均取自植株同一部位的叶片。试验在室内自然光下进行。

1.3 生理指标的测定

相对含水量（RWC）用烘干称质量法^［15］测定；束缚水（Va）和自由水（Vs）含量用单目WYA （2WAJ）阿贝折射仪（上海精密科学，石家庄现代仪器仪表化工有限公司，中国）测定；参照李合生的方法^［16］，用磺基水杨酸法测定脯氨酸含量（Pro）；用蒽酮比色法测定可溶性糖含量（SS）；用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量（SP）；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量（MDA）；参考刘俊等^［17］的方法测定过氧化氢（H₂O₂）含量；采用氮蓝四唑还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；用愈创木酚法^［18］测定过氧化物酶（POD）活性；参照邹琦^［19］的方法测定过氧化氢酶（CAT）活性和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性。

1.4 数据处理

采用SPSS 24.0统计分析软件，对不同胁迫浓度和时间下的叶片生理指标进行单因素方差分析，用邓肯法（Duncan） 进行差异显著性比较。绘图用Origin2021（America）软件完成。

2 结果与分析

2.1 PEG胁迫对裸果木叶片水分生理的影响

随着PEG浓度的增加和胁迫时间的延长，裸果木幼苗叶片RWC总体上呈下降趋势（图1-A）。胁迫8 h时，PEG浓度为5%~15%时，RWC显著低于CK（P<0.05）；胁迫24 h时，叶片RWC下降明显，各胁迫处理的RWC均显著低于CK（P<0.05），较CK的降幅均超过70%。相同的PEG处理浓度下，胁迫8 h的RWC均显著高于胁迫24 h的，分别达后者的4.1倍、4.0倍、3.1倍、4.7倍。在PEG胁迫8 h时，不同PEG浓度处理下的Va/Vs与CK差异不显著（P>0.05）（图1-B）；胁迫至24 h时，5%PEG胁迫下Va/Vs达到最大，为CK的6.7倍，显著高于其他PEG胁迫处理，10%和15%PEG处理下Va/Vs也显著高于CK（P<0.05），分别为CK的3.3倍、2.8倍；20%的PEG胁迫下Va/Vs低于CK。5%在PEG 处理下，胁迫24 h 的Va/Vs显著高于胁迫8 h时，为胁迫8 h的6.5倍；而PEG浓度为20%时，胁迫24 h 的Va/Vs显著低于胁迫8 h的，是胁迫8 h的13.5%。

2.2 PEG胁迫对裸果木叶片渗透调节物质含量的影响

随着胁迫时间和胁迫程度的增加，幼苗叶片的渗透调节物质含量变化规律存在差异。幼苗叶片的Pro和SS含量整体呈现上升的趋势（图2-A、图2-B），但在PEG浓度达到15%时，胁迫8 h和24 h的Pro含量均呈现下降趋势。胁迫8 h时，PEG处理浓度在5%、10%、20%时Pro含量呈显著上升的趋势（P<0.05）；在胁迫24 h时，叶片Pro含量呈先升高后降低再升高的趋势，但均显著高于CK，在20%PEG处理下Pro含量达到最高，随PEG浓度增大，Pro含量分别较CK高出2.5倍、3倍、2.5倍、3.5倍。在相同PEG浓度胁迫处理下，叶片Pro含量在胁迫8 h和24 h时存在显著差异。PEG胁迫8 h时，叶片SS含量随处理浓度的增加，呈先升高后降低的趋势（图2-B），PEG浓度为10%和15%时，SS含量显著高于CK（P<0.05），当PEG浓度升至20%时，SS含量显著下降（P<0.05）；在胁迫24 h时，叶片SS含量呈现波动趋势，但所有PEG胁迫处理的SS含量均显著高于CK，PEG浓度为20%时，叶片SS含量达到最大，较CK增加48.3%。PEG处理浓度相同时，随胁迫时间延长，SS均显著积累（P<0.05）。

从图2-C中看出，PEG胁迫时间不同时，SP含量对PEG浓度变化的响应规律存在差异。在胁迫8 h时，SP含量随PEG处理浓度的增加而降低，PEG浓度≥10%时各处理SP含量显著低于CK（P<0.05），在PEG浓度20%时SP含量最低，较CK降低了40%；在胁迫24 h时，叶片SP含量呈先上升后下降趋势，不同PEG浓度处理SP含量与CK均无显著差异（P>0.05）。PEG浓度为10%~20%时，胁迫24 h时的SP含量均显著高于胁迫8 h时（P<0.05），较8 h分别高出1.4倍、1，7倍、1.5倍。

2.3 PEG胁迫对裸果木叶片丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量的影响

随着PEG浓度的增加及胁迫时间的延长，叶片MDA含量逐渐升高（图3-A）。在15%和20%的PEG胁迫8 h时，MDA含量显著高于CK（P<0.05），为CK的1.7倍和1.8倍；在胁迫24 h时，不同浓度PEG处理下MDA含量均显著高于CK（P<0.05），20% PEG处理下，MDA含量达最大，为CK的2.6倍。在相同PEG浓度处理下，胁迫24 h时的MDA含量均显著高于胁迫8 h时的（P<0.05），随PEG浓度的增加，分别为胁迫8 h的1.8倍、1.6倍、1.4倍、1.5倍，膜脂过氧化程度明显加大。

从图3-B中看出，随着PEG浓度的增加及胁迫时间的延长，叶片的H₂O₂含量显著上升（P<0.05）。PEG胁迫8 h 时，不同PEG浓度处理下H₂O₂含量与CK均达显著性差异，较CK、5%、10%、15%和20% PEG处理增幅依次为53.3%、51.3%、16.8%、59.6%；在胁迫24 h时，各PEG浓度处理下H₂O₂含量也显著高于CK（P<0.05），在PEG浓度为20%时含量最高，为CK的1.6倍。在相同PEG浓度处理下，胁迫24 h的H₂O₂含量均显著高于胁迫8 h的（P<0.05），随PEG浓度增大，胁迫24 h分别为胁迫8 h的1.4倍、1.5倍、2.0倍、1.6倍，且在PEG处理浓度15%时达到最显著。

2.4 PEG胁迫对裸果木叶片抗氧化酶活性的影响

随着PEG胁迫程度的加大，裸果木幼苗叶片的抗氧化酶活性整体呈上升的趋势（图4）。PEG胁迫8 h和24 h时，各浓度处理下的SOD活性均显著高于CK（图4-A），均为20%处理下达到峰值，分别为CK的1.9倍和2.8倍。在相同PEG处理浓度下，叶片的SOD活性在胁迫24 h时均较胁迫8 h时显著增强，分别为8 h的1.6倍、1.8倍、1.5倍、1.5倍。在胁迫8 h时，叶片POD活性上升缓慢（图4-B），当PEG浓度≥15%时，POD活性显著高于CK（P<0.05）；在胁迫24 h时，不同浓度PEG处理下POD活性显著高于CK（P<0.05），PEG浓度为20%的处理下，POD活性达到最大值，为CK的12.9倍。在相同浓度的PEG胁迫下，叶片POD活性在胁迫24 h时显著高于胁迫8 h时，分别为胁迫8 h的4.1、6.9、6.4、5.9倍。CAT活性对PEG胁迫响应显著（图4-C），在胁迫8 h时，不同PEG处理浓度之间CAT活性均显著高于CK（P<0.05），在PEG浓度为15%时最高，为CK的5.7倍；在胁迫24 h时，叶片CAT活性呈波动趋势，但均显著高于CK（P <0.05），在PEG浓度为20%处理下，叶片CAT活性达最大，为CK的6.9倍。在相同浓度不同胁迫时间下，8 h胁迫和24 h胁迫的叶片CAT活性均存在显著性差异（P<0.05），胁迫24 h时各处理下CAT活性均显著高于胁迫8 h，随着PEG浓度的增大，分别为胁迫8 h的1.7倍、2.2倍、1.2倍、1.5倍。图4-D表明，PEG胁迫8 h时，不同PEG浓度之间APX活性均显著高于CK（P<0.05）；胁迫24 h时，叶片APX活性呈现持续上升的趋势，不同胁迫程度的叶片APX活性显著高于CK，且在该胁迫时间段PEG浓度为20%时，叶片APX活性最大，为对照的4.1倍。在相同胁迫程度下，当PEG浓度为15%和20%时，胁迫24 h的APX活性显著高于胁迫8 h的，增幅分别为55.8%和28.5%。

3 讨论

3.1 裸果木幼苗叶片对渗透胁迫的水分生理响应

水分代谢指标是植物遭受水分胁迫时最直观表达其水分状况的指标。在出现渗透胁迫时，叶片RWC随胁迫程度的增大而下降^［20］，RWC越高越稳定，植物干旱适应性就越强^［21］。有研究显示，当Va/Vs较低时，说明植物体内的代谢较强，反之，则代谢较弱，但抗性较强^［22］。本研究中裸果木幼苗叶片在PEG胁迫8 h和24 h时，叶片RWC均较CK显著下降，在PEG胁迫8 h下，15% PEG处理RWC下降，而后20% PEG处理下显著上升，可能是因为在水分不足时植物能在一定限度内缓和组织缺水的程度。天目琼花和接骨木在PEG胁迫下也表现出类似的变化规律^［23］。Va/Vs呈上升趋势，表明渗透胁迫下，裸果木幼苗叶片失水明显，5%~15%的PEG胁迫24 h时，Va/Vs显著增大，叶片代谢活动减弱，起到了一定的保水作用，但当PEG浓度增至20%时，Va/Vs低于CK，细胞严重失水，这和PEG胁迫下胡枝子的Va/Vs变化规律相似^［24］。渗透调节作用是植物应对渗透胁迫的一种应激反应，通过调控植物细胞的代谢活动，使细胞内的溶质浓度增加，减少细胞的渗透量，使植物从较低的外界水势中持续吸水，维持一定的细胞膨压，使植物能进行正常的生长发育和细胞代谢^［25］。渗透调节物质的含量与植物应对渗透胁迫时的适应能力密切相关^［26］，通常情况下，渗透调节物质含量越高，植物抵御干旱的能力越强。植物在遭受渗透胁迫后，为了维持正常的生命活动，植株体内通常会出现渗透调节物质的不断积累^［6，10］，Pro作为一种有效的渗透调节物质，对维持原生质和调节环境渗透平衡具有重要作用，还可以与蛋白质类的物质相互作用，减少可溶性蛋白质的沉淀，增强不同蛋白质之间的水合互作，减轻细胞结构在缺水严重时受到的损害，有助于维持植物细胞膜结构的完整性^［27］。本研究发现裸果木幼苗叶片在PEG渗透胁迫条件下，Pro含量随着胁迫程度的增加不断累积，发挥了显著的渗透调节作用。SS可溶性糖一方面可以有效地降低植物体内的渗透势，维持较高的渗透压^［28］，另一方面还能够稳定酶活性和细胞膜结构。在本研究中裸果木幼苗叶片PEG胁迫8 h时，SS含量随着PEG胁迫程度的增加呈先升后降的趋势，可能是在该胁迫时间段PEG浓度达到最高时，严重的水分亏缺导致幼苗叶片水势不断降低，植物细胞中渗调能力减弱或丧失造成的^［29］；胁迫至24 h时，SS含量较CK均显著上升，说明SS主动积累，使渗透势降低，防止了细胞过度脱水，从而提高了幼苗的抗失水能力，彭亮等^［30］的研究也证实了这一结论。PEG处理24 h时，随浓度的增大，SS表现出“N”型的变化趋势，邱真静等^［10］研究发现武威种源的沙拐枣，在相同的PEG浓度梯度下（10%~20%），处理48 h和72 h也呈现相似的变化规律，可能是不同的渗透调节物质之间存在一定的补偿作用。SP在植物抗旱性方面也起一定作用，其含量越高细胞水势就越低，细胞结构在干旱时受到的伤害就越少^［31］。叶片SP含量在PEG胁迫8 h时表现为下降趋势，在胁迫24 h后，呈先升后降的变化规律，胁迫前期SP含量不断降低，可能是该胁迫条件下，蛋白质合成被抑制，蛋白质的降解速度加快，胁迫后期SP含量增加，原因可能是随着胁迫时间和胁迫强度的增加，导致叶片一定程度的膜损伤，从而开始释放蛋白质，蛋白质水解提高了蛋白酶活性，水解出来的氨基酸可以合成抗氧化酶等物质来应对干旱环境^［32］。

3.2 裸果木幼苗叶片抗氧化系统对渗透胁迫的响应

MDA作为膜脂过氧化的最终分解产物，会在一定程度上反映出细胞膜脂过氧化的程度和植物面对逆境胁迫时的适应能力^［33-34］。MDA水平越高，植物的抗逆性越弱^［35］。谢志玉等^［36］研究表明，在渗透胁迫期间，文冠果MDA含量呈逐渐升高趋势，且渗透胁迫程度越高，MDA含量越高。本研究也发现，裸果木幼苗叶片随着PEG胁迫程度的增加，MDA含量也在不断上升，不同浓度的PEG胁迫24 h时，MDA增幅显著，表明已造成了明显的膜系统损伤。

H₂O₂是氧化性胁迫中研究较为深入的一种活性氧，它的存留时间较长，活性小，可以扩散到细胞的各个部位。H₂O₂在低浓度下可以作为信号分子，在各种生物和非生物胁迫下触发信号系统，但在高浓度下会导致细胞程序死亡^［37］。本研究中表明，PEG胁迫8 h和24 h时，各处理浓度H₂O₂含量均显著高于对照，且PEG胁迫24 h时，结合MDA含量的变化规律及H₂O₂的作用，推测在20%的PEG胁迫8 h、24 h时，H₂O₂主要表现为对细胞的损伤作用。在玉米^［38］及一品红^［39］叶片的研究结果也证实了这一规律，表明严重的渗透胁迫使得植物细胞中的H₂O₂大量积累，对膜系统造成了明显的氧化损伤。

在本研究中裸果木幼苗叶片在PEG胁迫下，随着胁迫程度的增加，SOD活性显著增强，表明裸果木在渗透胁迫下可以及时启动SOD的防御机制，清除过量的自由基，减轻膜系统伤害，这与红松幼苗SOD对干旱的响应规律一致^［40-43］。本研究发现，POD在PEG胁迫8 h时增幅较小，胁迫24 h时POD活性显著升高，可能是因为裸果木在受到较严重的渗透胁迫时，启动了POD清除H₂O₂的机制。崔秀妹等^［44］研究发现，在水分胁迫下扁蓿豆可以增强CAT活性清除活性氧，减轻细胞膜受损程度。渗透胁迫下玫瑰花APX活性不断增强，是重度渗透胁迫下玫瑰的关键抗氧化酶^［45］。在本研究结果表明，随PEG胁迫程度加大，裸果木幼苗叶片的CAT和APX活性均持续显著增强，对清除H₂O₂发挥了重要作用，这与崔鹏等^［46］在裸果木幼苗响应土壤渗透胁迫的研究中得出的结论相一致。

4 结论

PEG渗透胁迫造成裸果木幼苗叶片明显失水，PEG胁迫24 h时，水分亏缺更为明显，叶片能够通过显著提高束缚水比例，主动积累脯氨酸和可溶性糖，提高保水能力，降低渗透势，保持细胞膨压，适应一定程度的渗透胁迫。

PEG胁迫使裸果木叶片发生膜脂过氧化作用，PEG胁迫24 h时H₂O₂过量积累，对叶片细胞膜系统产生了明显的过氧化伤害，幼苗主要通过显著增强叶片的SOD、POD、CAT、APX活性，清除过量的自由基，减轻膜系统损伤，缓解渗透胁迫。

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基金资助

甘肃农业大学学科建设专项基金(GSAU-XKJS-2018-110)