复合生物保鲜剂对微冻大口黑鲈鱼保鲜效果的优化配比

Optimal ratio of compound biopreservatives to the preservation effect of micro-frozen Micropterus salmoides

摘要

目的 为延长大口黑鲈鱼的货架期，以期为大口黑鲈鱼的贮藏保鲜提供理论参考依据。 方法 选取乳酸链球菌素（Nisin，NI）、普鲁兰多糖（Pullulan，LP）和山梨酸钾（Potassium sorbate，PS）进行单因素试验，利用响应面Box-Behnken 试验设计对复合生物保鲜剂进行优化，筛选出了0.22%NI、1.61%LP、4.14%PS为最佳配比。使用最佳配比的复合保鲜剂对微冻贮藏期间大口黑鲈鱼肉的pH值、菌落总数（total viable count，TVC）、TVB-N（ total volatile base nitrogen，TVB-N）值、肌动球蛋白含量、巯基含量、Ca²⁺-ATPase活性、持水力（Water holding capacity，WHC）进行测定。 结果 复合生物保鲜剂组（NLP组）在贮藏期结束时（10 d），pH值仍小于7.0；TVB-N值未超过12 mg/100g；菌落总数未超过5.0 lg（CFU/g）；鱼肉持水力、肌动球蛋白含量、巯基含量和Ca²⁺-ATPase活性下降了7.08%、11.01%、22.07%和28.33%。对照组（CK组） 在贮藏期结束时，pH值大于7.0；TVB-N值已达到12.55 mg/100g；菌落总数已超过5.0 lg（CFU/g）； 持水力、肌动球蛋白含量、巯基含量和Ca²⁺-ATPase活性分别下降了10.75%、22.62%、34.78%和40.48%。 结论 复合生物保鲜剂能有效减缓大口黑鲈鱼肉微生物指标及各项理化指标的变化，对延缓鱼肉腐败变质、延长货架期具有较好的效果。

Abstract

Objective To extend the shelf life of Micropterus salmoides，to provide a theoretical reference for the storage and preservation of Micropterus salmoides. Method Potassium sorbate (PS)，nisin (NI)，pullulan (LP) and potassium Sorbate (PS) were selected for the single factor test.The response surface Box-Behnken test design was used to optimize the composute biological preservative.The optimum ratio was 0.22% NI，1.61% LP and 4.14% PS.pH value，total viable count (TVC) and total volatile base nitrogen (TVB-N) of M.salmoides during micro-frozen storage were evaluated with the optimum ratio of the combined preservative.TVB-N value，actomyosin content，sulfhydryl content，Ca²⁺-ATPase activity and water holding capacity (WHC) were determined. Result At the end of the storage period (10 d)，the pH of the combined biological preservative group (NLP group) was still below 7.0.The TVB-N value did not exceed 12 mg/100 g; the total number of colonies did not exceed 5.0 lg (CFU/g).Water retention，actomyosin content，sulfhydryl content and Ca²⁺-ATPase activity decreased by 7.08%，11.01%，22.07% and 28.33%，respectively.At the end of the storage period，the pH of the control group (CK group) was higher than 7.0.The TVB-N value reached 12.55mg /100g; the total number of colonies exceeded 5.0 lg (CFU/g).Water retention，actomyosin content，sulfhydryl content and Ca²⁺-ATPase activity decreased by 10.75%，22.62%，34.78% and 40.48%，respectively. Conclusion The combined biological preservative could effectively slow down the changes in microbiological indexes and various physicochemical indexes of M.salmoides，and had a better effect on delaying fish deterioration and prolonging shelf life.

Graphical abstract

关键词

大口黑鲈 / 乳酸链球菌素 / 普鲁兰多糖 / 山梨酸钾 / 保鲜

Key words

Micropterus salmoides / nisin / pullulan / potassium sorbate / preservative

Author summay

郑稳，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

大口黑鲈（Micropterus salmoides）为鲈亚目（Percoidei）棘臀鱼科（Centrarchidae）黑鲈属（Micropterus）高蛋白低脂肪的优质鱼类，是我国淡水养殖的主要品种之一^［1］。然而宰杀后的大口黑鲈由于其特殊的营养成分及特征极易发生腐败变质，因此，通常采用涂膜、保鲜剂或气调包装结合冷藏、微冻或冻藏来延缓其变质的进程^［2］。

普鲁兰多糖（Pullulan，LP）是一种由出芽短梗霉发酵产生的胞外多糖，具有吸附性、黏稠性、成膜性和膜不透性等优点，既有一定的抑菌作用，也是一些抑菌抗氧化物质的有效载体，近年来已广泛应用于食品保鲜^［3］。李惠^［4］等研究了普鲁兰多糖水溶液对冰藏白虾的保鲜效果，结果发现普鲁兰多糖在白虾表面形成保护膜，阻止了氧气的进入，从而有效抑制了白虾体内细菌和酶的活性，延长保鲜期3 d。乳酸链球菌素（Nisin，NI） 是一种由乳酸乳球菌发酵后提取而制得的抗菌肽类食品添加剂，具有良好的抑菌性，可以抑制绝大多数的芽孢杆菌和革兰氏阳性菌的生长，应用广泛^［5］。将乳酸链球菌素单独用于保鲜的研究较少，为了增强保鲜效果，将其与其他抑菌物质结合制备复合保鲜剂的研究较为常见，陈欢鑫^［6］等在乳酸链球菌溶液中添加燕麦蛋白与普鲁兰多糖，用所得复合保鲜剂对草莓进行冷藏保鲜，结果表明复合保鲜剂可有效减少草莓表面硬度的损失，降低草莓的成熟速度，相较于对照组延长草莓货架期7d。山梨酸钾（Potassium sorbate，PS）有很强的抑制腐败菌和霉菌的作用，对革兰氏阴性菌抑制作用比革兰氏阳性菌高2倍以上，已成为世界上最主要的防腐剂^［7］。李萌^［8］等探究山梨酸钾对冷藏河豚鱼片优势腐败菌的抑制作用，结果发现山梨酸钾对革兰氏阴性菌荧光假单胞菌的抑制作用极强，且能完全抑制鱼肉汁基质中热杀索丝菌和乡间布丘氏菌的生长繁殖，显著延长鱼肉的货架寿命。

刘淑彦等^［9］对大口黑鲈鱼优势腐败菌进行分离鉴定，结果发现鱼肉中主要存在9种腐败菌，其中革兰氏阳性菌3种、革兰氏阴性菌6种。因此，结合大口黑鲈鱼优势腐败菌的种类及单一保鲜剂的抑菌效果，本实验选用普鲁兰多糖、山梨酸钾和乳酸链球菌素进行复配对大口黑鲈鱼进行保鲜研究，以菌落总数为响应值，采用响应面Box-Behnken设计优化保鲜剂的最佳复配条件，并对复合保鲜剂的保鲜效果进行验证。本研究的目的在于确定微冻条件下大口黑鲈复合生物保鲜剂的最优复配比，为大口黑鲈鱼在贮运过程中的品质控制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

活体大口黑鲈鱼购于上海市浦东新区芦潮港海鲜批发市场，每条质量（0.6±0.1） kg、体长（28±3）cm。

普鲁兰多糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山梨酸钾，上海麦克林生化科技股份有限公司；乳酸链球菌素，上海吉至生化科技有限公司；平板计数琼脂培养基（PCA），广州天骏生物科技有限公司；总蛋白定量测定试剂盒（BCA法），南京建成正浩科技有限公司；总巯基测定试剂盒，北京峰格生物技术有限公司；超微量Ca²⁺-ATP酶试剂盒，柏吉生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

pH计，奥豪斯仪器（ 上海） 有限公司；BS-210型电子天平，德国Sartorius Instruments有限公司；Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪，丹麦 FOSS 公司；SPARK型酶标仪，瑞士TECAN仪器公司；H-1850离心机，湖南湘怡实验室仪器开发有限公司：SZ-130010型磁力搅拌器，上海禾汽玻璃仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理及贮藏

活体大口黑鲈鱼洗净宰杀，去皮、去头尾、去内脏，取背部肌肉切成约4 cm×4 cm×1 cm的均一鱼片，擦干表面水分后，浸泡在不同配方的复合保鲜剂溶液中30 min，将浸泡完成的鱼肉取出沥干后，分装于保鲜袋中，每袋封装300g左右，贮存于-2 ℃冰箱中。

1.2.2 单一生物保鲜剂浓度的筛选

以生物保鲜剂对大口黑鲈菌落总数的影响为依据，将3种生物保鲜剂配制成不同的浓度梯度。分别称取乳酸链球菌素（Nisin，NI） 0.3 g、0.4 g、0.5 g、1.0 g、1.5 g，加蒸馏水定容至500 mL，制成浓度为：0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.3%的Nisin溶液，分别为NI₁、NI₂、NI₃、NI₄、NI₅。分别称取普鲁兰多糖（Pullulan，LP） 2.5 g、5 g、7.5 g、10 g、12.5 g，加蒸馏水定容至500 mL，制成浓度为：0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的普鲁兰多糖溶液，分别为LP₁、LP₂、LP₃、LP₄、LP₅。分别称取山梨酸钾（potassium sorbate，PS）5 g、10 g、15 g、20 g、25 g，加蒸馏水定容至500 mL，制成浓度为：1%、2%、3%、4%、5%的山梨酸钾溶液，分别为PS₁、PS₂、PS₃、PS₄、PS₅。经上述生物保鲜剂处理的大口黑鲈鱼，于-2 ℃条件下贮藏10 d，测定各组的菌落总数。

1.2.3 复合保鲜剂配比优化

以大口黑鲈鱼在-2 ℃贮藏10 d的菌落总数为响应值，根据单因素试验的结果，选取Nisin、普鲁兰多糖、山梨酸钾的3个浓度，进行三因素三水平响应面试验，筛选最佳配比的复合生物保鲜剂。响应面设计因素及水平如表1所示。

1.3 复合保鲜剂对大口黑鲈的保鲜效果

按照1.2.1的处理方法，将大口黑鲈鱼肉随机分为2组，一组为实验组（NLP组），使用最优配比的复合生物保鲜剂处理；另一组为对照组（CK组），使用蒸馏水浸泡处理。沥干后将两组鱼肉在-2 ℃冰箱中贮藏10 d，每隔2 d测定一次鱼肉的物化指标。

1.3.1 TVB-N值的测定

参考邓添等^［10］的方法测定TVB-N的含量，并稍加改动。

1.3.2 pH的测定

参考刘欣荣^［11］等的方法，称取5 g绞碎的鲈鱼肌肉，加入50 mL去离子水，均质30 s浸提1 h后过滤，取上清液测定pH值，每个样品重复测定2次，取平均值。

1.3.3 TVC的测定

依照 GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数》，测定大口黑鲈鱼肌肉菌落总数。

1.3.4 肌动球蛋白的测定

参考Zhou等^［12］的方法提取肌动球蛋白并稍加修改。

提取方法：准确称取2 g大口黑鲈鱼肉于烧杯中，绞碎后加入10 mL预冷的KCl溶液（0.6 mol/L，pH7.0），在冰浴条件下均质3 min，为防止溶液过热，每均质20 s停10 s。均质结束后，12 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，收集上清液。向上清液加入3倍体积预冷的蒸馏水，12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，收集沉淀后加入等体积的预冷KCl溶液（1.2 mol/L，pH 7.0），冰浴条件下搅拌20 min，再次离心收集上清液，上清液即为肌动球蛋白。

测定方法：参照南京建成蛋白定量测试盒（BCA法）说明书，在波长562 nm处测定D值。

1.3.5 总巯基的测定

以肌动球蛋白为待测样，参照北京峰格总巯基测定试剂盒说明书的方法进行测定，在波长412 nm处测定D值。

1.3.6 Ca²⁺-ATPase活性的测定

以肌动球蛋白为待测样，参考柏吉生物超微量Ca²⁺-ATP酶试剂盒说明书进行测定，在波长636 nm处测定D值。

1.3.7 持水力的测定

参照Thiansilakul^［13］的方法。精确称取5 g左右鱼肉 （W₁），擦干鱼肉表面的水分后置于干燥离心管4 ℃、6 000 r/min离心10 min，再精确称质量（W₂）.按照公式计算持水力。

WHC(\mathrm{\%})=\frac{W_{\mathrm{1}}-W_{\mathrm{2}}}{W_{\mathrm{1}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.4 数据处理

采用Excel 2019进行数据记录和整理，采用SPSS 17.0、Excel 2019和Design-expert 8.0.6进行图形的绘制。

2 结果与分析

2.1 单一生物保鲜剂浓度的筛选

菌落总数能够反映大口黑鲈鱼的品质变化情况，刘恒睿等^［14］研究表明，菌落总数值≤5 lg（CFU/g）为一级鲜度，菌落总数≤5.7 lg（CFU/g）为二级鲜度，菌落总数>6 lg（CFU/g）不可食用。由图1可知，不同浓度的普鲁兰多糖组的菌落总数结果相近，考虑到高浓度普鲁兰多糖对大口黑鲈鱼肉感官品质具有一定的影响以及经济成本较高，因此在后续试验中选择1.5%作为普鲁兰多糖的试验点。

与普鲁兰多糖处理的大口黑鲈鱼相比，乳酸链球菌素组和山梨酸钾组的菌落总数明显降低。随着乳酸链球菌素与山梨酸钾浓度的升高，菌落总数逐渐降低，但当乳酸链球菌素浓度为0.1%时，菌落总数值降低至4.49 lg（CFU/g），随后菌落总数的下降趋势趋于平缓，因此选择浓度为0.1%、0.2%、0.3%的乳酸链球菌素进行响应面试验。当山梨酸钾浓度由1%到3%时，菌落总数减少明显，当山梨酸钾浓度由3%增至5%时，菌落总数值降低速度平缓，所以选择3%、4%、5%的山梨酸钾进行响应面试验。

2.2 保鲜剂的响应面优化试验

2.2.1 Box-Benhnken试验设计方案及试验结果

根据单因素试验结果，选取山梨酸钾添加量 （A）、普鲁兰多糖添加量（B）、乳酸链球菌素添加量（C）为自变量，菌落总数（Y）为响应值，采用响应面中的Box-Behnken设计试验对保鲜剂进行优化，并进行多元回归拟合。其试验方案及结果如表2所示。

2.2.2 多元回归模型分析

对试验结果进行多元回归拟合分析，得到以菌落总数为评价指标的回归方程为：

Y=3.56-0.096B-0.099C-0.11AB-0.19AC+0.035BC+0.80A²+0.23B²+0.28C²

由表3可知，该模型回归极显著（P<0.01），说明该模型对菌落总数有显著意义。失拟项不显著（P>0.05），表明拟合度较好。校正决定系数R²_adj=0.970 1，说明该模型能解释97.01%响应值的变化。离散系数C.V.=2.1%，在可接受范围内，说明该模型可信度较高。其中，A、AC和A²、B²、C²对菌落总数的影响极显著（P<0.01），B、C、AB对菌落总数的影响显著（P<0.05），而BC对菌落总数的影响不显著（P>0.05）。从A、B、C的F值大小可判断出各因素对菌落总数的影响大小，得出各试验因素对鱼肉菌落总数的影响顺序为A>C>B，即山梨酸钾>乳酸链球菌素>普鲁兰多糖。

2.2.3 响应面交互作用分析

根据回归模拟方差分析的结果，用Design-expert 8.0软件进行优化，得到交互作用图和等高线如图2所示，AC和AB菌落总数的等高线分布较为密集，且均为椭圆形，说明山梨酸钾与普鲁兰多糖、乳酸链球菌素的两两交互作用显著^［15］，对抑制大口黑鲈鱼肉菌落总数的上升具有协同作用。响应面开口向上，响应值存在最小值，山梨酸钾分别与乳酸链球菌素、普鲁兰多糖的曲面比乳酸链球菌素和普鲁兰多糖的曲面更陡峭，说明山梨酸钾对菌落总数的影响较大，这也与回归模拟方差分析的结果一致。

2.2.4 验证试验

根据响应面试验结果，得到模型预测的最佳复合保鲜剂配方：乳酸链球菌素添加量为0.22%、普鲁兰多糖添加量为1.61%、山梨酸钾添加量为4.14%，在此条件下预测大口黑鲈鱼菌落总数为3.53 lg （CFU/g）。选取该复合保鲜剂进行验证，经过5次重复试验得到大口黑鲈鱼的平均菌落总数为3.72 lg （CFU/g），预测值与试验值吻合度为94.89%，误差小于6%，与回归方程预测值相近，表明此模型能较准确的反映出复合保鲜剂对大口黑鲈鱼的保鲜效果。

2.3 复合保鲜剂对大口黑鲈鱼的保鲜效果

2.3.1 TVB-N值的变化

TVB-N是对水产品质量评估的主要参数之一，一般认为淡水鱼TVB-N值低于12 mg/100g为一级鲜度，高于20 mg/100g不可食用。如图3所示，各处理组的TVB-N值随贮藏时间的延长均逐渐上升，CK组上升速度较快，第9天时CK组的TVB-N值超过12 mg/100g，处于二级鲜度，NLP组低于CK组，处于一级鲜度。至贮藏期结束，CK组TVB-N值为12.55 mg/100g，而NLP组为11.35 mg/100g，仍属于一级鲜度，且贮藏期内NLP组TVB-N值始终低于CK组，这可能是因为复合保鲜剂抑制了鱼肉内源酶和腐败微生物所分解的胞外酶的活性，使蛋白质分解产生氨以及胺类等碱性含氮物质的速率降低，影响了TVB-N值的变化^［17］。

2.3.2 pH值的变化

pH值的变化情况可在一定程度上表征大口黑鲈的新鲜程度，是评价鱼肉品质的指标之一。如图4所示，各组的pH值均呈现先下降后上升的趋势，这可能因为在大口黑鲈死后体内的磷酸肌酸和ATP等物质分解产生乳酸等酸性物质，同时糖原酶解产生乳酸，使鱼肉pH值下降^［18］。随着贮藏时间的延长，鱼肉蛋白质在微生物和酶的作用下不断分解产生碱性物质，使pH值回升。CK组鱼肉pH值在第4天降低到最小值6.65，NLP组第6天降低到最小值6.31，贮藏期内CK组鱼肉pH值高于NLP组，原因可能是普鲁兰多糖的抗氧化作用阻碍了鱼肉中肌原纤维蛋白的氧化，抑制了游离氨基酸和多肽的生成^［19］。乳酸链球菌素和山梨酸钾的抑菌作用，抑制了氨基酸、多肽等营养物质的分解，减少了碱性物质的生成，因此NLP组pH值的上升速度较慢。

2.3.3 TVC的变化

微生物是导致水产品变质的重要原因，因此，在美国以及一些欧洲国家已经将计算总活菌数作为水产品的强制性标准。由图5可知，两组鱼肉的TVC均随贮藏时间的延长先降低后升高，降低的原因可能是因为鱼肉温度降低过快，鱼体表面的嗜温菌出现死亡^［20］。新鲜鱼肉TVC为3.1 lg（CFU/g），处于一级鲜度。贮藏第9天时，CK组菌落总数超过5.0 lg（CFU/g），处于二级鲜度，而NLP组至贮藏结束（10 d）仍处于一级鲜度，且在整个贮藏期内始终低于CK组，这是因为大口黑鲈鱼的优势腐败菌为革兰氏阳性菌，Nisin对革兰氏阳性菌的抑制作用较强，因此NLP组菌落总数的上升速度较慢^［9］。综上发现复合保鲜剂可显著抑制微生物的生长。

2.3.4 肌动球蛋白含量的变化

肌动球蛋白是肌动蛋白与肌球蛋白作用形成的复合物，是构成肌原纤维的主要成分，在一定程度上可以反映鱼肉蛋白质的变性程度^［21］。由图6可知，两处理组鱼肉的肌动球蛋白含量均呈先上升后下降的趋势，上升的原因可能是肌动蛋白与肌球蛋白在ATP的作用下产生聚合，形成了大分子质量的分子聚集沉淀起来，这与于林^［22］的研究结果相似。贮藏期内，大口黑鲈鱼的肌动球蛋白含量总体呈下降趋势，新鲜大口黑鲈鱼的肌动球蛋白含量为33.2 mg/g，到第10天，CK组肌动球蛋白含量为25.69 mg/g，下降了22.62%，而NLP组肌动球蛋白含量为29.28 mg/g，下降了11.81%，说明在贮藏期间，CK组鱼肉肌动球蛋白变性更加严重，复合保鲜剂改善了肌动球蛋白的性能，对肌动球蛋白的变性有一定的抑制作用。

2.3.5 巯基含量的变化

巯基（-SH）含量是衡量鱼肉蛋白质变性聚合的重要指标，贮藏期间鱼肉巯基含量越高，说明鱼肉蛋白质变性聚合程度越低^［23］。由图7可知，不同处理组的鱼肉巯基含量均呈下降的趋势，这是因为鱼肉蛋白质发生氧化时，蛋白内部的巯基会因活性巯基的不稳定性形成了二硫键（-S-S-）^［24］。CK组的-SH含量从初始值5.98×10^-5 mol/g到贮藏末期的3.90×10^-5 mol/g，下降了34.78%，NLP组到贮藏末期由初始值下降到了4.66×10^-5 mol/g，下降了22.07%。NLP组下降较慢可能是因为复合保鲜剂抑制了鱼体内源酶的活性，从而抑制了鱼肉肌原纤维的降解，影响了-SH 被氧化成二硫键（-S-S-）的进程，进而延缓了-SH含量的下降。结合图6发现大口黑鲈鱼肉肌动球蛋白含量的变化趋势与-SH一致，这可能与-SH氧化产生的-S-S-使肌动球蛋白发生重链聚合，降低其盐溶性有关^［25］。

2.3.6 Ca²⁺-ATPase活性的变化

Ca²⁺-ATPase活性是评价鱼肉中蛋白质变性程度的重要指标，其活性越低，表明鱼肉蛋白质性质越不稳定，变性程度越高^［26］。如图8所示，随着贮藏时间的延长，鱼肉Ca²⁺-ATPase活性均呈现下降的趋势，至第10天，CK组由初始值4.2 μmol Pi/（mg pro·h）下降至2.5 μmol Pi/（mg pro·h），下降了40.48%，而NLP组下降至3.01 μmol Pi/（mg pro·h），下降了28.33%。贮藏期内，CK组Ca²⁺-ATPase活性的下降速度高于NLP组，这可能是因为复合保鲜剂抑制了鱼体内外微生物的生命活动及鱼体内源酶活性，影响了鱼肉肌原纤维蛋白及ATP的分解速度，进而抑制了Ca²⁺-ATPase活性的下降^［27］。结合图7发现Ca²⁺-ATPase活性的下降趋势与-SH的下降趋势相似，这是因为在微冻产生的低温条件-SH的氧化程度下降，微生物破坏蛋白质的能力降低，因而使Ca²⁺-ATPase活性下降的趋势降低^［28］。

2.3.7 持水力的变化

持水力是评价鱼肉持水能力的指标，其对鱼肉的色泽、质地等食用品质存在较大的影响^［29］。从图9可看出，两组鱼肉的持水力均呈下降的趋势，持水力逐渐下降可能是由于大口黑鲈鱼肌肉的大分子网状结构被破坏^［30］。至贮藏期结束（第10 d）CK组持水力由初始值85.62%下降至76.42%，下降了10.75%，NLP组则由初始值下降至78.87%，下降了7.88%，且NLP组持水力始终高于CK组，这可能是由于复合保鲜剂减缓了大口黑鲈鱼肌肉的自溶和劣变，从而更好地维持了鱼肉的持水能力^［31］。

3 讨论

山梨酸钾和乳酸链球菌素具有良好的抑菌能力，普鲁兰多糖既具有一定的抑菌效果，又能作为抗菌物质的有效载体。本研究根据单因素实验结果，确定了山梨酸钾、乳酸链球菌素及普鲁兰多糖的最佳浓度分别为4%、0.2%和2%，在此基础之上，通过Box-Behnken设计响应面实验优化复合保鲜剂配方，确定复合保鲜剂的最佳配比为0.22%乳酸链球菌素、4.14%山梨酸钾和1.61%普鲁兰多糖。

乳酸链球菌素是一种天然抗菌肽，可以在细胞质膜上形成空洞，通过破坏质子动力和pH的平衡来抑制革兰氏阳性细菌^［32］。夏天兰^［33］等采用乳酸链球菌素对冷却猪肉进行保鲜，结果发现经乳酸链球菌素保鲜液处理的肉TVB-N含量显著优于对照组，且在23 d内都处于可食用范围内，然而乳酸链球菌素抑菌谱较窄，仅对革兰氏阳性菌有抑制作用，而山梨酸钾能抑制革兰氏阴性菌，且与乳酸链球菌有极显著的交互作用。鱼体内外微生物的生长及内源酶的活性得到抑制，有效控制TVB-N、PH及菌落总数的变化。此外，普鲁兰多糖的抗氧化作用也可起到控制PH及菌落总数变化的作用。张盼^［34］等的研究也得出了相同的结论。

鱼肉贮藏至中后期，蛋白质的氧化变性及蛋白酶的降解作用，导致肌动球蛋白含量显著降低，而乳酸链球菌素和普鲁兰多糖具有较好的抗氧化作用，因此实验组肌动球蛋白含量的下降速率更低。此外，巯基基团易在蛋白质分子内发生氧化，在贮藏期间极易被氧化为二硫键而使其含量降低，复合保鲜剂的抗氧化作用抑制了蛋白质的氧化，减缓了巯基暴露于蛋白质外部的过程，从而减慢了巯基的氧化速率。Ca²⁺-ATPase活性在一定程度上可表征蛋白质的变性程度，随着贮藏时间的延长，鱼肉Ca²⁺-ATPase活性均呈现下降的趋势，但由于复合保鲜剂较好的抑制了鱼肉肌原纤维蛋白及ATP的分解速度，因此实验组鱼肉Ca²⁺-ATPase的活性更高^［35］。秦求思^［36］也发现肌原纤维蛋白及ATP的分解速度降低后，鱼肉Ca²⁺-ATPase的活性更高。

结构蛋白决定了肌肉的持水力，蛋白发生氧化鱼肉持水力会降低，贮藏过程中两组鱼肉的持水力均呈现下降的趋势，但实验组下降的速度更慢，这可能是因为普鲁兰多糖是亲水性的多糖，在鱼表面形成了大分子网状结构，减缓了肌肉水分的流失。陈焕菲^［37］的研究也表明普鲁兰多糖有较好的持水能力。

4 结论

Box-Behnken响应面法优化复合生物保鲜剂的最佳配方为：0.22%乳酸链球菌素、1.61%普鲁兰多糖和4.14%山梨酸钾。该复合生物保鲜剂可以有效抑制大口黑鲈鱼微冻贮藏过程中微生物的生长，降低TVB-N的增长速率，抑制pH值的变化，延缓肌动球蛋白、巯基和Ca²⁺-ATPase活性的降低，提高鱼肌肉WHC，保持鱼肉的水分含量。复合生物保鲜剂可有效的维持大口黑鲈鱼肉的各项理化指标。

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基金资助

水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心项目(ZF1206)

上海市科委工程中心建设项目(11DZ2280300)