基于感官组学的烤烟烟叶中糯米香特征成分的鉴定

Identification of clutinous rice-like aroma components featured in flue-cured tobacco leaves based on sensomics approaches LI Shuchang^1，2，HUANG Jian³，PANG Su⁴，LI Jun⁵，LIU Guanshan¹，PANG Xueli¹，KONG Fanyu¹

摘要

目的 准确鉴定烤烟烟叶中糯米香关键特征成分。 方法 以典型糯米香香韵特征烤烟烟叶为研究对象，利用现代分子感官科学技术，借助气相色谱嗅觉检测/稀释嗅闻技术（GC-O/AEDA）以及多维气相色谱-高分辨质谱联用技术（GC×GC-QTOF/MS），对其糯米香关键特征成分进行了筛选和精确鉴定。 结果 利用该技术方法，从糯米香特征烤烟样品中筛选定位到一种具有气味强度高、检测频率高、稀释因子高的糯米香特征成分，结合双色谱柱保留指数、气味属性、一维和二维保留时间（¹D Rt和²D Rt）、高分辨质谱信息，成功将该糯米香特征成分鉴定为2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP），并通过香味物质添加实验对2AP的糯米香香韵贡献进行了验证。 结论 明确了烤烟烟叶中糯米香特征贡献组分为2AP，该物质在空气中阈值低至0.02 ×10^-9，是典型的痕量高效香气化合物。研究结果为进一步开展糯米香烤烟精准评价和基于分子育种的烟叶糯米香特征的调控改良提供了物质基础。

Abstract

Objective The objective of this study was to accurately identify the key characteristic components responsible for the glutinous rice-like aroma in flue-cured tobacco. Method Flue-cured tobacco leaves exhibiting the glutinous rice-like aroma were screened and accurately identified using modern molecular sensory science and technology.Gas chromatography olfactory detection/aroma extract dilution analysis (GC-O/AEDA) and multi-dimensional gas chromatography-high resolution mass spectrometry (GC×GC-QTOF/MS) were utilized for accurate identification. Result A trace potent odorant with a distinct glutinous rice-like aroma，exhibiting high odor intensity，detection frequency，and dilution factor，was successfully located and screened from the flue-cured tobacco samples displaying the glutinous rice-like aroma.Through comparison of retention index on two different columns，odor properties，one-dimensional and two-dimensional retention times (1DRt and 2DRt)，and high-resolution mass spectrometry information with an authentic standard，the unknown compound with a strong glutinous rice-like odor was unequivocally identified as 2-acetyl-1-pyrroline (2AP).An aroma components addition experiment was conducted to confirm the flavor contribution of 2AP. Conclusion 2AP was identified as the key odorant responsible for the glutinous rice-like aroma characteristic in flue-cured tobacco leaves.With an odor threshold as low as 0.02×10^-9 in air，2AP was considered a typical trace but highly potent aroma-active compound.These findings provided a foundation for the accurate evaluation of flue-cured tobacco with glutinous rice-like aroma characteristics and for the regulation and enhancement of glutinous rice-like aroma in tobacco leaves through molecular breeding.

Graphical abstract

关键词

感官组学 / 糯米香香韵 / 痕量关键香气 / 气相色谱嗅觉检测技术（GC-O） / 全二维气相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱技术（GC×GC-QTOF/MS）

Key words

sensomics / glutinous rice-like aroma / trace potent odorant / gas chromatography-olfactometry/aroma extract dilution analysis （GC-O/AEDA） / comprehensive two-dimensional gas chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （GC×GC-QTOF/MS）

Author summay

李舒畅，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

——（1.Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Qingdao 266101，China；2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；3.China Tobacco Jiangxi Industrial Co.，Ltd.，Nanchang 330096，China；4.Sichuan Tobacco Quality Supervision and Testing Station，Chengdu 610041，China；

5 China Tobacco Shandong Industry Co.，Ltd.，Ji'nan 250014，China）

烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种重要的吸食性叶用经济作物，其香气质量是衡量烟叶品质和可用性的重要因素^［1-2］。卷烟燃吸过程中烟叶原有挥发性香气成分的物理挥发迁移和烟叶中非挥发性前体物质的热化学转化是塑造主流烟气风格类型和香韵特色的重要途径^［3］。相比非挥发物的热化学转化，烟叶所具有的天然香味物质对烟气香型风格类型塑造的作用更可知可控，更直接有效。因此，烟叶众多挥发物中关键香气物质构成的剖析研究对于指导烟草产品风格修饰具有重要的理论指导和数据支撑作用。现有有关烟叶香气的相关研究多为基于GC-MS分析的烟叶中挥发物质定性定量分析^［4］，对复杂基质中痕量但具有极低阈值的关键香气组分的挖掘能力有限^［5］。此外，现有烟叶特征香韵中关键香气成分的研究多基于一维色谱-低分辨质谱分析手段开展，其分离能力和结构鉴定的灵敏度和精确度有限，常常存在“组分共流出”以及“痕量组分无信号响应”的问题^［6］。因此，为进一步准确指导烟叶风味质量评价和香韵特色调控研究，亟须综合利用气味筛选技术和高分离能力、高灵敏度的现代仪器分析手段对烟叶关键香气成分进行深入剖析与挖掘。现代分子感官科学技术（感官组学）是从众多挥发性组分中筛选关键香气贡献化合物的一大利器。该方法体系结合了感官分析和仪器分析的优点，以人的鼻子作为灵敏检测器，在色谱分离的基础上筛选真正具有气味贡献的化合物，具有很好的揭示与感官特性相关的隐藏信息的能力，在食品风味特征成分解析分析研究中得到了广泛的应用^［7-9］。目前，感官组学技术已应用于卷烟主流烟气中烟熏香、酸香、辛香、焦甜味、奶香和豆香贡献成分、烟叶清香特征成分、烟叶提取物特征香气组分的解析研究中^［10-11］。近年来，烤烟中一种名为糯米香的独特香韵越来越受到关注，该香韵特征被描述为浓烈的糯米香味，且在煮熟的香稻、面包花及斑斓叶片最为典型^［12］。已有研究指出，构成香稻、面包花和斑斓叶片典型糯米香韵的关键特征成分为2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）^［13］。然而，具有糯米香味特征的香气物质并不单一，除报道最多的2AP外，还有2-乙酰基噻唑、2-乙酰基吡嗪、2-丙酰基噻唑、2-丙酰基-2-噻唑啉、5-乙酰基-2，3-二氢-1，4-噻唑啉、2-乙酰基-2-噻唑啉、3-乙酰基吡啶等^［14］。但目前尚无研究清楚地指出烤烟“糯米香”特征的关键物质基础。本研究以经过专业卷烟感官质量评吸委员会鉴定过的具有典型糯米香韵特征的烤烟为研究试材，以寻找烟叶糯米香特征的化学标志物为研究目标，基于GC-O气味筛选技术结合具有更高分离度、灵敏度和精确度的多维气相色谱-高分辨质谱技术，对烟叶中糯米香特征的关键香气组分进行筛选鉴定，并通过香味物质添加实验对其风味作用特征进行验证，最终精准剖析糯米香关键香气物质基础，研究对于进一步开展烤烟糯米香特征风味精确评价方法创新开发以及烟草风味品质分子育种均能提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验选用的烤烟样品为云南、江西地区中部烤后烟叶，样品等级为中部橘黄1级（C1F），且被专业卷烟感官质量评吸委员会鉴定为具有典型糯米香特征。

无水乙醇（色谱纯），二氯甲烷（色谱纯），购自美国AVANTOR公司；2-乙酰基-1-吡咯啉标准品（98%，加拿大TRC公司）；C₆~C₂₈正构烷烃标准品（99%）（美国Sigma-Aldrich公司），β-环柠檬醛标准品（99%，美国AccuStandard公司）；乙酸芳樟酯标准品（96%，上海麦克林生化科技有限公司），其它香气标准品若无特别说明均购自北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XH-D涡旋混合仪（美国Voetex Mixer公司）；固相微萃取手动套装（贞正分析仪器有限公司）；Sniffer 9000嗅味检测仪（瑞士Brechbühler公司）；7890B-7200气相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪（美国Agilent公司）；7890B-5977A气质联用仪（美国Agilent公司）；二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）固相微萃取头（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 挥发物质的HS-SPME提取

参照Wakte等^［15］方法并稍作修改，烟叶样品去除主脉、切丝后，于30 ℃下干燥后研磨过筛（40 目）。准确称取0.5 g烟末，在80 ℃下平衡30 min后萃取30 min，在250 ℃下解吸10 min，进行GC-MS检测。

1.3.2 基于气相色谱-嗅觉检测/稀释嗅闻技术（GC-O/AEDA）的烟叶中关键香气物质筛选

参照Feng等^［16］，气相色谱条件为：进样口温度：240 ℃，DB-5和DB-WAX色谱柱的柱升温程序分别为：40 ℃ （2 min） 6 ℃/min-280 ℃ （10 min）和40 ℃ （2 min）-6 ℃/min-240 ℃ （10 min），DB-5和DB-WAX色谱柱到嗅闻口传输线温度分别设为280 ℃和240 ℃。参照Cuevas-Glory等^［17］方法，采用嗅闻实验中经典的频率检测法（detection frequency analysis，DFA）对烤烟烟叶样品中的香气贡献组分进行筛选，DFA由 2 名经验丰富的嗅闻人员完成，每个嗅闻人员重复嗅闻样品4次，记录气味物质出现的时间（Rt）、气味强度（I）和气味属性（O）。将某一组分在同一时间被2名嗅闻人员检测到的总次数定义为该组分的检测频率（detection frequency，DF）。气味强度（I）依据七点强度法进行打分（无-0，弱-1，弱/中等-2，中等-3，中等/强-4，强-5，极强-6）。当且仅当在同一时间被两名同时检测到的组分被认定为烟叶中的香气贡献组分。随后，通过梯度改变进样口分流比的方式，对挥发物混合物进行稀释嗅闻分析，将其中某一气味组分能被嗅闻到所需最大稀释倍数定义为该气味组分的稀释因子（flavor dilution，FD）。

1.3.3 GC-MS条件

色谱条件设置同GC-O，质谱参数为：EI源，轰击能量：70 eV，全扫描，扫描质量范围：33~325 amu，DB-5 和DB-WAX色谱柱的气质接口温度分别为280 ℃和240 ℃，离子源温度：230℃，四级杆温度150 ℃。

1.3.4 GC*GC-QTOF/MS条件

色谱条件设置：正向色谱柱系统：¹D-DB5（30 m×250 μm×0.25 μm），²D-DB-17H （2.5 m×100 μm×0.1 μm），进样口温度250 ℃，柱流速1.0 mL/min，柱升温程序：60 ℃ （2 min）-6 ℃/min-270 ℃ （10 min） ；热喷口（辅助加热区1）升温程序：250 ℃-10 ℃/min-380 ℃，气质传输线（辅助加热区2）温度：270 ℃；N₂碰撞气流量1.5 mL/min；冷喷流量15 L/min；调制周期5 s，热喷时间，350 ms。质谱参数：扫描模式：MS，扫描质量范围：33~325 amu，离子源温度280 ℃，轰击能量：70 eV；发射电流：35 μA。

1.3.5 定性方法

对于有GC-MS信号响应的气味贡献组分，通过保留指数（LRIs）、气味属性、质谱信息进行准确定性；对于无GC-MS信号响应的痕量气味组分，通过比对两根色谱柱上保留指数（LRIs）和气味属性（O）信息进行初步定性，根据初步定性结果购买标准品，基于全二维气相色谱-飞行时间四级杆串联质谱（GC×GC-QTOF/MS）分析中的一维（¹D Rt）和二维出峰时间（²D Rt）以及高分辨质谱图信息进行精确定性。

1.3.6 香味物质添加试验

参照YCT 138-1998^［18］制备卷烟样品，分别添加10 μL不同浓度的2AP乙醇溶液到 4 组样品烟支作为试验组样品（10 支/组），以注入相同量无水乙醇的标准烟支作为空白对照样品。由 10 名长期从事卷烟感官评吸的专家评委采取 9 分制四个等级（强，7~9；中等，4~6；弱，1~3；无，0）对卷烟样品的糯米香气味强度进行量化评价。

2 结果与分析

2.1 基于GC-O-MS分析的烤烟烟叶香气贡献组分构成

基于GC-O筛选和GC-MS定性，最终从烤烟样品中共检出 69 个香气贡献组分（表 1），其中 63 个组分根据保留指数、气味属性、质谱信息被准确定性，6 个组分因在GC-MS中没有仪器信号，仅依据气味信息和保留指数信息得以初步定性。这些香气物质化学种类构成丰富，包括脂肪醇、脂肪醛、脂肪酯、脂肪酮、脂肪酸、芳香族化合物、含氮含氧杂环化合物（呋喃酮、糠醛、吡咯等）、含硫化合物、萜烯类化合物及其氧化物、内酯类化合物等共 10 大类，呈现出果甜味、焦甜味、坚果香、金属味、脂肪味、木香、花香、烟草香、烘焙香、酸香、柑橘香、奶甜味等香气特征。综合考虑气味强度（I）≥2.5，检测频率（DF）≥6，稀释因子（FD）≥27，共筛选出 29 种关键香气化合物，包括苯乙醛、芳樟醇、麦芽酚、苯乙醇、二氢猕猴桃内酯、5-甲基-2-呋喃甲醇、糠醛、糠醇、4，8-二甲基-3，8-壬二烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、5-甲基-2-糠醛、2，3-二氢-3，5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、顺式-8-羟基芳樟醇、1-戊烯-3-酮、反式-β-紫罗酮、（E，E）-2，4-庚二烯醛、茄酮、壬醛、巨豆三烯酮、大马士酮、β-5，6-环氧-紫罗酮、巨豆三烯酮-2、螺岩兰草酮、异瑟模环烯醇、茶香酮和4种未知关键香气化合物，分别为未知物 1（强烈糯米香味） 、未知物 2（陈旧、樟脑味）、未知物 3（新鲜蘑菇味）和未知物 4（金属味）。

在所有检出的香气组分中，未知物 1（强烈糯米香味）呈现最高的稀释因子（FD=241）、最高的检测频率（DF=8）和最高的气味强度（I=6），因此被认为是受试烤烟样品中极为重要的关键香气化合物。虽然未知物 1在DB-5和DB-WAX色谱柱上均被两名嗅闻人员检测到，但在两根色谱柱的GC-MS总离子流图（TIC）中该物质的理论出峰时间（DB-5：13.90 min和DB-WAX：17.41 min）处均未检测到任何信号响应（图1-A~B），因此该糯米香味组分被定义为烤烟中的痕量高效香气化合物。

依据正构烷烃及目标糯米香气味组分在不同色谱柱上总离子流图的出峰时间（图 2），计算出目标化合物保留指数（LRI-DB-5=923和LRI-DB-WAX=1 331），通过检索保留指数和气味属性数据库，初步推断该痕量高效糯米香特征未知物为2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP），但样品中是否真的存在2AP，非常有必要采用更高灵敏度的分析手段进一步确证。

2.2 基于GC×GC-QTOF/MS对痕量高效糯米香特征未知香气化合物进行结构精确定性

基于LRIs和气味属性的初步定性结果，购入2AP标准品（CAS：85213-22-5），将标准品进行GC×GC-QTOF/MS分析，通过谱库检索、理论特征离子精确质量数提取等方式获取了2AP标准品的一维和二维保留时间（¹D Rt和²D Rt）以及高分辨质谱图（图 3），标准质谱库检索结果显示，2AP标准品高分辨质谱图与标准谱库中的2AP标准质谱图匹配度较高（正向及反向匹配度均高于85%）。在此基础上，对其碎片离子的分子式进行了推断，并发现本试验条件下获取的2AP实际碎片离子质量数和其理论值的吻合度较高（质量偏差均<10×10^-6，表2），由此可见，在本实验室分析条件下获取的2AP高分辨质谱图具有非常高的准确度。

然而，在样品GC×GC-QTOF/MS的总离子流图（TIC）的2AP理论出峰时间处（11.693 min，1.409 s），并未观察到明显的目标物信号响应（图4-A）。因此，进一步尝试提取2AP的特征离子精确质量数（83.073 0和111.067 9），最后在高分辨提取离子色谱图（HRSIC）中2AP的理论出峰时间处成功定位到了83和111这两个主要目标特征离子（图4-B~D）。且2个特征离子的丰度比（m/z：83.073 0至m/z：111.067 9）在样品中和在2AP标准品中分别为8.7 和8.94（相对偏差<3%）（图5）。同时，在HRSIC中2AP理论出峰时间处，除83和111外的其他特征离子如43，68，82的精确质量数及相对丰度均与标准品对应数据接近（表 2）。因此，基于高分辨特征离子的一维及二维出峰时间、特征离子质量数精确度、不同特征离子的丰度比（ratio 83 to 111=8.7）均与标准品（ratio 83 to 111=8.94） 吻合度非常高等证据，确证本研究受试烤烟样品中典型糯米香味的痕量关键组分为2AP。

2.3 技术流程

图6归纳总结了本研究在筛选并鉴定烤烟样品中痕量/超痕量关键香气所形成的一套技术方法流程，该流程同样可以借鉴到其它天然食品及芳香植物等复杂基质中高效痕量未知香气和挥发性异味物质的鉴定。

2.4 香味物质添加试验结合感官评吸验证2AP的糯米香香气作用贡献

添加不同浓度2AP的卷烟糯米香感官评吸结果以10位评吸人员赋值的\overline{x}±s标准差表示（表3）。由表 3 可知，相同浓度下，感官评吸小组内糯米香气味强度赋分值的相对标准偏差（RSD）均低于25%，表明数据的离散程度相对较小，即10位评吸专家对不同2AP添加量卷烟中糯米香气味强度的感知基本一致，评吸结果可信度较高。不同2AP添加水平的卷烟样品之间的“糯米香”气味强度具有显著差异。具体来看，0.01 μg/g的2AP添加量即可塑造糯米香味；当卷烟中2AP添加浓度为0.04 μg/g时，就可以赋予卷烟中等强度的糯米香韵；当卷烟中2AP的添加浓度为0.08 μg/g时，评吸人员就可以感知到极强的糯米香气。

3 讨论

3.1 基于GC-O-MS的烟叶中关键香气组分鉴定

对于本试验筛选鉴定出的烟叶中25种已知关键香气化合物，尽管部分组分在前人烟叶相关研究中有报道^［19］，但这些组分的鉴定都是基于常规GC-MS的一般定性，缺少检出组分的气味信息，本研究采用了以嗅觉响应为指导的GC-O-MS技术对烟叶中关键香气组分进行筛选和鉴定，并首次将2，3-二氢-3，5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、β-5，6-环氧-紫罗兰酮、顺式-8-羟基芳樟醇、异瑟模环烯醇、4，8-二甲基-3，8-壬二烯-2-酮鉴定为烟叶中关键香气组分。值得注意的是，4，8-二甲基-3，8-壬二烯-2-酮系首次在烟叶中检出。

按照香气物质的检测频率（DF）、稀释因子（FD）以及气味强度（I）的值，将同时满足DF≥8、FD≥81、I≥3的香气物质定义为强香气化合物，包括糠醛、糠醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛、茄酮、苯乙醛、芳樟醇、壬醛、麦芽酚、苯乙醇、4，8-二甲基-3，8-壬二烯-2-酮和巨豆三烯酮-2。其中糠醛、糠醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛、苯乙醛、芳樟醇、壬醛、苯乙醇在空气中阈值分别为0.25、0.25、0.057、0.000 72、0.001 3、0.002、0.012~0.021 mg/m^3［20］，多处于ppb级，低于现有烤烟致香物质清单中的大部分化合物含量^［21］，属于高效香气组分。此外，从现有报道中涉及上述强香气化合物的定量分析数据来看，这些强香气化合物的含量并非总是高于其他挥发性成分。例如芳樟醇在烤后烟叶中的含量仅为0.193 mg/kg，是公认的烤烟香气成分巨豆三烯酮的1/72^［22］；糠醇和苯乙醛在津巴布韦烟叶中的含量分别为1.61 mg/kg和1.94 mg/kg，仅为茄酮的1/21和1/18^［23］；壬醛在成熟期鲜烟叶中的含量仅为2.96 mg/kg，仅占烟叶中所有致香成分的1.7%^［24］。因此，香气化合物的浓度并不等同于该物质的香气贡献，把香气化合物含量的高低作为评判其是否为致香物质的做法缺乏科学性和严谨性，在对痕量香气化合物进行筛选分析时不应局限于“以量定效”的原则。

对于“香气化合物在GC-O能检测到但无法获取其MS信号响应”这一现象并不鲜见，在国内外已发表的风味分析相关论文中也有多有报道，这也是风味分析化学的研究难点之一。Jiang等^［25］和Yang等^［26］采用GC-O结合AEDA分别对云南火腿和沙琪玛中的香气化合物进行分析鉴定时，都发现了无MS信号但对整体香气起到关键作用的痕量高效未知香气化合物。由此可见，在特征香气的鉴定研究中能够提高物质感官响应GC-O技术，可以弥补因质谱灵敏度不足而影响关键香气物质鉴定结果全面性的缺点，能为准确的揭示香气特征的化学本质全貌。

3.2 基于GC×GC-QTOF/MS对痕量高效未知香气化合物1进行精确定性

相比一维系统，全二维气相色谱（GC×GC）提供了一种真正的正交分离系统，解决了传统一维气相色谱在分离复杂样品时峰容量严重不足的问题，同时GC×GC具备浓缩功能，可以降低化合物的检出限^［27］。此外，QTOF/MS能够提供目标化合物的高分辨率、精确质量数质谱信息，GC×GC和QTOF/MS的结合能够通过提取窄的质量窗口来提高信噪比和排除基质干扰，在目标分析物的定性和定量上具有其他分析手段不可比拟的优势，已用于多种复杂食品基质中痕量香气化合物的鉴定^［28-30］。

2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）是一种天然香气物质，最早在香米中检出^［31］。除香米、面包花、露兜树叶等天然植物中能够检出2AP外，在面包、玉米饼、爆米花、年糕等植物来源的热加工食品中和鲜奶、奶酪制品、腌火腿、煮鱼片、煮大虾等非植物来源的产品中也有相关报道^［32］。尽管李华雨等^［33］和余航等^［46］在烟叶香气成分相关研究中都曾报道过2AP的检出，然而这些研究并未明确2AP的香气贡献，且前人研究中都采用了同时蒸馏萃取法（SDE）对样品烟叶中的挥发性成分进行提取。由于SDE法涉及持续高温参与，而2AP极易在高温下经氨基酸和还原糖的美拉德反应生成^［34］，因此，基于SDE对烟叶中2AP的相关结论缺乏严谨性，难以证明检出的2AP是烟叶固有香气组分而非样品受高温长时间蒸煮产生的热反应物。本研究采用顶空-固相微萃取技术（HS-SPME）对烟叶中挥发性物质进行提取，不仅能够避免“热假组分”的干扰，同时结合复杂基质中痕量关键香气筛选鉴定的GC-O技术和具有高分离度、高灵敏度的多维色谱-高分辨质谱联用技术（GC×GC-QTOF/MS），能够有效克服复杂基质中高含量挥发物本底的干扰，实现了众多无香气贡献烟叶挥发物中烟叶固有2AP的精确筛选鉴定。

3.3 基于香味物质添加试验对鉴定结果进行验证

烟草基质构成极其复杂，构建香气重组模型难度较高，难以通过香气重组和省略试验对糯米香味贡献进行确证。香味物质添加试验仅需将鉴定出的关键香气化合物标准品以一定浓度溶液形式添加进样品基质中，通过评价该物质对整体香气的影响即可实现对鉴定结果的验证^［35］。在本试验的2AP添加浓度范围内，相比对照组样品，所有2AP返添加试验组样品均产生了足以被实验员感知到的糯米香味特征，且气味强度随着2AP的浓度增大而逐渐升高，由此证明了烟叶中2AP对烤烟烟气糯米香特征形成的直接贡献作用。至于卷烟糯米香香韵形成所需的最低2AP添加浓度，因不同烟叶基质组分构成各异，后续还需围绕不同香型及不同产地烟叶做进一步系统研究。

4 结论

本研究以糯米香特征烤烟为研究对象，以鉴定糯米香特征成分为研究目标，以感官组学为方法指导，利用GC-O/AEDA定位到了糯米香特征成分，在¹D-GC-MS无目标物信号响应的情况下，借助GC×GC-QTOF/MS技术，依据一维和二维出峰时间、特征离子精确质量数、特征离子丰度比等信息，成功将烤烟烟叶中具有糯米香味的痕量高效特征成分准确鉴定为2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP），最终建立了一种可用于筛选并鉴定复杂天然样品基质中痕量/超痕量关键未知香气化合物的方法流程，具体操作流程如图6所示。进一步，通过香味物质添加试验验证了2AP对烤烟糯米香香韵形成的直接贡献作用。研究对于进一步开展烤烟糯米香特征风味精确评价方法创新开发以及基于分子育种技术的糯米香特征调控研究提供了基础。目前尚未见烟草中2AP来源的相关报道，为进一步指导烤烟中糯米香特征的精准调控，今后可重点围绕烤烟及卷烟样品中2AP定量方法开发，烟叶、烟气（粒相物及气相物）样品中2AP的含量分布特征，不同2AP添加量对卷烟抽吸感官品质的影响，烟气中2AP转化来源途径以及烘烤及醇化过程中糯米香风味特征稳定性变化等内容开展系统深入研究。

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基金资助

中国农业科学院科技创新工程项目(ASTIP-TRIC07)

江西中烟工业有限责任公司科技项目(赣烟工科2021-11)

中国烟草总公司山东省公司科技项目“山东蜜甜焦香烟叶风格糖类物质基础解析”(201911)

中国烟草总公司贵州省公司科技项目“基于多组学联用的高香气烤烟化学表征和评价方法研究”(2021520000240044)