连翘叶乙醇提取物对APAP诱导肝损伤小鼠氧化应激及炎症因子的影响

Effects of FSLE on oxidative stress and inflammatory factors in APAP-induced liver injury mice

摘要

目的 研究连翘叶乙醇提取物（ethanolic extract of Forsythia suspense leaves，FSLE）对对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）诱导的肝损伤作用及其机制。 方法 随机将48只昆明小鼠分为空白对照组（NC组）、APAP肝损伤模型组（LD组）、连翘叶乙醇提取物高剂量对照组、高、中、低剂量组（FSLE组、HFSLE+LD组、MFSLE+LD组、LFSLE+LD组），每组8只。建立肝损伤模型并给药，检测各组小鼠谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）活性与谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量，苏木精伊红（HE）染色观察肝组织病理情况，检测TRAF2、NF-κB p65 mRNA、蛋白的表达水平和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）的水平。 结果 FSLE可降低肝损伤小鼠ALT、AST活性和MDA、H₂O₂含量（P<0.05），提高SOD活性和GSH含量（P<0.05），改善肝组织病理情况，降低TRAF2和NF-κB p65 mRNA、蛋白表达量和TNF-α、IL-1β、IL-6的水平（P<0.05）。 结论 FSLE通过改善氧化应激、调节TNF/NF-κB p65信号通路和抑制炎症反应发挥抗APAP肝损伤的作用。

Abstract

Objective This study aimed to investigate the impact of the ethanolic extract of Forsythia leaves （FSLE） on acetaminophen （APAP）-induced liver injury and its underlying mechanism. Method Forty-eight Kunming mice were randomly assigned to six groups： the blank control group （NC），APAP liver injury model group （LD），FSLE control group （FSLE），and high，medium，and low doses of FSLE treatment groups （HFSLE+LD，MFSLE+LD，and LFSLE+LD），with eight mice in each group.The liver injury model was established，and drug administration took place.The levels of alanine aminotransferase （ALT），aspartate aminotransferase （AST），superoxide dismutase （SOD） activity，glutathione （GSH），malondialdehyde （MDA），and hydrogen peroxide （H₂O₂） were assessed in each group of mice.Liver histopathological changes were observed through hematoxylin-eosin staining （HE）.TRAF2，NF-κB p65 mRNA，and protein expression levels were measured，along with TNF-α，IL-1β，and IL-6 levels. Result FSLE reduced ALT and AST activity，MDA，and H₂O₂ content，while increasing SOD activity and GSH content.It also ameliorated liver histopathology，decreased TRAF2 and NF-κB p65 mRNA and protein expression，and lowered TNF-α，IL-1β，and IL-6 levels in mice with liver injury. Conclusion In conclusion，FSLE demonstrated hepatoprotective effects against APAP-induced liver injury by mitigating oxidative stress，modulating the TNF/NF-κB p65 signaling pathway，and suppressing the inflammatory response.

Graphical abstract

关键词

连翘叶乙醇提取物 / 肝损伤 / 小鼠 / 氧化应激 / 炎症因子

Key words

ethanolic extract of Forsythia suspense leaves / liver injury / mice / oxidative stress / inflammatory factors

Author summay

王中一，硕士研究生。E-mail： [e-mail]

肝脏是动物体内重要的解毒器官，药物转运与代谢的主要场所，易受到刺激产生损伤^［1］。对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP），也称扑热息痛，是一种广泛使用的非甾体类抗炎止痛药，常用于缓解疼痛和发烧^［2］，在治疗剂量下通常被认为是安全的，但过量或长期的使用APAP会导致肝损伤^［3］，是国内外引起急性肝损伤和急性肝衰竭的常见药物之一^［4］。过量的APAP经肝脏代谢产生N-乙酰-对苯醌亚胺（N-acetyl-p-benzoquinoneimine，NAPQI）毒性物质，会耗竭机体内谷胱甘肽（glutathione，GSH）^［5］，过量的NAPQI会与肝细胞蛋白共价结合，引起氧化应激等系列反应^［6］。APAP肝毒性还会导致肝细胞内容物释放，引发无菌性炎症^［7］。此外，APAP引起肝损伤的机制还包括线粒体功能异常、自噬、细胞凋亡等，发病机制复杂^［8-9］，且目前针对其治疗的药物较少^［10］，因此寻找安全且有效治疗APAP诱导肝损伤的药物十分重要。

连翘［Forsythia suspensa （Thunb.） Vahl］是木犀科连翘属植物，通常以果实入药，具有清热解毒等功效，是中药临床传统药物之一^［11］。连翘叶作为连翘的叶片，也具有一定的药用价值，《中华本草》中记载“连翘茎叶，性寒，主治心肺积热”^［12］。现有研究表明，连翘叶与连翘果实的有效成分具有较好的一致性^［13］，且临床应用较为安全^［14］。连翘叶具有多种药理活性，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抑菌和保肝等功能^［15-16］。安志霞等^［17］研究发现，连翘叶乙醇提取物（Forsythia suspense leaves extract，FSLE）可通过抑制氧化应激反应缓解恩诺沙星诱导的肝损伤。王玲芝等^［18］研究发现，连翘叶乙醇提取物可有效缓解热应激所造成的机体损伤。

本试验探究给予不同浓度的连翘叶乙醇提取物，评估其对APAP诱导药物性肝损伤的治疗效果，探究连翘叶乙醇提取物抗APAP肝损伤的作用机制，为治疗APAP诱导肝损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

连翘叶采摘于甘肃省天水市秦岭镇，通风条件下自然晾干后储存于阴凉干燥处。对乙酰氨基酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；谷丙转氨酶（ALT）测定试剂盒、谷草转氨酶（AST）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、过氧化氢（H₂O₂）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；5×蛋白上样缓冲液、BCA蛋白试剂盒、超敏ECL化学发光液、RIPA裂解液和PBS磷酸盐缓冲液干粉（北京索莱宝生物技术有限公司）；NF-κB p65和TRAF2兔源多克隆抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司）；GAPDH抗体和羊抗兔IgG（北京博奥森生物技术有限公司）；白介素1β（IL-1β）、白介素IL6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（武汉默沙克生物科技有限公司）。

1.1.2 主要仪器

CT15RE日立卓上微量高速冷冻离心机（株式会社日立制作所）；HistoCore MULTICUT轮转式切片机（莱卡公司）；AmershamImager 600全自动化学发光成像系统（美国GE公司）；LightCycler96荧光定量PCR仪（瑞士罗氏集团）；TRE2000A旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；Alpha1-2冷冻干燥机（CHRIST公司）；SpectraMax i3x 多功能酶标测定仪（美国Molecular Devices公司）；蛋白电泳仪及转模装置（美国Bio-Rad公司）。

1.1.3 试验动物

本研究选取48只昆明小鼠，6~8周龄，体质量（25±3） g，雌雄各半，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，于甘肃农业大学动物医学院实验室饲养，温度22~26 ℃，小鼠自由采食进水。动物试验经甘肃农业大学伦理委员会批准（GAU-LC-2020-33）。

1.2 方法

1.2.1 连翘叶乙醇提取物的制备

称取30 g连翘叶粉末置圆底烧瓶中，加入240 mL 60%乙醇，浸泡20 min后，68 ℃水浴回流1 h，抽滤，收集滤液，将剩余滤渣再次置于圆底烧瓶中，加入相同体积60%乙醇，50 ℃水浴回流2 h，抽滤，收集滤液。将两次所得滤液合并，旋转蒸发仪浓缩后-80 ℃冷冻过夜，冷冻干燥机冻干60 h，收集冻干粉末，记录其质量，冷藏备用。

1.2.2 动物模型与分组

取连翘叶乙醇提取物溶解于生理盐水中，配置成600，400，200 mg/kg的药液，冷藏备用。将48只昆明小鼠随机分为6组，分别为空白对照组（NC组）、APAP肝损伤模型组（LD组）、连翘叶乙醇提取物高剂量对照组（FSLE组，600 mg/kg）、连翘叶乙醇提取物高、中、低剂量组（HFSLE+LD组，600 mg/kg、MFSLE+LD组，400 mg/kg、LFSLE+LD组，200 mg/kg），每组8只。其中NC组和FSLE组灌胃生理盐水，其余各组小鼠均腹腔注射APAP（300 mg/kg），每天2次连续4 d；第5天时，NC组和LD组灌胃生理盐水，FSLE组以600 mg/kg剂量灌胃连翘叶乙醇提取物药液，HFSLE+LD组、MFSLE+LD组、LFSLE+LD组分别按600、400、200 mg/kg的剂量灌胃连翘叶乙醇提取物药液，每天2次连续3 d。

1.2.3 样品采集

末次灌胃12 h后，眼球静脉丛采血，颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取出小鼠肝脏，用冷生理盐水清洗肝脏组织，各组取同一部位肝组织固定于4%多聚甲醛中，剩余组织-80 ℃保存备用。血液样本室温下静置30 min，4 ℃、3 000 r/min条件下离心10 min，收集血清，4 ℃冷藏备用。

1.2.4 血清ALT、AST活性测定

取分离后的血清作为待测样本，采用微板法，按照ALT、AST测定试剂盒说明书操作，测定小鼠血清中ALT、AST活性。

1.2.5 肝脏组织病理学观察

取固定好的小鼠肝脏组织，各组在相同位置切块，进行酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精伊红染色（HE），用中性树胶将切片标本封固，在光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。

1.2.6 氧化应激指标检测

准确称取肝脏组织1 g，加入9倍体积生理盐水，冰浴条件下制备10%的肝组织匀浆，4 ℃、2 500 r/min离心15 min，收集上清液。严格按照测定试剂盒说明书操作要求，测定SOD活性以及GSH、H₂O₂和MDA含量。

1.2.7 RT-qRCR检测小鼠肝脏中NF-κB p65、TRAF2 mRNA表达水平

准确称取肝脏组织50 mg，按照Trizol RNA提取试剂盒说明书操作提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，GAPDH为内参采用实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏NF⁃κB p65、TRAF2基因表达水平。所用引物序列见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系为20 μL：cDNA 1 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH₂O 8.2 μL、2×ChanQ SYBR qRCR Master Mix 10 μL。反应程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，按表1相应温度退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。

1.2.8 Western blot检测小鼠肝脏中NF-κB p65、TRAF2蛋白表达水平

称取小鼠肝脏组织50 mg，加入RIPA裂解液充分裂解30 min后，12 000 g离心4 min，取上清液，加入1/4体积5×蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴变性10 min。采用BCA法测定蛋白浓度，用10% SDS-PAGE进行电泳，湿转法将蛋白质转移到PVDF膜上，脱脂牛奶封闭2.5 h，加入一抗（稀释比例：TRAF2：1∶1 000；NF-κB p65：1∶1 000；GAPDH：1∶4 000）于4 ℃孵育过夜，洗膜3次，加入二抗（稀释比例：羊抗兔1∶5 000）室温孵育2 h，洗膜3次，ECL显像成影，采用Image J软件分析各条带灰度值。

1.2.9 ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6的水平

准确称取肝脏组织50 mg，加入9倍体积PBS缓冲液，在冰浴条件下制成10%肝匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心20 min，收集上清液，采用双抗体夹心法，严格按照酶联免疫分析试剂盒说明书操作要求，测定TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.3 数据分析

采用SPSS软件对数据进行分析，单因素方差分析（One-way ANOVA）比较各组间差异显著性，结果以\overline{x}±s表示，P<0.05表明差异具有统计学意义，采用Graphpad Prism 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 连翘叶乙醇提取物对小鼠血清ALT、AST活性的影响

由图1可知，与NC组相比，LD组小鼠血清中ALT和AST活性均显著提升（P<0.05），提示APAP诱导肝损伤模型构建成功；与LD组相比，HFSLE+LD组和MFSLE+LD组小鼠血清ALT和AST活性均显著降低（P<0.05），LFSLE+LD组小鼠血清ALT活性显著降低（P<0.05），说明连翘叶乙醇提取物可有效减轻APAP诱导的肝损伤。

2.2 连翘叶乙醇提取物对小鼠肝组织形态的影响

由图2可知，NC组与FLSE组小鼠肝小叶清晰，肝细胞排列规则，无明显炎性细胞浸润；LD组小鼠肝细胞结构模糊，肝细胞排列紊乱，出现大量炎性细胞浸润、大面积肝细胞变性坏死情况；HFSLE+LD、MFSLE+LD、LFSLE+LD组小鼠肝细胞均有不同程度的改善，表现为坏死面积减少。该结果表明连翘叶乙醇提取物可有效改善APAP诱导肝损伤的病理情况。

2.3 连翘叶乙醇提取物对小鼠肝组织氧化应激水平的影响

由图3可知，与NC组相比，LD组小鼠肝脏SOD活性和GSH含量均显著降低（P<0.05），FSLE组无显著差异（P>0.05）。与LD组相比，HFSLE+LD组、MFSLE+LD组小鼠肝脏SOD活性和GSH含量均显著提高（P<0.05），LFSLE+LD组小鼠肝脏SOD活性显著提高（P<0.05）。与NC作用相比，LD组小鼠肝脏MDA含量和H₂O₂含量显著升高（P<0.05），FSLE组无显著差异（P>0.05）。与LD组相比，HFSLE+LD组、MFSLE+LD组和LFSLE+LD组小鼠肝脏MDA含量和H₂O₂含量均显著降低（P<0.05），说明连翘叶乙醇提取物可以提高肝脏组织的抗氧化能力，减缓氧化应激反应。

2.4 连翘叶乙醇提取物对小鼠肝组织TRAF2和NF-κB p65 mRNA表达的影响

由图4可知，与NC组相比，LD组小鼠肝组织TRAF2、NF-κB p65基因表达水平显著升高（P<0.05）；与LD组相比，HFSLE+LD组、MFSLE+LD组和LFSLE+LD组小鼠肝组织TRAF2、NF-κB p65基因表达水平显著降低（P<0.05）。

2.5 连翘叶乙醇提取物对小鼠肝组织TRAF2和NF-κB p65蛋白表达的影响

由图5可知，与NC组相比，LD组小鼠肝组织TRAF2、NF-κB p65蛋白表达水平显著升高（P<0.05），FSLE组无显著差异（P>0.05）；与LD组相比，HFSLE+LD组、MFSLE+LD组和LFSLE+LD组小鼠肝组织TRAF2、NF-κB p65蛋白表达水平显著降低（P<0.05），提示连翘叶乙醇提取物可能通过调节TNF-α/NF-κB信号通路减轻APAP诱导的肝损伤。

2.6 连翘叶乙醇提取物对小鼠肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的影响

由图6可知，与NC组相比，LD组小鼠炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平均显著提高（P<0.05）。与LD组相比，HFSLE+LD组和MFSLE+LD组小鼠炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平均显著降低（P<0.05），LFSLE+LD组小鼠炎症因子IL-6和TNFα的表达水平均显著降低（P<0.05），IL-1β无显著差异（P>0.05）。该结果表明，连翘叶乙醇提取物可有效降低肝损伤小鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα的表达水平。

3 讨论

APAP作为临床上常用的解热镇痛药，其肝毒性问题日益严重，已是许多国家引起药物肝损伤和急性肝衰竭的常见原因^［19］，也是构建动物肝损伤模型的常用药物^［20］。ALT、AST主要存在于肝细胞内，当肝细胞受损时，细胞膜的完整性被破坏，通透性增大，导致大量的ALT和AST从肝细胞释放到血液中，因此血清中ALT、AST活性是评价肝脏受损程度的常用指标^［21］。本研究结果显示，APAP处理后，小鼠血清中ALT、AST活性显著提高，镜下观察显示肝细胞排列紊乱，大量炎性细胞浸润，提示APAP诱导的肝损伤模型构建成功。给予连翘叶乙醇提取物后，肝损伤小鼠血清中ALT、AST的活性显著降低，镜下显示肝细胞核溶解、炎症浸润、坏死程度有所改善，说明连翘叶乙醇提取物可有效改善肝细胞损伤情况，减轻APAP诱导的肝损伤。

治疗剂量下的APAP进入肝脏后，大部分会在葡萄糖醛酸转移酶和磺酸转移酶的作用下转化成无毒化合物经肾脏排出体外，少部分被代谢成毒性产物NAPQI，与还原性GSH结合后消除毒性^［22］，当APAP过量时，过度产生的NAPQI会耗尽肝细胞中还原性GSH，与细胞内蛋白质结合，导致氧化应激等系列反应，造成肝损伤^［23］。SOD是抗氧化系统内源性分子之一，具有清除氧自由基作用，GSH是一种抗氧化酶，能与某些氧自由基结合，两者可反映细胞抗氧化能力^［24］。MDA的产生源于自由基作用于脂质的过程，H2O2是一种经典的促氧化剂，两者可评价机体氧化应激水平^［25-26］。本研究结果显示，给予连翘叶乙醇提取物后，肝损伤小鼠肝脏中MDA含量和H2O2含量显著降低，GSH含量和SOD活性显著提高，表明连翘叶乙醇提取物可缓解APAP诱导的氧化应激反应，提高肝脏的抗氧化能力。侯改霞等^［27］研究显示，连翘叶乙醇提取物可降低MDA含量，提高SOD活性，抑制高脂血症小鼠肝细胞氧化应激程度，这与本试验结果基本一致。

过量的APAP会导致肝细胞损伤，使细胞内容物大量释放，引起炎症反应^［7］。TNF-α是一种免疫调节因子，发生炎症反应时表达增加^［28］。TRAF2作为TRAF家族的经典成员，可调节机体炎症反应重要调节因子NF-κB p65的激活过程^［29-30］。IL-1β和IL-6均有促炎活性^［31］。机体处于病理状态时，TNF-α在TRAF2的调节下激活NF-κB p65，促进炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，而炎性细胞因子又可进一步增强NF-κB p65的活性，加重炎症反应^［32-33］。因此，抑制TNF-α/NF-κB p65信号通路可能在抗肝损中起重要作用。本研究结果显示，不同浓度的连翘叶乙醇提取物均能抑制TRAF2和NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达，降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，表明连翘叶乙醇提取物能够减轻炎症反应，发挥抗肝损作用，其机制可能与调控TNF-α/NF-κB p65信号通路，影响TNF-α、IL-1β和IL-6的表达有关。

4 结论

连翘叶乙醇提取物可能通过改善氧化应激水平，调节TNF-α/NF-κB p65信号通路影响炎症因子水平，抑制炎症反应，进而发挥抗APAP诱导肝损伤的作用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32160850)

甘肃省自然科学基金项目(22JR5RA868)

甘肃农业大学青年导师扶持基金项目(GAU-QDFC-2021-05)