成鼠与幼鼠超排后生殖器官的组织形态学比较

Histomorphological comparison of reproductive organs between adult and prepubertal mice after superovulation

摘要

目的 以小鼠为模式动物，比较幼鼠超排后生殖器官组织形态学变化，为家畜中实施幼畜超排提供理论参考。 方法 选取体重一致的幼龄和成年小鼠各12 只，随机分为对照组和试验组，每组6只。试验组激素超排处理，大体解剖结合组织切片和透射电镜，分析激素处理后幼鼠与成鼠生殖器官的形态学差异。 结果 成鼠超排组黄体数量显著低于幼鼠超排组（P <0.05），然而黄体面积和直径极显著高于幼鼠超排组（P<0.01）。超微结构显示颗粒黄体细胞和膜黄体细胞中均可见丰富脂滴，成鼠超排组的颗粒黄体细胞排列较幼鼠超排组紧密。成鼠超排组子宫腔上皮较成鼠对照组卷曲明显，同时子宫角宽、子宫体宽、子宫角面及直径较成鼠对照组显著降低（P<0.01或P <0.05）；幼鼠超排组的子宫角直径、环肌层厚度及纵肌层厚度均显著高于（P <0.01或P<0.05）幼鼠对照组。 结论 激素处理后幼鼠排卵数目较成鼠多，但成熟卵泡的面积较成鼠小，这可能会影响卵子的质量；成鼠和幼鼠子宫对超排激素的反应性不同。

Abstract

Objective To study the histomorphological changes of the reproductive organs after superovulation in prepubertal mouse models，and to provide a theoretical reference for the implementation of superovulation in domestic animals. Method Twelve prepubertal mice and twelve adult mice of the same body weight were randomly divided into control group and experimental groups，with 6 mice in each group.After hormonal superovulation treatment，gross anatomy，tissue sections and transmission electron microscopy were combined to analyze the morphological differences of the reproductive organs between prepubertal and adult mice. Result The adult superovulated group had a significantly lower number of corpus lutea than the prepubertal superovulated group (P<0.05)，but a significantly higher area and diameter of the corpus luteum than the prepubertal superovulated group (P<0.01).Ultrastructure showed abundant lipid droplets in granular luteal cells and membranous luteal cells，and the granular luteal cells in the adult superovulated group were more closely arranged than those in juvenile superovulated group.Compared with that of the adult control group，the uterine cavity epithelium in the adult superovulated group was significantly rolled up.In addition，the uterine horn width，uterine body width，uterine horn area and uterine horn diameter of the adult superovulated group were significantly lower than those of the adult control group (P<0.01 or P<0.05).Uterine horn diameter，circular muscle layer thickness and longitudinal muscle layer thickness of the prepubertal mice in the superovulated group were significantly higher than those of the prepubertal mice in the control group (P<0.01 or P<0.05). Conclusion Compared to adult mice，prepubertal mice ovulate more frequently，but they produce a smaller area of mature follicles，which may affect the quality of the eggs.The uteri of adult and prepubertal mice respond differently to hormones that induce superovulation.

Graphical abstract

关键词

小鼠 / 超数排卵 / 卵巢 / 子宫

Key words

mouse / superovulation / ovary / uterus

Author summay

李明娜，副教授，博士，研究方向为动物繁殖原理与技术。E-mail：[e-mail]

在家畜饲养过程中，繁殖周期和世代间隔能够限制遗传进展，增长育种年限。幼畜超排技术的应用可以克服这类问题。简单来讲，幼畜超排是将超数排卵技术应用于初情期前的幼畜来获得卵子，以打破常规成年母畜作为供卵主要来源的一项技术。母羊在妊娠期135 d时，胎儿卵巢上便开始出现了有腔卵泡；出生后生殖器官发育迅速，2周左右时生长卵泡最多，至4周有腔卵泡最多，随后开始出现卵泡闭锁的现象^［1］。同样地，出生后几天的犊牛卵巢上已经存在3~5 mm有腔卵泡，2月龄时数量达最多，随后数量有所降低，致青春期保持稳定^［2］。因此利用家畜青春期前卵泡闭锁少、发育快等特征进行超排处理，成为解决胚胎生物技术所需的大量卵子来源问题的新途径。

幼畜超排结合卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养及胚胎移植等技术，形成了目前研究较广的JIVET技术（juvenile in vitro embyro transfer，JIVET）。JIVET技术最早由澳大利亚生殖与发育研究所提出。1977年10~16周龄的威尔士高山母羊通过激素处理成功排卵并受精，胚胎移植至成年母羊成功产仔^［3］。1992 年利用5~6周龄犊牛卵子进行胚胎体外生产试验，胚胎移植后成功产仔^［4］。随后在绵羊^［5］上也展开了类似研究。近年来，我国以布鲁拉美利奴羊为父本，新吉细毛羊为母本，研究JIVET技术应用于多胎细毛羊品种培育的效果评价^［6］。该项技术的应用，不仅可以提高幼畜卵子的利用率，解决胚胎数量不足以及价格昂贵等问题，还可以缩短世代间隔，加速繁育进程，充分发掘良种母畜的遗传潜能。

然而超排反应的个体差异限制了JIVET技术的推广和应用，特别是在商业领域^［5，7］。与成年动物相比，幼畜超排后的有腔卵泡数量增加^［8］，相反卵母细胞质量欠佳^［9］，胚胎发育率低^［10］，这可能与卵巢对促性腺激素的反应性有关。近年来，有大量报道优化幼畜超排和JIVET技术的激素处理方案，然而幼畜卵子和胚胎发育仍然处于较低的水平，特别是处理后卵巢出现不稳定生理状态的机制尚未完全了解。

基于此，本研究以模式动物小鼠为研究对象进行超排试验，对比幼鼠和成鼠激素处理后生殖器官的组织形态学差异，探讨影响幼鼠超排后卵子质量的根本原因，为家畜中实施幼畜超排技术提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

20 只4 周龄和20 只8 周龄成年SPF昆明雌性小鼠，购自兰州兽医研究所（许可证号：SCXK（甘）2020-0002）。小鼠饲养于甘肃农业大学动物场，室温条件，自由饮食进水。3 d无异常表现后用于后续试验。动物试验均符合甘肃农业大学动物科学技术学院动物保护和利用委员会标准。

1.2 主要试剂耗材及仪器

孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）、苏木精、伊红染液、中性树胶等购自索莱宝生物公司；载玻片、盖玻片等购自江苏世泰实验器材有限公司；石蜡购自上海华灵康复器械厂；刀片购自德国莱卡；4%甲醛、无水乙醇、二甲苯、丙酮等购自国药集团化学试剂有限公司；戊二醛、1%四氧化锇等固定液购自成都里来生物科技有限公司；Epon812包埋剂、醋酸铀购自SPI公司；柠檬酸铅购自EMS公司。

主要仪器有莱卡RM2235 轮转式切片机、科迪 KD-TS3A自动脱水机、科迪KD-P 摊片机、科迪KD-H烘片机、P250荧光扫描显微镜（丹吉尔）、莱卡UC7rt超薄切片机、日本电子（JEOL）JEM-1400FLASH透射电子显微镜、上海恒量电子游标卡尺等。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计与分组

饲养3 d后，挑选体质量基本一致的幼龄和成年小鼠各12只，随机分为2组，每组6只。其中一组为超排处理组，用于激素处理；另一组为对照组。具体设计如表1 所示。

1.3.2 超数排卵

将4 组小鼠分笼饲养，做好标记。参照文献^［11］将处理组于第1 天 16∶00 腹腔注射 PMSG 7.5 IU，48 h后腹腔注射 hCG 5.0 IU 以实现超数排卵处理，具体操作见图1。同时在相应的时间点给对照组小鼠腹腔注射相同剂量的生理盐水。

1.3.3 石蜡切片的制作及HE染色

1.3.3.1 组织固定

hCG 注射3 d后将所有小鼠断颈法处死。解剖并分离出小鼠的生殖器官。用游标卡尺测量子宫角长、子宫角外径宽、子宫体长及子宫体外径宽；后立即将组织置于4% 多聚甲醛溶液内固定。

1.3.3.2 脱水、透明、包埋

将组织从固定液中取出，修片后置于微水流下冲洗12 h。后置于不同浓度酒精梯度内脱水，即依次置于75%、85%、90%、95%、100%、100%酒精或乙醇中45 min。随后二甲苯透明，最后置于石蜡中浸蜡、包埋。

1.3.3.3 切片、染色、镜检

将包埋好的蜡块固定于切片机上，设置切片机厚度为5 um。用毛笔将切下的薄片投入盛有25 ℃温水的摊片机中展片，后用防脱载玻片捞片，最后置于45 ℃的烘片机上烘干。

采用HE 染色法染色。具体先将组织投入二甲苯脱蜡，后经梯度酒精下行至蒸馏水。依次经过苏木精染色、分化、伊红染色；脱水透明后用中性树胶封片。 荧光扫描显微镜（P250 Flash，丹吉尔）扫描，或普通光学显微镜拍照。

1.3.4 电镜切片的制作

1.3.4.1 组织固定

hCG 注射3 d后将小鼠断颈法处死。解剖并分离出小鼠卵巢，立即将组织先置于3% 戊二醛预固定，后置于1% 四氧化锇再固定。

1.3.4.2 脱水、包埋

首先使用丙酮逐级脱水，浓度梯度依次为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%；其中100% 丙酮脱水3次。随后使用脱水剂和Epon812包埋剂混合物进行渗透，比例依次分别为3∶1、1∶1、1∶3，最后使用Epon812包埋。

1.3.4.3 切片、染色、镜检

采用超薄切片机（UC7rt，莱卡）切片，厚度60~90 nm，展片后捞至铜网。先用醋酸铀染色10~15 min，再用柠檬酸铅染色1~2 min，室温下进行。

采用透射电镜（JEM-1400FLASH，JEOL）对铜网进行图像采集，每张铜网先置于6000倍下观察，选择要观察的区域采集图片，后增加倍数观察。

1.4 数据处理与分析

卵泡数及黄体数目由连续切片计数求得平均值，即每隔5 张取1张切片，连续取15 张切片。使用游标卡尺测量子宫角和子宫体长、宽，其中子宫角宽分别测量前段、中段和后段3部分，求均值。采用CaseViewer 软件（2.3.0版）测量卵泡面积、卵泡直径（长径和短径）、卵泡膜厚度、黄体面积、黄体直径、子宫角面积、子宫角直径（长径和短径）、子宫内膜面积、子宫腔面积、纵肌层厚度、环肌层厚度等；其中直径为长径和短径的几何平均数。采用GraphPad Prism 8 和SPSS 18.0 软件对所有数据进行两因素方差分析（Two-way ANOVAs），并进行多重比较；黄体面积、直径等数据分析时，由于幼鼠对照组没有黄体存在，因此数据分析时做独立样本t检验。最后用GraphPad Prism 8做图。每个试验6 个重复，数据以\overline{x}±s方式表示；P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 卵巢组织形态学结构

成年小鼠卵巢外表被覆一层OSE 细胞，即卵巢表面上皮细胞（ovarian surface epithelium，OSE），能够周期性地在卵巢排卵后自我修复。如图2 所示，在黄体及成熟卵泡外表层，其最外层细胞形态呈“纺锤梭形”，扁平排列；无卵泡凸起的卵巢表面OSE 细胞呈“鹅卵石形”，体积大，核明显，立方状均匀排列。表明卵巢不同部位的表面细胞类型不同，OSE 细胞“上皮-间质转化”的生物学特性能够周期性地维持卵巢排卵后的修复。

图3为成年小鼠排卵后卵巢剖面图，基质由结缔组织所组成。皮质部在外，内含不同发育阶段的卵泡、黄体、血管、淋巴管等；髓质部在内，含淋巴和血管。根据卵泡腔的大小、颗粒细胞形态和数量、卵泡膜及透明带的出现等因素，人为将卵泡分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡，其中三级卵泡和成熟卵泡统称为有腔卵泡。排卵后卵泡内膜毛细血管破裂，颗粒细胞和卵泡膜细胞增生，形成黄体；在这一过程中，膜黄体细胞体积和形态变化不大，颗粒黄体细胞体积较卵泡期颗粒细胞增大，细胞质面积增多，细胞排列松散。

2.2 超排后卵巢中卵泡与黄体数量统计分析

幼鼠由于下丘脑-垂体-卵巢调控机制尚未发育完善，不具备排卵的条件，因此卵巢上没有黄体存在（图4-A）。幼鼠超排处理一段时间后卵巢中有黄体存在，黄体数量较成鼠超排组相比差异显著（P<0.05）（图4-A）；同时成年小鼠超排后黄体数量极显著高于成鼠对照组（P<0.01，图4-A），表明本次超排试验成功，超排效果较好。成鼠超排组的黄体面积极显著高于幼鼠超排（P<0.01），与成鼠对照组无显著差异（图4-B）。成鼠超排组的黄体直径极显著高于幼鼠超排组（P<0.01，图4-C）。黄体与卵巢总面积之比，成鼠超排组显著高于成鼠对照组，与幼鼠超排组无显著差异（图4-D）。

根据卵泡腔的出现，可将三级卵泡和成熟卵泡划分为有腔卵泡；原始卵泡至次级卵泡统称为无腔卵泡或腔前卵泡。从图5 中可以看出，有腔卵泡数量在成鼠对照组显著高于幼鼠对照组（P<0.05），无腔卵泡数量差异不显著。成鼠对照组有腔卵泡数极显著高于成鼠超排组（P<0.01），无腔卵泡数差异显著（P<0.05）；这在幼鼠中差异均不显著（P>0.05）。

2.3 颗粒黄体细胞和膜黄体细胞超微结构观察

取幼鼠超排组和成鼠超排组黄体组织制作电镜切片，观察颗粒黄体细胞和膜黄体细胞超微结构（图6）。颗粒黄体细胞位于黄体中央，呈多角形，细胞核形状不规则，染色质分布均匀，以常染色质为主，核仁明显；膜黄体细胞位于黄体周边，呈扁平状，相邻细胞之间有胶原纤维，细胞核内异染色质多位于核膜附近。2种细胞胞浆内均能观察到线粒体、粗面内质网等细胞器，还含有丰富脂滴和少量自噬体；然而与颗粒黄体细胞相比，膜黄体细胞胞浆内大部分线粒体已发生固缩，嵴变粗，膜密度增高。

幼鼠超排组中颗粒黄体细胞排列较松散，相邻细胞间有明显缝隙；相反成鼠超排组中颗粒黄体细胞排列紧密，部分粗面内质网已扩张呈囊状，还可见少量空泡。在膜黄体细胞中，幼鼠和成鼠超排组细胞超微结构未见明显差异。

2.4 超排后子宫形态及基本参数分析

小鼠为双子宫，即左右子宫角汇合至子宫体，形成2个独立的子宫腔，再向外形成子宫颈，整体呈“Y”型。超排处理后测量子宫角和子宫体的长和宽，结果如表图7所示。成鼠超排组子宫角长显著高于幼鼠超排组（P<0.05）；成鼠对照组子宫角宽极显著高于幼鼠对照组和成鼠超排组（P<0.01）；成鼠对照组子宫体长显著高于幼鼠对照组；成鼠对照组子宫体宽显著高于成鼠超排组（P<0.05），极显著高于成鼠对照组（P<0.01）。

从图8小鼠子宫切片图中观察到，成鼠子宫腔上皮较幼鼠发达，逐渐向子宫腔延伸，形成“树枝”样的分支，因而黏膜面积较幼鼠大；同时子宫腔上皮向内膜内陷，形成较多的子宫腺体，子宫整体内膜褶皱增多，褶皱间空隙增大，内膜变薄，面积减小，而且成鼠纵肌层褶皱较幼鼠明显。与对照组相比，成年小鼠超排组子宫固有层呈增厚趋势，子宫整体内膜褶皱不明显；以上区别在幼鼠中不是很明显。

进一步测量小鼠子宫角切片各参数，结果显示成鼠对照组子宫角面极显著高于成鼠超排组和幼鼠对照组（P<0.01，图9-A）；成鼠对照组子宫角直径极显著高于成鼠超排组和幼鼠对照组（P<0.01），幼鼠超排组极显著高于幼鼠对照组（P<0.01，图9-B）；幼鼠对照组内膜占比显著高于成鼠对照组（P<0.05，图9-C）；环肌层厚度，幼鼠超排组与幼鼠对照组差异极显著（P<0.01），成鼠超排组与幼鼠超排组差异极显著（P<0.01），成鼠对照组与幼鼠对照组差异极显著（P<0.01，图9-D）；成鼠对照组纵肌层厚度极显著高于幼鼠对照组（P<0.01）幼鼠超排组显著高于幼鼠对照组（P<0.05，图9-E）；成鼠对照组腺体个数极显著高于幼鼠对照组（P<0.01），成鼠超排组显著高于成鼠对照组（P<0.05，图9-F）。

3 讨论

促性腺激素作用于青春期前的家畜可以诱导幼畜卵泡发育、排卵，以此获得更多的卵子用于胚胎体外生产；同时可以实现家畜早期选择，提高遗传进展，在畜牧业中具有非常重要的应用价值。然而幼畜超排随之产生的胚胎发育潜能低^［12-13］，限制青春期前动物卵母细胞发育潜能的因素尚不完全清楚，有待进一步研究。本研究以模式动物小鼠为研究对象，利用电子显微镜和扫描显微镜比较幼鼠和成鼠超排后的卵巢和子宫显微结构差异，以期探索影响幼畜卵母细胞发育的根本因素。

与成年动物相比，幼畜由于缺少完整的发情周期，对促性腺激素反应性较大，因而卵泡闭锁率呈较低的趋势^［6］。由此推测激素处理后的排卵数量会较成年超排动物有所增加。本研究中卵巢组织切片结果证实了这一假设，显示幼鼠超排组黄体数量显著高于成鼠超排组，表明激素作用下的幼鼠排卵数量较成鼠多；这与Morton等 ^［14］在羔羊中的研究结果一致。与此同时，幼鼠超排组的黄体面积和直径显著小于成鼠超排组，这与排卵卵泡的体积和类固醇激素的分泌有很大关系。肉牛和奶牛发情期卵泡的大小影响黄体分布，例如黄体直径和血浆中孕激素浓度，进而影响妊娠率^［15-16］。水牛排卵卵泡的大小与雌二醇浓度、黄体直径，黄体直径与孕激素浓度之间均呈显著正相关^［17］。由于卵子发生与卵泡发育是相辅相成的过程，激素处理能够增加卵泡的大小以增加卵母细胞大小，进而提高卵子质量^［14］。基于此，有理由推测幼鼠超排后的卵子数量虽多，但卵子质量欠佳，这与排卵卵泡的大小、类固醇激素的分泌均有关；这也成为限制幼畜胚胎体外生产的重要因素之一。这一推测在绵、山羊中得到证实^{［12-13，18］}。除此之外，幼畜卵母细胞中细胞质和细胞器的差异，例如囊泡和线粒体的差异也能够降低卵母细胞的发育能力^［12］。

脂滴作为一种特殊的细胞器，大量存在于黄体组织的颗粒黄体细胞和膜黄体细胞中^［19-20］。与脂肪组织和其他组织不同，黄体细胞中的脂滴富含胆固醇酯和甘油三酯^［20］，这些胆固醇酯被认为是类固醇激素合成的底物^［21］。与牛卵泡膜细胞和颗粒细胞相比，黄体细胞中的脂滴数量和大小剧增^［20］，类固醇合成蛋白（类固醇激素合成急性调节蛋白（Steroidogenic acute regulatory，STAR）、细胞色素 P450c11α（cytochrome P450 family 11，CYP11A1）和3β-羟化类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，HSD3B））的表达量也显著增加^［21］。本研究中小鼠颗粒黄体细胞和膜黄体细胞中均含有丰富的脂滴，推测与类固醇激素，特别是孕酮的合成至关重要。

动物的初情期代表生殖细胞成熟，性成熟代表生殖器官的成熟。青春期前的母畜，在激素诱导作用下产生卵子，但此时生殖器官尚未发育成熟，不能做种用。子宫作为雌性动物重要的生殖器官，不仅分泌激素调控卵巢活动，同时也是胚胎着床和发育的场所。研究幼年和成年小鼠超排处理后子宫的形态学变化，为了解雌性动物繁殖机能提供理论基础。子宫的组织切片结果显示，成鼠对照组腺体个数极显著高于幼畜对照组，成鼠超排组腺体个数显著高于幼鼠超排组，反映出青春期前的小鼠子宫有腺体存在，子宫腺的形成不依赖于短期促性腺激素的调节；随着小鼠生殖器官的逐步完善，腺体数量也逐渐增加。事实上，子宫腺是在小鼠出生后形成的，不依赖于卵巢和类固醇激素的作用形成；分娩后的雌性动物子宫腺能够再生^［22］。子宫腺是成功妊娠所必不可少的^［23］，腺体分泌物是维持子宫着床和胚胎发育的重要调节因子，特别是人类妊娠前3个月，为早期胚胎发育和着床提供重要的营养物质和生长因子^［24］。同时研究发现幼鼠超排组的子宫内膜较幼鼠对照组有明显增厚，环肌层和纵肌层厚度显著高于对照组，这在成鼠组间未表现出统计学差异；表明幼鼠子宫对激素的敏感性不同于成鼠，不仅在子宫腔上皮发生了变化，而且在子宫肌层也表现出了差异。以往研究子宫对激素的反应性，主要集中于子宫腔上皮，忽略了另一个值得注意的参数，即子宫基层厚度。青春期前大鼠长期食用染料木素（genistein，GEN）对子宫基层的影响较子宫腔上皮反应明显^［25］。雌二醇处理大鼠4 d能显著增加子宫肌厚度^［26］。总之，这些研究与我们的结果都表明激素或饮食处理能够影响子宫腔上皮和肌层的反应性。

有趣的是，成鼠对照组子宫角宽、子宫角面积、子宫角直径和子宫体宽4 个指标均显著高于成鼠超排组，表明超排激素对成鼠子宫角和子宫体面积具有抑制作用。相反，幼鼠超排组的子宫角直径显著高于幼鼠对照组，这与成鼠的结果不一致；同时环肌层厚度和纵肌层厚度在幼鼠超排和对照组中也表现出显著差异，而在成鼠中未见差异。以上结果表明成鼠和幼鼠子宫对激素的反应性不同，甚至起相反的作用，这一结果取决于所研究指标的不同。

4 结论

本论文研究了超排处理后成年鼠和幼鼠生殖器官的形态学差异，发现幼鼠超排后卵巢中黄体数量较成鼠多，相反黄体面积和直径较小；颗粒黄体细胞和膜黄体细胞中均可见丰富脂滴，成鼠超排组的颗粒黄体细胞排列较幼鼠超排组紧密；成鼠超排后子宫角宽、子宫角面积、子宫角直径和子宫体宽均低于成鼠对照组，相反幼鼠超排后子宫角直径、环肌层和纵肌层厚度均高于幼鼠对照组。表明幼鼠超排后产生的卵子数量较成鼠多，但质量可能欠佳；成鼠和幼鼠子宫对超排激素的反应性不同。

参考文献

[1] Tassell R， Chamley W A， Kennedy J P.Gonadotrophin levels and ovarian development in the neonatal ewe lamb［J］.Australian Journal of Biological Sciences，1978，31（3）：267.

[2] Erickson B H.Development and senescence of the postnatal bovine ovary［J］.Journal of Animal Science，1966，25（3）：800-805.

[3] Trounson A O， Willadsen S M， Moor R M.Reproductive function in prepubertal lambs： ovulation，embryo development and ovarian steroidogenesis［J］.Journal of Reproduction & Fertility，1977，49（1）：69.

[4] Armstrong D T， Holm P， Irvine B J，et al.Pregnancies and live birth from in vitro fertilization of calf oocytes collected by laparoscopic follicular aspiration［J］.Theriogenology，1992，38（4）：667.

[5] Ptak G， Loi P， Dattena M，et al.Offspring from one-month-old lambs： studies on the developmental capability of prepubertal oocytes［J］.Biology of Reproduction，1999，61（6）： 1568-74.

[6] 柴浩晨.利用JIVET技术培育多胎细毛羊效果评价［D］.杨凌：西北农林科技大学，2019.

[7] Morton K M， Catt S L， Maxwell W M，et al.Effects of lamb age，hormone stimulation and response to hormone stimulation on the yield and in vitro developmental competence of prepubertal lamb oocytes［J］.Reproduction Fertility and Development，2005，17（6）：593-601.

[8] Wang Q， Guo X， Yao D，et al.Insights into Transcriptomic Differences in Ovaries between Lambs and Adult Sheep after Superovulation Treatment［J］.Animals （Basel），2023，13（4）：665.

[9] Buzzell N， Blash S， Miner K，et al.128 Comparison of multiple maturation times on juvenile invitro embryo transfer （JIVET）-derived oocytes and embryo development in the goat［J］.Reproduction Fertility and Development，2021，33（2）：172.

[10] Daly J， Smith H， McGrice H A，et al.Towards Improving the Outcomes of Assisted Reproductive Technologies of Cattle and Sheep，with Particular Focus on Recipient Management［J］.Animals （Basel），2020，10（2）：293.

[11] 刘维俊，高珊，唐菲，等.小鼠超数排卵相关问题的探讨［J］.黑龙江动物繁殖，2011，19（1）：1-9.

[12] Reader K L， Cox N R， Stanton J A，et al.Mitochondria and vesicles differ between adult and prepubertal sheep oocytes during IVM［J］.Reproduction，Fertility，and Development，2015，27（3）：513-522.

[13] Leoni G G， Succu S， Satta V，et al.In vitro production and cryotolerance of prepubertal and adult goat blastocysts obtained from oocytes collected by laparoscopic oocyte-pick-up （LOPU） after FSH treatment［J］.Reproduction，Fertility，and Development，2009，21（7）：901-908.

[14] Morton K M， Catt S L， Maxwell W M，et al.Effects of lamb age，hormone stimulation and response to hormone stimulation on the yield and in vitro developmental competence of prepubertal lamb oocytes［J］.Reproduction，Fertility，and Development，2005，17（6）：593-601.

[15] Busch D C， Atkins J A， Bader J F，et al.Effect of ovulatory follicle size and expression of estrus on progesterone secretion in beef cows［J］.Journal of Animal Science，2008，86（3）：553-563.

[16] Vasconcelos J L， Sartori R， Oliveira H N，et al.Reduction in size of the ovulatory follicle reduces subsequent luteal size and pregnancy rate［J］.Theriogenology，2001，56（2）：307-314.

[17] Pandey A K， Ghuman S P S， Dhaliwal G S，et al.Effects of preovulatory follicle size on estradiol concentrations，corpus luteum diameter，progesterone concentrations and subsequent pregnancy rate in buffalo cows （Bubalus bubalis）［J］.Theriogenology，2018，107：57-62.

[18] Leoni G G， Bebbere D， Succu S，et al.Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes［J］.Molecular Reproduction and Development，2007，74（2）：249-57.

[19] Khanthusaeng V， Thammasiri J， Bass C S，et al.Lipid droplets in cultured luteal cells in non-pregnant sheep fed different planes of nutrition［J］.Acta Histochemica，2016，118（6）：553-559.

[20] Talbott H A， Plewes M R， Krause C，et al.Formation and characterization of lipid droplets of the bovine corpus luteum［J］.Scientific Reports，2020，10（1）：11287.

[21] Plewes M R， Krause C， Talbott H A，et al.Trafficking of cholesterol from lipid droplets to mitochondria in bovine luteal cells： Acute control of progesterone synthesis［J］.FASEB Journal，2020，34（8）：10731-10750.

[22] Stewart C A， Fisher S J， Wang Y，et al.Uterine gland formation in mice is a continuous process，requiring the ovary after puberty，but not after parturition［J］.Biology of Reproduction，2011，85（5）：954-964.

[23] Ni N， Jalufka F L， Fang X，et al.Role of EZH2 in Uterine Gland Development［J］.International Journal of Molecular Sciences，2022，23（24）：15665.

[24] Burton G J， Scioscia M， Rademacher T W.Endometrial secretions： creating a stimulatory microenvironment within the human early placenta and implications for the aetiopathogenesis of preeclampsia［J］.Journal of Reproductive Immunology，2011，89（2）：118-125.

[25] Möller F J， Ledwig C， Zierau O，et al.The rat prepubertal uterine myometrium and not the luminal epithelium is predominantly affected by a chronic dietary genistein exposure［J］.Archives of Toxicology，2012，86（12）：1899-1910.

[26] Papaconstantinou A D， Umbreit T H， Fisher B R，et al.Bisphenol A-induced increase in uterine weight and alterations in uterine morphology in ovariectomized B6C3F1 mice： role of the estrogen receptor［J］.Toxicological Sciences，2000，56（2）：332-339.

基金资助

国家自然科学基金项目(31960664)

甘肃农业大学学科团队项目(GAU-XKTD-2022-21)

甘肃省自然科学基金项目(21JR7RA809)

甘肃农业大学人才专项(2017RCZX-17)